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Das Pankreasadenokarzinom (PDAC) ist aufgrund seiner hohen Letalität die vierthäufigste Todesursache unter den Krebserkrankungen in der westlichen Welt. PDAC ist durch eine erhebliche desmoplastische Stromareaktion mit geringer Vaskularisierung gekennzeichnet, so dass die Karzinomzellen ständigem Nährstoffmangel und Hypoxie ausgesetzt sind. In gesunden Zellen wird die Autophagie, welche konstitutiv auf einem basalen Niveau aktiv ist, als Reaktion auf umweltbedingte Stressfaktoren als Recyclingmechanismus aktiviert, um die Zellen mit Nährstoffen zu versorgen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Basalautophagie in den Karzinomzellen so hoch war, dass eine zusätzliche Aktivierung durch Mangelzustände nur schwach oder überhaupt nicht möglich war. Als Ursache hierfür ist die fehlende Sensitivität von mTOR zu nennen, wodurch eine verminderte Reaktion auf Nährstoffmangel oder Hypoxie bedingt ist. Ebenso sind Mutationen im KRAS-Gen, welche den RAS-Signalweg konstitutiv aktivieren, dafür verantwortlich, die Autophagie auch unter normalen Bedingungen zu steigern, so dass eine zusätzliche Induktion kaum möglich ist. Diese erhöhte Basalautophagie ist für die gesteigerte Proliferationsrate der Karzinomzellen sowie für die Versorgung der Zellen mit Aminosäuren notwendig. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich Karzinomzellen durch einen uneinheitlichen oxidativen/ glykolytischen Stoffwechsel auszeichnen, wobei die oxidative Phosphorylierung eine größere Bedeutung innehat. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Proliferation der Karzinomzellen unter OXPHOS-Inhibitoren unterdrückt wurde. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Aufrechterhaltung der oxidativen Phosphorylierung der Schlüsselmechanismus ist, über den Autophagie und Nährstoffversorgung zum Zellwachstum beitragen. Dies stellt einen Widerspruch zur Warburg-Hypothese dar. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen auf, dass der Mechanismus der Autophagie ein therapeutisches Target für eine unterstützende Therapie im Pankreaskarzinom darstellt, welches in nachfolgenden Arbeiten weiterführend evaluiert werden muss.
Das Ziel des Projektes war die Untersuchung der erworbenen Chemotherapie-Resistenz des Pankreaskarzinoms gegenüber den Zytostatika 5FU und Gemcitabin in Hinblick auf eine potentielle Regulation durch microRNAs.
Im ersten Schritt wurden Zelllinien mit einer intrinsischen Sensitivität identifiziert. Sieben etablierte Zelllinien des Pankreaskarzinoms (BXPC-3; COLO 357; PATU8988-S; PATU8988-T; CAPAN-1; MIA-PaCa-2; PANC-1) wurden mit Hilfe einer Annexin-V/DAPI-Färbung auf eine 5FU- oder Gemcitabin-induzierte Apoptose untersucht. Vier Zelllinien mit einer intrinsischen Sensitivität (BXPC-3; COLO 357; PATU8988-S; PATU8988-T) konnten identifiziert werden. Es folgte die Etablierung einer sekundären Chemotherapie-Resistenz in diesen sensitiven Zelllinien und die Bestätigung durch einen Proliferationsassay. Um die Hypothese einer veränderten microRNA-Expression in den sekundär resistenten Zelllinien zu untermauern, wurde die Expression der microRNAs miR-21, miR-200b und miR-214 untersucht. Eine veränderte Expression wurde gefunden und eine microRNA-Transkriptom-Analyse folgte. Diese deckte eine aberrante Expression von neun microRNAs (miR-7-5p; miR-23a-3p; miR-24-3p; miR-100-5p; miR-125b- 5p; miR-301a- 3p; miR-3158-5p; miR-3621; miR-3940- 5p) auf. Die Validierung dieser microRNAs via RTPCR zeigte eine Überexpression von miR-100 und miR-125b in allen resistenten Tumorzellen. Dies ist die erste Studie, welche valide Beweise für die Beteiligung beider microRNAs an der erworbenen Resistenz gegen 5FU und Gemcitabin zeigt. Für die Evaluation ihrer biologischen Rolle wurde die miR-100 oder miR-125b durch eine transiente Transfektion in den resistenten Zellen inhibiert. Eine Einschränkung der Viabilität und ein Anstieg der Caspasen 3 und 7 konnte nach Applikation der Zytostatika gesehen werden. Durch einen Proliferationsassay konnte eine langfristige Inhibition des Tumorzellwachstums, des Metabolismus und der Viabilität nach dem Knock-down der microRNAs bewiesen werden. Ein Zytotoxizitäts-Assay zeigte, dass die microRNA-Inhibition zu einer Wiederherstellung von Sensitivität und Dosis-Wirkungs-Beziehung gegenüber 5FU oder Gemcitabin führt. Es ist somit gezeigt, dass die miR-100 und miR-125b eine entscheidende Rolle in der Ausbildung einer sekundären Antimetabolit-Resistenz spielen. Ob diese microRNAs als Zielmolekül einer zukünftigen Antitumortherapie oder als Screeningparameter genutzt werden können, müssen weitere Studien zeigen.
Das duktale Adenokarzinom des Pankreas gehört zu den Tumorentitäten mit geringen therapeutischen Möglichkeiten. Neue Erkenntnisse über relevante Signalwege in der Tumorprogression und Metastasierung sind daher von hoher Relevanz für den klinischen Alltag. Die vorliegende Arbeit untersuchte den Einfluss der Humanen neutrophilen Elastase (HNE) auf humane Pankreaskarzinomzelllinien über den Protease-aktivierten Rezeptor 2 (PAR-2).
In Immunfluoreszenzfärbung und Western Blot konnte gezeigt werden, dass PAR-2 von verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien exprimiert wird. Die HNE ist ein bekannter Aktivator dieses Rezeptors, wobei der zugrunde liegende Mechanismus einzigartig im Vergleich zu anderen Proteasen wie bspw. Trypsin ist. Im Folgenden wurden die grundlegenden Tumorcharakteristika wie gesteigerte Proliferation, Migration und Unabhängigkeit von externen Wachstumsfaktoren in verschiedenen Verfahren untersucht. Hierfür wurden neben der HNE das synthetische PAR-2- Aktivierungspeptid (SLIGKV) bzw. reverse Peptid (VKGILS) genutzt. Dabei zeigten sich signifikante Steigerungen von Migration und Proliferation im Scratch- bzw. MTT-Assay für HNE und SLIGKV, jedoch nicht für VKGILS. Auch nach kombinierter Inkubation mit HNE und VKGILS konnte kein signifikanter Unterschied zur Kontrolle festgestellt werden, was einen PAR-2-abhängigen Wirkmechanismus der HNE belegt. Eine Ausnahme bildet hierbei die Zelllinie Patu-89888T bezogen auf den Scratch-Assay. Dieser und weitere Unterschiede stellen die Komplexität der Interaktionen in verschiedenster Weise dar.
Des Weiteren zeigte die Inkubationen mit HNE und SLIGKV vergleichbare Ergebnisse im Western Blot bezüglich einer Aktivierung des MAP/Erk- und des PI3K/Akt-Signalweges.
Darüber hinaus steigern sowohl HNE als auch SLIGKV die Sekretion von Vascular endothelial growth factor wie mittels ELISA demonstriert werden konnte.
Abschließend kann also davon ausgegangen werden, dass die Effekte die HNE auf Pankreaskarzinomzelllinien in bedeutendem Maße über PAR-2 vermittelt werden. Hierbei werden verschiedene Signalkaskaden stimuliert, die letztendlich zu einer gesteigerten Proliferation, Migration und VEGF-Sekretion der Zellen führen. Sowohl eine Inhibition des PAR-2 als auch der HNE könnten daher neue mögliche Therapieoptionen darstellen.