Refine
Document Type
- Article (2)
- Doctoral Thesis (1)
Has Fulltext
- yes (3)
Is part of the Bibliography
- no (3)
Keywords
- - (2)
- Aktin (1)
- Aktinzytoskelett (1)
- CKD (1)
- CKD—chronic kidney disease (1)
- Morphologie (1)
- Niere (1)
- Palladin (1)
- Podozyt (1)
- biomarker (1)
Institute
Publisher
- Frontiers Media S.A. (1)
- Wiley (1)
Für eine intakte Filtration des Blutes sind hochspezialisierte Epithelzellen in den Glomeruli der Nieren, die Podozyten, essentiell. Der Verlust oder die Schädigung dieser postmitotischen Epithelzellen bzw. morphologische Veränderungen der komplex geformten Fortsätze dieser Zellen sind die häufigsten Ursachen für den Verlust der Filtrationsfähigkeit der Nieren. Diese besondere 3D-Morphologie der Podozyten hängt entscheidend vom Aktinzytoskelett und von Aktin-bindenden Proteinen ab. Aus der Literatur weiß man, dass das Aktin-bindende Protein Palladin einen entscheidenden Einfluss auf die Nukleation bzw. Polymerisation von Aktinfilamenten ausübt und dass Palladin sowohl die Morphologie als auch die Dynamik von Zellen bestimmt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von Palladin hinsichtlich der Podozytenmorphologie und -funktion in vitro und in vivo erstmals untersucht.
Mittels in vitro Experimenten an kultivierten Podozyten der Maus konnte gezeigt werden, dass ein Knockdown von Palladin zu einer deutlichen Abnahme der Aktinfilamente und kleineren Fokalkontakte führt. Interessanterweise hatte dies aber keinen Einfluss auf die Adhäsionfähigkeit der Podozyten, sogar unter mechanischer Bean¬spruchung. Ferner konnte gezeigt werden, dass Palladin einen entscheidenden Einfluss auf die Expression anderer essentieller Aktin-assoziierter Proteine, wie Synaptopodin und α-Aktinin-4, aufweist.
Dass Palladin eine wichtige Rolle bei der Bildung und Stabilität von Aktinfilamenten spielt, konnte durch die Inkubation von kultivierten Palladin Knockdown-Podozyten mit verschiedenen Inhibitoren der Aktin-Polymerisation gezeigt werden. Die quantitative Auswertung mit Hilfe der Software F_Seg zeigte, dass Palladin Knockdown-Podozyten nach der Inkubation deutlich weniger Aktinfilamente und mehr Aktin-Cluster im Vergleich zu den Kontrollen aufweisen. Der Einsatz eines Migrations-Assays zeigte zudem, dass kultivierte Palladin Knockdown-Podozyten schneller migrieren und vermehrt dynamische Strukturen wie Lamellipodien und sogenannte Ring-Like-Structures (RiLiS) ausbilden.
Um den Einfluss von Palladin auf Podozyten in vivo zu untersuchen, wurden Mäuse generiert, bei denen Palladin spezifisch in den Podozyten ausgeknockt ist. Analysen der Glomeruli-Morphologie dieser Tiere mit Hilfe der Immunfluoreszenz-, Superresolution- und Elektronenmikroskopie (Raster- und Transmissionsmikros-kopie) zeigten eindeutig, dass die glomerulären Kapillaren stark erweitert waren und sich ein stark vergrößerter sub-podozytärer Raum ausgebildet hatte. Ferner waren die für die Filtration des Blutes maßgeblichen Fortsätze der Podozyten stark verbreitert und die Expression des essentiellen Schlitzmembranproteins Nephrin nach dem Knockout von Palladin signifikant reduziert.
Durch den Einsatz eines nephrotoxischen Serums wurde eine Glomerulonephritis induziert, die bei Podozyten-spezifischen Palladin-Knockout Mäusen zu einer stärkeren Schädigung der Glomeruli im Vergleich zu den Kontrolltieren führte. Dies deutet auf eine essentielle Rolle von Palladin für die Morphologie und Funktion der Filtrationsbarriere hin.
Des Weiteren konnte anhand von Nierenbiopsien nachgewiesen werden, dass die Palladin-Expression bei Patienten, die an einer fokal segmentalen Glomerulosklerose bzw. an der diabetischen Nephropathie erkrankt waren, im Vergleich zu den Kontrollnieren deutlich verringert ist.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass Palladin sowohl in vitro als auch in vivo einen entscheidenden Einfluss auf das Aktin-zytoskelett der Podozyten und somit auf die Funktion dieser hochspezialisierten Epithelzelle hat.
Chronic kidney disease (CKD) is a major public health burden affecting more than 500 million people worldwide. Podocytopathies are the main cause for the majority of CKD cases due to pathogenic morphological as well as molecular biological alterations of postmitotic podocytes. Podocyte de-differentiation is associated with foot process effacement subsequently leading to proteinuria. Since currently no curative drugs are available, high throughput screening methods using a small number of animals are a promising and essential tool to identify potential drugs against CKD in the near future. Our study presents the implementation of the already established mouse GlomAssay as a semi-automated high-throughput screening method—shGlomAssay—allowing the analysis of several hundreds of FDA-verified compounds in combination with downstream pathway analysis like transcriptomic and proteomic analyses from the same samples, using a small number of animals. In an initial prescreening we have identified vitamin D3 and its analog calcipotriol to be protective on podocytes. Furthermore, by using RT-qPCR, Western blot, and RNA sequencing, we found that mRNA and protein expression of nephrin, the vitamin D receptor and specific podocyte markers were significantly up-regulated due to vitamin D3- and calcipotriol-treatment. In contrast, kidney injury markers were significantly down-regulated. Additionally, we found that vitamin D3 and calcipotriol have had neither influence on the expression of the miR-21 and miR-30a nor on miR-125a/b, a miRNA described to regulate the vitamin D receptor. In summary, we advanced the established mouse GlomAssay to a semi-automated high-throughput assay and combined it with downstream analysis techniques by using only a minimum number of animals. Hereby, we identified the vitamin D signaling pathway as podocyte protective and to be counteracting their de-differentiation.