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Vorhofflimmern ist die häufigste Herzrhythmusstörung des Menschen. Die Generierung neuen Wissens über Prozesse der Zellregulation und Zellkommunikation kann unser Verständnis über zugrundeliegende Pathomechanismen dieser Erkrankung erweitern und bei der Entwicklung neuer Therapiestrategien helfen. Diese Phosphoproteom-Analyse beschreibt Veränderungen des Phosphorylierungsstatus von Proteinen in HL-1 Kardiomyozyten in Abhängigkeit verschiedener Rapid Atrial Pacing (RAP) Stimulationsprotokolle. Um den Einfluss von Regenerationsphasen, wie es sie z. B. auch beim paroxysmalen Vorhofflimmern gibt, auf den Phosphorylierungsstatus von Proteinen zu untersuchen, wurden die Zellen nicht nur kontinuierlich, sondern auch in Intervallen RAP-stimuliert. Insgesamt konnten in dieser Arbeit 9626 Phosphorylierungen in 3463 Proteinen identifiziert werden, von denen 295 Phosphorylierungen in 261 Proteinen signifikant verändert waren. Stark veränderte Phosphorylierungen konnten z. B. in den Proteinen DOCK7 und MARK2 für kontinuierlich stimulierte HL-1 Zellen und OBSCN und JPH2 für Intervall-stimulierte HL-1 Zellen gefunden werden. Neben spezifisch regulierten Proteinphosphorylierungen konnten auch solche beschrieben werden, deren Regulation für kontinuierliches bzw. Intervall-RAP identisch waren (Overlap). Vertreter dieser Gruppe waren z. B. Phosphorylierungen der Proteine KCNH2 und ABLIM3. Eine Vielzahl beobachteter Unterschiede bezüglich der Richtung und Stärke der Regulation von Proteinphosphorylierungen zwischen kontinuierlich und Intervall- stimulierten HL-1 Zellen ist dabei ein deutliches Indiz für einen bestehenden Einfluss der Regenerationsphasen auf die Modulation zellulärer Signalwege. Bei der Zuordnung veränderter Protein-Phosphorylierungen zu definierten Signalwegen zeigte sich das Netrin-Signaling als signifikantes Beispiel für Signalwege, die sowohl bei kontinuierlich als auch bei Intervall-stimulierten HL-1 Zellen einer Modulation unterliegen. Veränderungen in der Regulation der Proteinphosphorylierung bzw. der Proteinexpression konnten dabei vor allem in einem bestimmten Teil des Signalweges identifiziert werden, an dem die Proteine Netrin, DCC-Rezeptor, NCK, RAC und ABLIM beteiligt sind.
Vorhofflimmern (VHF) ist die häufigste Herzrhythmusstörung im Erwachsenenalter. In den kommenden Jahren und Jahrzehnten werden die Prävalenz und Inzidenz von Vorhofflimmern weiter zunehmen. Die VHF-assoziierten Pathomechanismen sind nicht vollständig geklärt. Derzeitige Therapieansätze sind oft nur zeitlich begrenzt wirksam, mit starken Nebenwirkungen behaftet und können aktuelle Beschwerden der Patienten zwar eindämmen, ein Fortschreiten der Krankheit aber nicht aufhalten. Daher ist es notwendig, weitere Untersuchungen auf Ebene der Zellregulation und Zellkommunikation zu fördern, um das Wissen über Entwicklung, Progression und Reversibilität von VHF-assoziierten Remodeling-Prozessen zu erweitern und neue therapeutische Interventionspunkte zu identifizieren.
VHF-induzierte atriale Remodeling-Prozesse werden maßgeblich und zum Teil ursächlich durch reversible Veränderungen der Protein-Phosphorylierung verursacht. In vorherigen Arbeiten des Labors konnten bereits im Rahmen von Phosphoproteom-Analysen Proteine in HL-1 Zellen detektiert werden, die nach Rapid Pacing (RP) auffällig differentiell reguliert waren. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Analyse und Verifizierung dieser Proteine nach kontinuierlichem und Intervall-RP von HL-1 Zellen auf mRNA- und Proteinebene. Der Vergleich der im HL-1-Modell erhaltenen Daten mit denen, die aus atrialem Gewebe von Patienten in SR und VHF gewonnen wurden, soll Rückschlüsse auf klinisch und therapeutisch potenziell relevante Signalwege und Pathomechanismen bei VHF geben. Es stellte sich heraus, dass RP keinen Einfluss auf die mRNA-Expression von DDR2, OBSCN, SGK223, MARK2 und eingeschränkt auf JPH2 und GPX1 in HL-1 Zellen hatte. Lediglich nach Intervall-RP war die mRNA-Menge von JPH2 erhöht und von GPX1 reduziert. Sowohl nach kontinuierlichem als auch nach Intervall-RP war die Genexpression der Proteine SNIP1 und SBK2 stark reduziert. Gleichzeitig stellte sich eine ebenso stark reduzierte SBK2 Proteinexpression sowohl in den HL-1 Zellen als auch im humanen Vorhofgewebe bei VHF dar. In der immunhistochemischen Untersuchung atrialer Gewebeschnitte präsentierte sich SBK2 im Zytoplasma, entlang der Zellmembran und vesikelartig im perinukleären Raum der humanen Kardiomyozyten. RP und VHF hatten keinen Einfluss auf die Gen- und Proteinexpression von MARK2 in den HL-1 Zellen und im humanen Vorhofgewebe. In der Untersuchung der Protein-Phosphorylierung von MARK2 an Thr208 ergaben sich allerdings Diskrepanzen zwischen den murinen und humanen Zellen. Mithilfe der Immunfluoreszenz wurde in den humanen Kardiomyozyten für MARK2 eine regelmäßige Anordnung in longitudinaler Ausrichtung und zwischen den Z-Linien nachgewiesen. Eine VHF-abhängige durch Phosphorylierung vermittelte subzelluläre Translokation von MARK2 konnte ausgeschlossen werden. Diese RP-assoziierten Veränderungen im Phosphoproteom sind am atrialen Remodeling, bei der Erhöhung des oxidativen Stresses und der Aktivierung des TGF-β- und NF-κB-Signalwegs involviert. Des Weiteren wird ein Zusammenhang zwischen MARK2 und dem Wnt-Signalweg vermutet.
In weiterführenden Arbeiten sollten Untersuchungen der spezifischen Effekte von Protein-Phosphorylierungen und der Protein-Protein-Interaktionen erfolgen. Da zu den kardialen Funktionen von SBK2 keine Daten vorliegen, könnten mithilfe des Knock-outs von SBK2 (Knock-out Maus oder CRISPR-Cas9 Knock-out in HL-1 Zellen) grundlegende Aussagen zu dessen Rolle im gesunden Herzen oder bei VHF erhalten werden.
Der akute Myokardinfarkt auf Grundlage einer koronaren Herzerkrankung ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Besonders ältere Patienten leiden oft an mehreren kardiovaskulären Grunderkrankungen - so sind Vorhofflimmern und KHK häufige Komorbiditäten. Die pharmakologische Therapie von Vorhofflimmern bei bestehender KHK ist ein therapeutisches Problem. Dronedaron hat sich in zahlreichen klinischen Studien als wirksames Antiarrythmikum herausgestellt und zeigte zudem positive Effekte auf die Inzidenz und Sterblichkeit von akuten Myokardinfarkten (ATHENA-Studie). In verschiedenen Forschungsarbeiten konnte nachgewiesen werden, dass Dronedaron in der Frühphase nach einem akuten Myokardinfarkt eine Reduktion der Infarktgröße bewirken kann. Im Gegensatz dazu scheinen Patienten mit schwerer struktureller Herzerkrankung bezüglich ischämischer Ereignisse nicht von einer Dronedarontherapie zu profitieren (PALLAS-Studie).
In dieser Arbeit sollte unter Nutzung des Schweins als Modellorganismus geklärt werden, ob im Langzeitverlauf vier Wochen nach einem akuten Myokardinfarkt protektive Effekte Dronedarons auf die Infarktgröße und die kardiale Funktion nachgewiesen werden können. Desweiteren wurden mithilfe ventrikulärer Gen- und Proteinexpressionsanalysen Dronedaroneffekte in gesundem Myokard, Infarktgrenze und Infarktnarbe auf molekularbiologischem Level untersucht.
Für den experimentellen Myokardinfarkt wurde mithilfe eines Ballonkatheters der rechte Ramus interventricularis anterior distal des ersten Septalastes für 90 Minuten verschlossen. Nach 4-wöchiger Infarktheilung wurden die Herzen explantiert und Gewebsproben für die Expressionsanalysen entnommen. Die Größe der Infarktnarbe wurde an den formalinfixierten Herzen mithilfe der MRT-Bildgebung bestimmt. Genexpressionsprofile wurden mittels RNA-Microarray und anschließender Validierung mittels RT-qPCR, Proteinexpressionsprofile mittels 2D-DIGE-Analyse und anschließender massenspektrometrischer Proteinidentifizierung erstellt.
Die Infarktgröße wurde durch die Dronedarontherapie nicht signifikant beeinflusst (Kontrolle vs. Dronedaron: 10,1 % vs. 9,2 %, n.s.). Das Schlagvolumen der dronedaronbehandelten Tiere zeigte im Gegensatz zu den Kontrolltieren vier Wochen nach Infarzierung keine signifikante Reduktion. Enddiastolisches Volumen, Ejektionsfraktion sowie Serummarker zeigten keine Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen.
In den Expressionsanalysen konnten insbesondere in der Infarktgrenze Effekte der Dronedarontherapie beobachtet werden. Es kam zu einer Expressionssteigerung von TGFβ3, der TGFβ-Rezeptoren 1 und 2 sowie der TGFβ-bindenden Proteine LTBP1 und 2. Die vermehrte Aktivierung des TGFβ-Signalings zeigte sich auch in einer Expressionssteigerung matrizellulärer Proteine, darunter Thrombospondin 1 und 2, Periostin und Fibronektin, sowie diverser extrazellulärer Matrixproteine, v.a. Kollagen-Subtypen.
Die Aktivierung des TGFβ-Signalings sowie die Expressionssteigerung TGFβ-induzierter matrizellulärer Proteine in der Infarktgrenze begünstigen durch antiinflammatorische Effekte und Stimulation der Kollagensynthese die Infarktheilung sowie die Stabilisierung des Narbengewebes. Die Proteine Thrombospondin 1 und 2 verhindern zudem eine Expansion des Infarktes in gesunde Myokardareale. Desweiteren kann insbesondere Periostin die Kardiomyozytenproliferation im infarzierten Myokard stimulieren. So können das TGFβ-Signaling sowie matrizelluläre Proteine zu einer Verbesserung der kardialen Funktionalität nach akutem Myokardinfarkt beitragen. Es ist vorstellbar, dass Calcium-abhängige Mechanismen in Kardiomyofibroblasten die dronedaronabhängige gesteigerte Aktivierung des TGFβ-Signalings und als Folge der matrizellulären Proteine vermitteln.
Die Aufrechterhaltung des Schlagvolumens des linken Ventrikels durch die Dronedarontherapie vier Wochen nach einem Myokardinfarkt spricht für einen Erhalt der systolischen Kontraktionskraft des Herzens. Auch wenn keine signifikante Reduktion der Infarktgröße festgestellt werden konnte, deuten die gefundenen Ergebnisse auf eine protektive Wirkung von Dronedaron auf kardiale Funktionalität und die Infarktheilung bei ansonsten gesunden Patienten hin. Bei Patienten mit bereits strukturell vorgeschädigtem Herzen beispielsweise im Sinne einer schweren Herzinsuffizienz könnte die gefundene vermehrte Aktivierung des TGFβ-Signalings zu einer Verschlechterung der Prognose führen, was die Ergebnisse der PALLAS-Studie erklären könnte.