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Der Bedarf an Blutprodukten ist in den letzten Jahren gestiegen, während der Kreis der möglichen Blutspender bei alternder Bevölkerung abgenommen hat und weiter abnehmen wird. Blutspende-Einrichtungen betreiben viel Aufwand, Blutspender zu gewinnen und als Dauerspender zu binden. Frühere Studien zeigten, dass ein Drittel der Dauerspender ein positives „Well-being“ nach der Spende erfahren und dies als Grund für regelmäßige Blutspenden angeben. In dieser Studie wurde ntersucht, ob ein „Well-being“ auch bereits bei Erstspender ausgeprägt ist und ob dies einen Einfluss auf das Rückkehrverhalten von Erstspendern hat. Zusätzlich sollte gezeigt werden, dass die Studie als Intervention einen Einfluss auf das Rückkehrverhalten bei Erstspendern hat. Über drei aufeinander folgende Monate wurden 235 Erstspender in die Studie eingeschlossen und entweder in die Fragebogengruppe oder in die Kontrollgruppe randomisiert. Bei allen Studienteilnehmern wurde zwölf Monate nach der initialen Spende deren Rückkehrverhalten ausgewertet. Die Teilnehmer der Fragebogengruppe sollten zusätzlich zu sieben verschiedenen Zeitpunkten, verteilt über acht Wochen, den „Multidimensionalen Befindlichkeitsfragebogen“ ausfüllen. An Hand der Ergebnisse des MDBF sollte der Verlauf des „Well-being“ aufgezeigt werden. Folgende Ergebnisse wurden erhoben: Erstspender scheinen keine größeren Veränderungen des „Well-beings“ nach ihrer ersten Blutspende zu erfahren. Des Weiteren beeinflusste das „Well-being“ nicht das Rückkehrverhalten der Erstspender. Die durchgeführten Interventionen führten zu einer erhöhten Wiederkehrrate der männlichen Erstspender, nicht jedoch der weiblichen Erstspender. Um eine praktikable Schlussfolgerung aus den Ergebnissen dieser Studie ziehen zu können, sollten zukünftige Studien den hier in der Wiederkehrrate aufgetretenen Geschlechterunterschied spezifischer untersuchen. Interessant wäre vor allem, welche der durchgeführten Interventionen oder eine Kombination aus diesen zu der gesteigerten Wiederkehrrate männlicher Erstspender geführt hat. Mit Hilfe weiterführender Ergebnisse wäre es dann möglich, gezielt Interventionen zu betreiben, die effizient die Spendefrequenz der Blutspender erhöht.
Therapeutische Antikörper können unerwartete Wirkungen verursachen, wenn das Zielantigen nicht nur auf den Zielzellen exprimiert wird. Ein gegen das CD38-Antigen gerichteter Antikörper, Daratumumab (DARA), wurde für die Behandlung des multiplen Myeloms entwickelt. Allerdings beeinträchtigt dieser Antikörper erheblich die Verträglichkeitsuntersuchungen zwischen Blutkonserve und Patientenplasma vor der Transfusion von Erythrozytenkonzentraten.
CD38 wird auch auf Erythrozyten (RBCs) exprimiert. Durch die Bindung von DARA an die Spendererythrozyten wird im indirekten Antihumanglobulintest (IAT) eine in vitro Unverträglichkeit mit allen Testerythrozyten angezeigt. Dies wird dadurch verursacht, dass das erforderliche Antihumanglubulin (AHG) humanes IgG bindet, unabhängig davon, welches Zielantigen dieser Antikörper hat. Infolgedessen können Agglutinationen durch transfusionsrelevante Antikörper im Patientenplasma von DARA-induzieretn Agglutinationen nicht unterschieden werden, wodurch das Risiko für akute hämolytische Transfusionsreaktionen steigt.
Daraus ergab sich die Fragestellung für meine Arbeit – eine Modifikation für den IAT zu finden, der diese Interferenz auflöst. Ich habe zwei neue Strategien verfolgt: i) die Adsorption von DARA aus dem Patientenplasma mit CD38-exprimierenden peripheren Blutzellen, ii) die Blockung der DARA-Bindungsstelle auf Erythrozyten, ohne dass die Bindung von transfusionsrelevanten erythrozytären Antikörpern behindert wird.
Für den ersten Ansatz konnte ich PBMCs als die Zellen identifizieren, die die höchste CD38 Expression zeigten. Leider konnte die Inkubation von DARA-gespiktem Plasma selbst nach mehreren Adsorptionsschritten die Interferenz im IAT nicht vollständig beseitigen. Auch die Durchführung der Methode erwies sich als nicht praktikabel für ein Routine-Diagnostiklabor. Für den zweiten Ansatz habe ich mit Hilfe von Pepsin F(ab‘)2 Fragmente von DARA hergestellt um damit die DARA-Bindungsstelle auf den Erythrozyten zu blockieren, damit das AHG nur an gebundene transfusionsrelevante Antikörper bindet. Die Zugabe von DARA F(ab´)2 Fragmenten zu den Testerythrozyten konnte die DARA-induzierten Agglutinationen im IAT verhindern und im Plasma vorhandene erythrozytäre Alloantikörper sichtbar und differenzierbar machen. Weiterhin konnte ich nachweisen, dass die Zugabe von DARA (Fab´)2 Fragmenten nicht die Sensitivität der Teste im Gelzentrifugationstest und im Capture® beeinträchtigt. Experimente mit Plasma von Myelom-Patienten vor und nach der DARA-Infusion bestätigten die Ergebnisse. Die Verwendung von F(ab‘)2 Fragmenten ist ein vielversprechendes Verfahren, um Interferenzen von therapeutischen Antikörpern im IAT der prätransfusionellen Diagnostik aufzulösen - nicht nur für Daratumumab.
Sowohl die Lagerung von therapeutischem Plasma nach dem Auftauen als auch die Pathogenreduktion mit MB/Rotlicht beeinflussen die pro- und antikoagulatorische Kapazität. Diese Veränderungen können durch die Messung der Aktivität von Gerinnungsfaktoren und Inhibitoren sowie die Durchführung von Globaltests, einschließlich neuer Messmethoden wie ProC®-Global-Test und endogenes Thrombinbildungspotential, detektiert werden. Die Massenspektrometrie stellt eine sinnvolle Ergänzung dieser Funktionstests dar, um Effekte auf das Plasmaproteom zu untersuchen.
Diese Studie zeigt zwei Möglichkeiten auf, die Patientenversorgung mit therapeutischem Plasma zu optimieren. Erstens konnte gezeigt werden, dass die Flüssiglagerung von Plasma bei 2-6 °C über 7 Tage ohne größere Einbußen der Gerinnungsfaktorenaktivität, mit Ausnahme von FVIII, machbar ist. Damit kann die Etablierung einer Flüssigplasmabank gerechtfertigt werden. Es ist eine zügige Bereitstellung von therapeutischem Plasma im Notfall, dank Einsparung der Zeit für den Auftauprozess, möglich. Zweitens konnte gezeigt werden, dass therapeutisches Plasma bei Versorgungsengpässen vorzeitig aus der Quarantänelagerung gelöst und ergänzend mit MB/Rotlicht behandelt werden kann, um die gewohnte Sicherheit zu gewährleisten. Im Gegensatz dazu wird die Lagerung von therapeutischem Plasma bei Raumtemperatur oder von MB/Rotlicht behandeltem Plasma bei 2-6 °C über 7 Tage aufgrund der ausgeprägten Reduktion der Aktivität der Gerinnungsfaktoren und Inhibitoren nicht empfohlen.
Zur Etablierung einer Flüssigplasmabank wird vorgeschlagen, lediglich eine kleine Anzahl von Plasmakonserven (z. B. 4 Plasmakonserven jeder Blutgruppe à 250 mL) bei 2-6 °C über maximal 7 Tage bereitzuhalten, um im Blutungsnotfall eine unverzügliche Versorgung von Patienten zu ermöglichen. Patienten, die darüber hinaus Plasmakonserven benötigen, sollten im weiteren Verlauf mit frisch aufgetautem GFP versorgt werden. So wird eine möglichst hohe Aktivität der Gerinnungsfaktoren und Inhibitoren gewährleistet.
Es werden klinische Studien benötigt, um die in vitro beobachteten Veränderungen der Gerinnungsfaktoren in Plasmaprodukten in vivo zu untersuchen.
The biomechanical (Young's modulus, adhesion force, deformability) properties of platelets depend on the cytoskeleton and have an undisputed influence on physiological and pathological processes such as hemostasis and thrombosis. The alterations of these biomechanical properties can be used as label-free diagnostic markers in initiation or progressive diseases such as MYH9-inherited disease. Therefore, the focus of my thesis was to investigate the relationship between the changes in platelet cytoskeleton proteins and the resulting biomechanical properties using biophysical methods.
In the first chapter of my thesis I focused on my review of the biophysical methods that are most commonly used to assess and quantify the biomechanical properties of platelets. In this review, I provide an in-depth insight into the governing principles and instrumentation setup and discuss relevant examples applied to platelet mechanics. In addition, my review also summarizes the limitations of these biophysical methods and highlight latest improvements. The review covers the following techniques: micropipette aspiration, atomic force microscopy (AFM), scanning ion conductance microscopy (SICM), tensile force microscopy on hydrogel substrates, microcolumns, and deformable 3D substrates, and real-time deformability cytometry (RT-DC). This review is directed toward clinician scientists who are interested in exploring applications of single-cell based biophysical approaches in unraveling the role of platelet biomechanics in hemostasis and thrombosis research.
In the second chapter of my thesis, I present my research paper on the influence of commonly used ex vivo anticoagulants on the intrinsic biomechanical properties and functional parameters (e.g. activation profils) of human platelets. To comprehensively assess this, platelets obtained in different ex vivo anticoagulants such as ACD-A, Na-Citrate, K2-EDTA, Li-Heparin, and r-Hirudin were used, and their biomechanical properties were determined by real-time fluorescence and deformability cytometry (RT-FDC). Flow cytometry, and confocal laser scanning fluorescence microscopy were used to determine platelet function properties. K2-EDTA and Li-Heparin were found to affect platelet biomechanics by increasing actin polymerization of non-stimulated human platelets. This increased actin polymerization results in decreased platelet deformation. It is recommended that an ex vivo anticoagulant such as ACD-A, Na-Citrate, or r-Hirudin be chosen for the study of the cytoskeleton of human platelets and, if possible, that it not be exchanged, because comparability of results is not assured. Furthermore, I demonstrate the significance of choosing correct ex vivo anticoagulants in RT-FDC by showing that platelets from a healthy donor and a MYH9 patient with the E1841K point mutation differ in their deformation. This paper is the first comprehensive investigation at the single platelet level to establish the relevance of preanalytical standardization in platelet sample preparation for biomechanical studies.
The third chapter of my thesis is focused on the biomechanical analyses of platelets and thrombi from MYH9-related disease. Here I studied three Myh9 mouse lines with a point mutation in the Myh9 gene at positions 702, 1424, or 1841. Furthermore, two MYH9 patients (MYH9 p.D1424N, MYH9 p.E1841K) were examined. MYH9-related disease (MYH9-RD) presents with macrothrombocytopenia with a moderate bleeding tendency. It is caused by mutations in the MYH9 gene that lead to alteration of non-muscle myosin heavy chains type IIA (NMMHC IIA), resulting in disruption of the platelet cytoskeleton. Western blot analysis, flow cytometry, in vitro aggregometry, and transmission electron microscopy demonstrated that Myh9 point mutant mice have comparable primary function compared to the control group. The heterozygous point mutations in the Myh9 gene resulted in decreased platelet deformation (RT-FDC), decreased platelet adhesion to collagen (single platelet force spectroscopy-SPFS), and decreased platelet-platelet interaction forces (SPFS). Decreased platelet force (Micropost Arrays) results in softer thrombi (colloidal probe Spectroscopy), impaired clot retraction, and thus prolonged bleeding time. The R702C, D1424N, and E1841K mutations have a similar effect on platelet biomechanical functions, although the E1841K mutation had less impact on thrombus formation and stiffness. MYH9-RD patients have an increased risk of bleeding, and the antifibrinolytic drug tranexamic acid (TXA) is one way to control bleeding complications in these patients. It was shown that TXA treatment significantly reduced bleeding time in the three Myh9 mouse models, confirming that the enhanced bleeding phenotype due to decreased platelet forces in Myh9 mutant mice can be compensated by the addition of TXA.
With the biophysical methods and research results presented in my thesis, it is clear that it is essential to study the altered response of the platelet cytoskeleton by cytoskeletal mutations, biochemical, physical stimuli, or by pharmacological aspects. This will provide us with an opportunity to better understand the underlying mechanisms and thus contribute to better clinical treatment.
Zusätzlich zu ihrer Zielstellung humane Thrombozyten auf das Vorkommen von NAP1L1 zu untersuchen, liefert diese Arbeit Anhalt für die potenzielle Funktion diese „nukleären“ Proteins in diesem anukleären Zelltyp. Eine Enflussnahme von NAP1L1 auf den Transport und ggf. Import eines Schlüsselenzyms des mitochondrialen Stoffwechsels (DLAT) erscheint als ein möglicher Mechanismus für die Einflussnahme auf systemische entzündliche Prozesse durch NAP1L1.
Für humane Thrombozyten sind die beschriebenen Veränderungen von DLAT eine der ersten Hinweise auf eine aktive Regulation der intramitochondrialen Proteinausstattung in Reaktion auf die systemische Infektion mit bakteriellen und viralen Erregern. Bislang existierten in dieser Situation nur Daten, welche z.B. die direkte Beeinflussung von Plättchen durch Erreger, z.B. durch induzierte Degradation des anti-apoptotischen BcL-x208, beschreiben.
In der Zukunft wird es wichtig sein zu ergründen, welche funktionellen Konsequenzen aus einer Mehr- oder Minderexpression von NAP1L1 im Bezug auf die thrombozytäre Mitochondrienfunktion entstehen, im Weiteren welchen pathophysiologischen Stellenwert diese Änderungen besitzen und wie man diese dann therapeutisch beeinflussen kann.
Fest steht, dass die in der Einleitung aufgeworfene Frage, ob die im Rahmen einer akuten, systemischen Entzündungsreaktion beobachteten metabolischen Veränderungen eher Ausdruck einer aktiven Regulation als eines pathologischen Defektes sind, auch auf die humanen Thrombozyten übertragen werden muss.
Thrombozyten haben neben ihrer Funktion in der Hämostase eine wichtige Rolle in der Immunabwehr. Sie interagieren hierbei mit Komponenten des angeborenen und des adaptiven Immunsystems und sind in der Lage, direkte anti-mikrobielle Einflüsse zu vermitteln. Die Interaktion von Thrombozyten mit Gram-positiven Bakterien unterscheidet sich von jener mit Gram-negativen Erregern. Bei beiden Gruppen von Bakterien scheint die Aktivierung von Thrombozyten und Freisetzung anti-mikrobieller Peptiden aus den Granula ein wichtiger Bestandteil der direkten Pathogenabwehr durch Thrombozyten zu sein. Hierbei führt die Interaktion mit S. aureus direkt zu einer starken pathogen-induzierten Thrombozytenaktivierung, während bei Gram-negativen Organismen wie E. coli eine Verstärkung durch die Opsonierung mit PF4 und anti-PF4/H IgG notwendig scheint. Vermutlich ist die Bindung von PF4 und anti-PF4/H IgG an Gram-positive Bakterien von größerer Bedeutung für die Opsonierung für andere Immunzellen als für den direkten bakteriziden Effekt der Thrombozyten.
Der Gram-positive S. pneumoniae führt durch Funktionsstörung und Exposition von Phosphatidylserin zu einer Schädigung der Thrombozyten. Dieser schädigende Effekt auf Thrombozyten durch S. pneumoniae wird unter anderem durch Pneumolysin, ein porenbildendes Toxin der Pneumokokken, vermittelt. Dieses induziert bereits in geringen Konzentrationen die Porenbildung in der Thrombozytenmembran und führt zur Induktion von Apoptose.
In der Arbeit konnten die initialen Fragestellungen folgendermaßen beantwortet werden:
1.Thrombozyten können einen direkten schädigenden Effekt auf Gram-positive Bakterien vermitteln.
2.PF4 und anti-PF4/Polyanion IgG spielen in der direkten Thrombozyten-vermittelten Pathogenabwehr bei Gram-positiven Erregern, trotz der Bindung an Gram-positive Bakterien, eine untergeordnete Rolle. Sie verstärken weder die Thrombozyten-aktivierung noch den anti-bakteriellen Effekt.
3.Die Auswirkung der Co-Inkubation mit Bakterien auf die Thrombozyten ist heterogen und abhängig vom untersuchten Bakterienstamm. Es kommt zur Aktivierung der Thrombozyten durch S. aureus und zur Schädigung der Thrombozyten durch S. pneumoniae.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden zur Beantwortung der Forschungsfrage 1 Lagerungsversuche durchgeführt. Diese zeigten, dass bei einem Lagerungszeitraum von bis zu sieben Tagen die Intensität aller gefärbten Strukturen mit der Zeit abnahm. Die Abnahme der Intensität war bei den meisten angefärbten Strukturen bereits ab dem ersten Lagerungstag zu beobachten. Zudem zeigte sich, dass Thrombospondin nur mit EDTA-antikoaguliertem Blut darstellbar war. Mit Hilfe dieser Arbeit konnte aber nicht nur die Abnahme der Intensität über den Lagerungszeitraum nachgewiesen werden, sondern auch, dass es innerhalb des Lagerungszeitraum zu Veränderungen der Strukturverteilung der angefärbten Strukturen kam. Filamin A und NMMIIA lagen an Tag 0 fixiert und gefärbt noch diffus verteilt im Thrombozyten vor und stellten sich im Anschluss ab dem ersten Lagerungstag vermehrt als eine Ringstruktur dar. Veränderungen der Struktur über den Lagerungszeitraum fand sich ebenso bei ß1-Tubulin. Alle weiteren Strukturen blieben über den gelagerten Zeitraum unverändert.
Zusätzlich wurden im Rahmen dieser Arbeit Blutausstriche nach ihrer Intensität und Struktur beurteilt, die an Tag 0 fixiert wurden und im Anschluss fixiert bis Tag 7 gelagert wurden. Erst nach der fixierten Lagerung bis zu dem entsprechenden Lagerungstag wurden die Blutausstriche gefärbt. Bei dieser Methode, der an Tag 0 fixierten Blutausstriche, zeigte sich eine stärkere Intensität der angefärbten Strukturen, als wenn sie unfixiert gelagert wurden.
Zur Beantwortung der Forschungsfrage 2 wurde im zweiten Teil dieser Arbeit die Visualisierung der Signalkaskade mit Hilfe von phosphorylierten Kinasen und der Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Durch die Anfärbung der phosphorylierten Kinasen in der Fluoreszenzmikroskopie konnte keine ausreichende Sensitivität und Spezifität erreicht werden und wurde aus diesem Grund nicht weiterverfolgt. Der parallele Ansatz mit der Durchflusszytometrie zeigte hingegen erfolgreiche Ergebnisse. Mit Hilfe von Zeitreihen konnte der optimale Zeitpunkt der Inkubation mit den Induktoren vor der duchflusszytometrischen Untersuchung bestimmt werden. Dieser lag bei drei Minuten. Durch die Verwendung verschiedener Induktoren konnte eine Phosphorylierung der SRC-, SYK- und AKT1/2/3-Kinasen gezeigt werden. Bei der SRC-Kinase eigneten sich besonders TRAP-6, U46619 und Kollagen als potente Induktoren. Bei der SYK-Kinase waren es U46619, TRAP-6, Convulxin und ADP. Zusätzlich zeigte die SYK-Kinase in der Negativkontrolle die geringste Hintergrund-Phosphorylierung. Zur niedrigsten nachweisbaren Phosphorylierung kam es bei der AKT1/2/3-Kinase. Eine Induktion mit TRAP-6 zeigte dabei die für AKT1/2/3 stärkste Phosphorylierung. Durchflusszytometrisch war somit eine gute Darstellung der Phosphorylierung der verwendeten drei Kinasen durch kleinsten Blutmengen möglich.
Für die gezielten Inhibitionsversuche dieser Arbeit wurde unter anderem die Medikamentenfamilie der Sartane zur GPVI-Rezeptorinhibition verwendet. Es zeigte sich, dass besonders bei der Induktion mit U46619 und Verwendung eines Vertreters der Familie der Sartane bei allen drei Kinasen die Phosphorylierung der Kinase deutlich gesenkt werden konnte. Die Phosphorylierung lag durch die Inkubation (1 min) mit einem Sartan auf dem Niveau der Negativkontrolle. Bei Induktion mit Convulxin und Verwendung von Losartan steigerte sich hingegen die Phosphorylierung bei allen drei Kinasen. Bei durchflusszytometrischer Untersuchung von Patientenblut, bei in vivo-Einnahme von Telmisartan, konnte im Vergleich mit drei gesunden Spendern gezeigt werden, dass die Phosphorylierung der SRC-Kinase bei Convulxin und Kollagen deutlich reduziert ist. In der Aggregometrie nach Born konnte bei allen verwendeten Sartanen eine Reduktion der Thrombozytenaggregation nachgewiesen werden.
Die weiteren Versuche mit dem PAR4-Rezeptorblocker Vorapaxar, zeigte im Durchflusszytometer bei der AKT1/2/3-Kinase keine Reduktion. Stattdessen konnte hier in der höchsten verwendeten Konzentration, sogar eine Zunahme der Phosphorylierung beobachtet werden. In der parallel durchgeführten Aggregometrie nach Born zeigte sich hingegen eine komplette Hemmung der Thrombozytenaggregation.
Um festzustellen, ob Proben für die Untersuchungen mit dem Durchflusszytometer versendet werden können, wurden in einem letzten Schritt erneut Lagerungsversuche durchgeführt. Durch die verwendeten Lagerungszeiträume sollte die Dauer, die durch den Transport bei einer Zentralisierung zustande kommt, imitiert werden. In dem durchgeführten Untersuchungsansatz war eine Lagerung über den Tag 0 nicht möglich. Zu einem späteren Zeitpunkt waren nur noch wenige bis keine Thrombozyten nachweisbar.
Im Falle einer neuen, sich rasch ausbreitenden viralen Erkrankung empfiehlt die WHO die Verwendung von Blutplasma von bereits Genesenen (Rekonvaleszenten-plasma) zur ersten Therapie bevor Impfstoffe entwickelt werden können, da dieses Plasma bereits Immunglobuline gegen den Erreger enthält. In dieser zeitkritischen Situation kann die von der deutschen Richtlinie für Hämotherapie geforderte Quarantänelagerung für Plasmen für mindestens vier Monate nicht immer ein-gehalten werden. Eine Alternative zur Quarantänelagerung stellen Verfahren zur Pathogeninaktivierung des Plasmas dar. Es muss jedoch sichergestellt werden, dass die enthaltenen Immunglobuline durch die Pathogeninaktivierung nicht beeinträchtigt werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Pathogeninaktivierung von Plasma mittels Methylenblau-Behandlung keinen signifikanten Einfluss auf Immun-globuline M und G hat. Die Ergebnisse können die Sicherheit der Verwendung von Rekonvaleszentenplasma zu Beginn einer Ausbreitung einer viralen Erkrankung deutlich erhöhen.
Blutplasma muss generell blutgruppenkompatibel transfundiert werden, um Blutgruppeninkompatibilitäten durch enthaltene gegen die Blutgruppenantigene A und B gerichetete Antikörper (Isoagglutinine) zu vermeiden. Plasma von Spendern der Blutgruppe AB enthält keine Isoagglutinine und kann somit Patienten aller Blutgruppen transfundiert werden. Der Anteil der Spender in der mitteleuropäischen Bevölkerung mit Blutgruppe AB ist mit 4 % jedoch sehr gering. Daher besteht der Bedarf Isoagglutinine aus Plasma der Blutguppe A, B und 0 zu entfernen, um dieses „universell“ transfundierbar zu machen. Das so hergestellte Isoagglutinin-depletierte Plasma kann auch für Notfalltransfusionen bei Patienten mit unbekannter Blutgruppe angewendet werden. Kleinere Krankenhäuser können ihre Logistik effizienter gestalten und lediglich diese Art von Plasma bevorraten.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden ein geschlossenes Beutelsystem und ein Prozess entwickelt, welcher die Depletion von Isoagglutininen aus Plasma mit Mitteln ermöglicht, die in jeder transfusionsmedizinischen Einrichtung vorhanden sind. Es konnte gezeigt werden, dass die Qualität des Plasmas der des bereits zugelassenen humanen gefrorenen Frischplasmas entspricht. Durch Poolen im Herstellungs-prozess können mehrere Plasmen gleichzeitig bereitgestellt werden. Das Verfahren hat das Potenzial, die klinische Praxis der Plasmatherapie zu beeinflussen.
Für die Hemmung der plasmatischen Gerinnung kommen orale und parenterale Antikoagulantien in Betracht. Bei stationären Patienten spielt das parenteral verabreichte Heparin, vorkommend als höher- und niedermolekulares Heparin, die größte Rolle. Neben Blutungskomplikationen, kann Heparin auch die gefürchtete Nebenwirkung Heparin-induzierte Thrombozytopenie auslösen.
Aufgrund der Bildung von Immunkomplexen durch Bindung von Antikörpern an Komplexe aus PF4 und Heparin, kommt es zu einer Thrombozytenaggregation mit eventuell auftretenden Thromboembolien. Das Risiko für diese Entstehung erhöht sich mit steigender Kettenlänge des Heparins, mit einer zehnfach erhöhten Prävalenz bei UFH gegenüber LMWHs.
Das Protein PF4 ist ein tetrameres Protein aus der Familie der CXC-Chemokine und wird in den α-Granula der Thrombozyten gespeichert. Durch deren positive Ladung zeigt es eine hohe Affinität zu negativ geladenem Heparin, wodurch antigene Komplexe aufgrund der strukturellen Veränderung des PF4s formiert werden.
In dieser Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Heparine mit aufsteigender Kettenlänge auf die Struktur von PF4 getestet und untersucht, inwieweit ein Polysaccharid mit einem bestimmten Sulfatierungsgrad in Kombination mit einem Standardheparin die Antigen/Antikörper-Interaktion von PF4/Heparin-Antikörper verändern kann.
Hierfür kamen unterschiedliche Verfahren zum Einsatz. Hauptaugenmerk wurde auf den Zirkulardichroismus gelegt, mit deren Hilfe die Sekundärstruktur und Konformationsänderung von PF4 im Zusammenspiel mit den Heparinen und Polysacchariden untersucht werden kann. Für den Nachweis von antigenen PF4/Heparin-Komplexen wurde der Enzym-gekoppelte Immunologische Test ELISA und der Heparin-induzierte Plättchenakivierungstest (HIPA) angewendet.
Die durch die Standardheparine ausgelöste Änderung der Konfirmation von PF4 lässt sich durch die Zugabe des synthetisch hergestellten Polysaccharids 12mer-3, das 12 Sulfatgruppen hat, hemmen. Dies war nicht mit den anderen synthetischen 12mer-Polysacchariden möglich. Auch zeigte sich keine Interaktion von 12mer-3 auf die Wechselwirkung von PF4 mit 12mer-6, welche durch die geringere Anzahl an Sulfatgruppen des 12mer-3 zu interpretieren ist. Die Bindung von humanen anti-PF4/Heparin-Antikörpern wurde mit ELISA und dem Funktionstest HIPA untersucht. Hier wurden sieben menschliche Seren mit enthaltenen Anti-PF4/Heparin-IgG-Ak verwendet und nach Hinzugabe der synthetischen Polysaccharide die Ak-Bindung an den antigenen PF4/Heparin-Komplexen und die nachfolgende Thrombozytenaggregation getestet.
Das wichtigste Ergebnis dieser Arbeit ist, dass das Polysaccharid 12mer-3die Struktur von PF4 in PF4/Heparin-Komplexen verändert und dadurch die Bindung von PF4/Heparin-Antikörper reduziert. Durch eine gleichzeitige Gabe von Heparin zusammen mit dem Polysaccharid 12mer-3, könnte das Risiko der unerwünschten Arzneimittelwirkung Heparin-induzierte Thrombozytopenie reduziert werden.
Neben der klinischen Wichtigkeit des Ergebnisses, bietet die hier vorliegende Dissertation auch eine Reihe von Ansatzpunkten für weitere Projekte. Zu nennen wäre hier beispielsweise die Testung der Reaktionen von 12mer-3 in Wechselwirkung mit den Standardheparinen UFH, Reviparin und Enoxaparin und 12mer-3 in Kombination mit 12mer-6 im ELISA und im HIPA, um eine Kongruenz hinsichtlich der bereits durchgeführten CD-Messungen zu liefern. Auch wäre es in klinischen Studien interessant herauszufinden, ob die Expression des Antigens auf PF4/Heparin-Komplexe auch in vivo gehemmt werden könnte.
Weiterhin kann unser Ansatz zur Synthese von sichereren Wirkstoffen führen, die an PF4 binden.
Thrombozyten reagieren auf Infektionen, unter anderem auf die mit dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV). Dabei zeigt sich eine erhöhte Rate an kardiovaskulären und thrombotischen Ereignissen. Die medikamentöse Therapie hemmt unter anderem die reverse Transkriptase der HI-Viren. Allerdings wirken diese Arzneimittel auch auf die humanen Thrombozyten. Diese besitzen eine endogene reverse Transkriptase. Eine solche ist in den Blutplättchen in Form von Long Interspersed Nuclear Element 1 (LINE-1) Ribonukleinsäure (RNA) als Grundlage für die Translation vorhanden. Auch die entsprechenden Proteine sind als Open Reading Frame 1 (ORF1) und Open Reading Frame 2 (ORF2) - Proteine nachweisbar. Diese kodieren unter anderem für eine Endonuklease, Chaperone und reverse Transkriptase. Letztgenannte ist in den Blutplättchen auch aktiv. Folglich sind humane Thrombozyten in der Lage RNA in Desoxyribonukleinsäure (DNA) umzuschreiben. Dem Dogma der Molekularbiologie folgend, besitzen Zellen ohne Nucleus keine DNA. Auf Grund des Vorhandenseins einer endogenen reversen Transkriptase in humanen Thrombozyten konnte erstmals DNA in Form von Gewebsthromboplastin und Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator Rezeptor (uPAR) nachgewiesen werden.