Refine
Document Type
- Article (2)
- Doctoral Thesis (1)
Has Fulltext
- yes (3)
Is part of the Bibliography
- no (3)
Keywords
- Saccharomyces cerevisiae (2)
- Activator-binding domain (1)
- Bdf1 (1)
- Coactivator (1)
- Corepressor (1)
- Cyc8 (1)
- Gene repression (1)
- Interaction specificity (1)
- Repressor (1)
- Sin3 (1)
Publisher
- Springer Nature (2)
Zur Untersuchung molekularer Prozesse sind die Wechselwirkungen der beteiligten Faktoren von zentraler Bedeutung, was besonders für die präzise Steuerung der eukaryotischen Genregulation zutrifft, die im Mittelpunkt dieser Arbeit steht. Die Transkription wird durch den Zusammenbau des Präinitiationskomplexes (PIC) am Promotor der Zielgene initiiert. Neben der RNA-Polymerase II, dem Mediatorkomplex und mehreren generellen Transkriptionsfaktoren sind daran Aktivatorproteine beteiligt, welche an UAS-Elemente (upstream activation site) im Promotor binden. Daneben können aber auch Repressoren an URS-Elemente (upstream repression site) binden oder mit Promotor- gebundenen Aktivatoren interagieren und durch Rekrutierung sog. Corepressoren (z. B. Sin3, Cyc8 und Tup1) die Transkription hemmen. Diese Corepressoren können dann über assoziierte Histon- deacetylasen (z. B. Rpd3) die Chromatinstruktur im Promotorbereich spezifischer Gene verdichten und damit eine Bindung der Transkriptionsmaschinerie verhindern. In der Regel führt dies zu einer reduzierten Expression des jeweiligen Gens.
Untersuchungen zu den Wechselwirkungen zwischen genspezifischen Repressoren und pleiotropen Corepressoren haben in der Vergangenheit bereits zur Identifizierung einzelner Sequenzmotive und individueller Strukturen geführt. Um dieses Netzwerk zu ergänzen, wurden in dieser Arbeit zahlreiche Repressor-Corepressor-Interaktionen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae in vitro und in vivo charakterisiert und durch Verkürzung der interagierenden Proteine (Dal80, Mot3, Sko1, Ure2, Xbp1 und Yox1) hierfür relevante Aminosäuresequenzen ermittelt. Durch systematische Vergleiche solcher Repressorsequenzen konnten Varianten eines hydrophob-amphipathischen Konsensusmotivs identifiziert und z. T. durch gerichtete Mutagenese als funktionell wichtig nachgewiesen werden. Sekundärstrukturvorhersagen zeigten oft die Beteiligung α-helikaler, aber auch β-Faltblatt- oder ungeordneter Strukturen. Diese strukturelle Varianz lässt die Vermutung zu, dass es sich bei solchen Corepressor-Interaktionsdomänen (CID) um IDRs (intrinsically disorderd regions) handeln könnte, die erst durch Kontaktherstellung zum Corepressor eine definierte Konformation annehmen.
Ein in dieser Arbeit intensiv untersuchter Repressor war Gal80, der bekanntermaßen das GAL-System der Hefe solange abschaltet, bis Galactose als induzierender Zucker verfügbar ist. Man unterscheidet hierbei drei Zustände: Die Glucoserepression beschreibt das Abschalten der GAL-Gene durch den Repressor Mig1 bei Glucoseverfügbarkeit. Bei Glucosemangel und Verfügbarkeit einer alternativen Kohlenstoffquelle (z. B. Lactat oder Ethanol) wird der Aktivator Gal4 synthetisiert und bindet an UASGAL- Motive in Promotoren der GAL-Gene. Unter diesen Derepressionsbedingungen wird die Transkriptionsaktivierungsdomäne von Gal4 noch durch den Gal80-Repressor maskiert. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Gal80 zusätzlich in der Lage ist, den Corepressorkomplex Cyc8/Tup1 zu rekrutieren und die Transkription der Strukturgene dadurch zu reprimieren. Chromatinimmunopräzi- pitationsstudien belegten die Gal80-abhängige Präsenz der Corepressoren Cyc8 und Tup1 am GAL1 Promotor. Außerdem stellte sich bei der Charakterisierung von cyc8 und tup1 Mutantenstämmen heraus, dass Corepressoren durchaus auch aktivierende Wirkungen entfalten können. So fiel die Expression eines GAL1-lacZ Reportergens in einer cyc8 Nullmutante unter allen getesteten Bedin- gungen geringer aus als im Wildtyp. Die duale Wirkung solcher Transkriptionsfaktoren wurde in der Vergangenheit immer wieder beobachtet und steht auch im Einklang mit den Befunden dieser Arbeit.
Transcriptional corepressors Sin3, Cyc8 and Tup1 are important for downregulation of gene expression by recruiting various histone deacetylases once they gain access to defined genomic locations by interaction with pathway-specific repressor proteins. In this work we systematically investigated whether 17 yeast repressor proteins (Cti6, Dal80, Fkh1, Gal80, Mig1, Mot3, Nrg1, Opi1, Rdr1, Rox1, Sko1, Ume6, Ure2, Xbp1, Yhp1, Yox1 and Whi5) representing several unrelated regulatory pathways are able to bind to Sin3, Cyc8 and Tup1. Our results show that paired amphipathic helices 1 and 2 (PAH1 and PAH2) of Sin3 are functionally redundant for some regulatory pathways. WD40 domains of Tup1 proved to be sufficient for interaction with repressor proteins. Using length variants of selected repressors, we mapped corepressor interaction domains (CIDs) in vitro and assayed gene repression in vivo. Systematic comparison of CID minimal sequences allowed us to define several related positional patterns of hydrophobic amino acids some of which could be confirmed as functionally supported by site-directed mutagenesis. Although structural predictions indicated that certain CIDs may be α-helical, most repression domains appear to be randomly structured and must be considered as intrinsically disordered regions (IDR) adopting a defined conformation only by interaction with a corepressor.
Binding of general transcription factors TFIID and TFIIA to basal promoters is rate-limiting for transcriptional initiation of eukaryotic protein-coding genes. Consequently, activator proteins interacting with subunits of TFIID and/or TFIIA can drastically increase the rate of initiation events. Yeast transcriptional activator Ino2 interacts with several Taf subunits of TFIID, among them the multifunctional Taf1 protein. In contrast to mammalian Taf1, yeast Taf1 lacks bromodomains which are instead encoded by separate proteins Bdf1 and Bdf2. In this work, we show that Bdf1 not only binds to acetylated histone H4 but can also be recruited by Ino2 and unrelated activators such as Gal4, Rap1, Leu3 and Flo8. An activator-binding domain was mapped in the N-terminus of Bdf1. Subunits Toa1 and Toa2 of yeast TFIIA directly contact sequences of basal promoters and TFIID subunit TBP but may also mediate the influence of activators. Indeed, Ino2 efficiently binds to two separate structural domains of Toa1, specifically with its N-terminal four-helix bundle structure required for dimerization with Toa2 and its C-terminal β-barrel domain contacting TBP and sequences of the TATA element. These findings complete the functional analysis of yeast general transcription factors Bdf1 and Toa1 and identify them as targets of activator proteins.