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Until today, more than 17% of the population in Mecklenburg Western-Pomerania suffer from chronic kidney disease (CKD) which was revealed by the SHIP study (Study of Health in Pomerania). 20% of CKD cases can be traced back to glomerulopathies. One common characteristic of glomerulopathies is the morphologic change of the glomerular filtration barrier which consists of endothelial cells, the glomerular basement membrane and podocytes. Under healthy conditions, the foot processes of the podocytes interdigitate with the foot processes of the neighboring podocytes with a filtration slit in between. Apart from the slit membrane protein nephrin, typical adherens junction proteins like occludin or JAM-A are also expressed at this cell-cell junction. This junction is therefore considered to be a specialized type of adherens junction, necessary to maintain the size-selectivity of the filtration barrier. During podocyte injury, podocyte foot processes lose their characteristic morphology and the typical meandering filtration slit becomes linearized, a process which is described as foot process effacement.
Since morphological change is directly linked to change or loss of function, ultrastructural analysis of the foot processes is necessary for diagnostics and research. By using 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM), we quantified these morphological changes as well as studied a possible biomarker, the tight junction protein claudin 5 (CLDN5). Our study showed a spatially restricted up-regulation of CLDN5 in effaced filtration slit areas in biopsies of patients suffering from minimal change disease (MCD), focal and segmental glomerulosclerosis (FSGS) as well as in mice after NTS injection and in the uninephrectomy DOCA-salt mouse model. CLDN5/nephrin ratios of biopsies from patients with glomerulopathies and of tissue received from NTS-treated mice were significantly higher compared to controls. We found that in patients the CLDN5/nephrin ratios were negatively correlated with the filtration slit density. Since CLDN5 up-regulation was observed in several areas of high filtration slit density, we hypothesized that CDLN5 upregulation preceded visible foot process effacement. Taken together, we suggest that CLDN5 could be a helpful biomarker to identify an early change of the foot process morphology in addition to filtration slit density measurement. Additionally, correlation analysis of foot process effacement with patient data showed a significant negative correlation of the filtration slit density with proteinuria in MCD patients.
Bei der Untersuchung verschiedener chronischer Nierenerkrankungen in den letzten Jahrzehnten zeigte sich, dass Podozyten als Bestandteil der glomerulären Filtrationsbarriere häufig in die Pathomechanismen involviert sind, wobei ein Verlust ihrer besonderen Architektur aus interdigitierenden Fußfortsätzen (effacement) und auch die Ablösung einzelner Podozyten von der glomerulären Basalmembran beobachtet werden können. Da es sich um postmitotische Zellen handelt, kann ein Verlust nur durch eine Hypertrophie verbleibender Zellen ausgeglichen werden. Nach wie vor ist nicht eindeutig geklärt, ob ein Ersatz stattfindet und wenn ja, welche Zellen dafür verantwortlich sind. Seit einigen Jahren sind die PECs in den Fokus der Aufmerksamkeit gerückt und es konnte gezeigt werden, dass sie sich unter bestimmten Bedingungen zu Podozyten-ähnlichen Zellen differenzieren, aber auch einen negativen Einfluss im vorgeschädigten Glomerulum durch ein profibrotisches Potential ausüben können.
In dieser Arbeit wurden drei Transkriptionsfaktoren (Dach1, MafB und Foxc2) in PECs transfiziert. Für alle drei konnte in der Vergangenheit eine Bedeutung in der Nieren-bzw. Podozytenentwicklung gezeigt werden. Es sollte untersucht werden, ob einer der drei Transkriptionsfaktoren eine Differenzierung der PECs zu Podozyten in vitro induzieren könnte. Auch der Einfluss der jeweiligen Faktoren untereinander wurde untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Transfektion mit pMafB-tGFP einen signifikanten Dach1-Anstieg in PECs bedingte. Hinsichtlich der Expression von F Aktin, α-Tubulin und dem Podozyten-spezifischen Transkriptionsfaktor WT-1 in PECs zeigte sich bildmorphologisch kein Hinweis für einen möglichen Einfluss von Dach1, MafB und Foxc2 in PECs. Allerdings konnte durch die Überexpression von Dach1 in PECs ein signifikanter Anstieg des Podozyten-spezifischen Proteins Synaptopodin beobachtet werden. Des Weiteren kam es zu einer Herunterregulation von Pax-2, was insofern bedeutsam ist, als dass auch Podozyten eine verminderte Pax-2-Expression aufweisen. Es zeigte sich außerdem eine verminderte Expression von Caveolin-1 und β-Catenin. Während Ersteres eher als ein Zeichen des profibrotischen und somit negativen Potentials gewertet werden könnte, ähnelt die Herunterregulation von β-Catenin wiederum dem Status von Podozyten.
Zusammenfassend bestätigt die Arbeit das Differenzierungspotential von PECs zu Podozyten und zeigt, dass Dach1 in vitro ein entscheidender Faktor dafür ist.
Morphological changes of the complex 3-D architecture of podocytes as well as the loss of these post-mitotic cells often result in severe kidney disease. Since currently, there are no curative drugs, we focused on the identification of non-invasive biomarkers, allowing an early detection of the onset of such diseases. Therefore, we analyzed the cellular- and the cell-free fractions of urine samples from patients suffering from chronic kidney disease (CKD), especially for injury markers as well as for exosome-derived miRNAs.
We identified the mRNA of the neuronal protein brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the cellular fraction of 120 CKD patients and found that the expression was highly correlated with the mRNA expression of the kidney injury marker molecule 1 (KIM-1). Furthermore, we found that both were correlated with the mRNA expression of the podocyte-specific gene Nephrin (NPHS1), suggesting that podocytes are very likely the cellular source.
Beside this, we observed that BDNF is upregulated in biopsies of diabetic patients and seems to be involved in the differentiation of podocytes. Immunofluorescence staining clearly showed that BDNF is localized in the cell body and major processes of podocytes within the glomerulus. Knockdown experiments in zebrafish larvae, a well-established animal model to study kidney function, showed the importance of BDNF on kidney function, morphology and filtration in vivo.
Additionally, we analyzed circulating exosomal microRNAs (miRs) isolated from the cell-free urine fraction. After the optimization of a column-based isolation protocol for exosomes, we identified miR-16 from a pre-selected set of candidates as a suitable endogenous reference gene for data normalization. Subsequently, we analyzed the exosomal levels of miR-21, miR-30a-5p and miR-92a in urine samples of 41 CKD patients and 5 healthy controls. We found significantly enhanced levels of miR-21 in CKD patients that were also negatively correlated with the eGFR, suggesting a negative influence on kidney function. MiR-21 was also highly upregulated in de-differentiated glomeruli and in kidneys of nephrotoxic serum- (NTS-) treated mice as an in vivo kidney injury model.
To summarize, we identified two promising new and non-invasive biomarkers for CKD in the urine of patients which may also have a functional relevance on kidney function.
Die Morphologie der Podozytenfußfortsätze und eine intakte glomeruläre Basal-membran (GBM) sind essentiell für die Filtration des Blutes. Bei der diabetischen Nephropathie (DN), deren Inzidenz in den letzten Jahrzehnten deutlich gestiegen ist, kommt es neben pathologischen Veränderungen der Fußfortsätze auch zu Ablösung und Verlust der Podozyten. Als hochdifferenzierte, postmitotische Zellen können Podozyten nicht regeneriert werden. Jeder Verlust ist damit irreversibel. Aber auch weitreichende Veränderungen der GBM, sowie eine Sklero¬sierung der Glomeruli sind zu beobachten. Dies führt zu einer progredienten Nieren¬insuffizienz, welche oft im Nierenversagen endet. Man geht davon aus, dass glomeru¬lärer Hypertonus, der zur mechanischen Dehnung von Podozyten führt, ein wichtiger Teil des Pathomechanismus der DN ist. Welchen Einfluss mechanische Kräfte auf Podozyten haben war in der Vergangenheit nur unzureichend untersucht. Daher wurde von der AG Endlich ein Dehnungsapparat entwickelt, mit dem Zellen einer zyklischen mechanischen Dehnung ausgesetzt werden können. So konnte gezeigt werden, dass Podozyten mechanosensitiv sind und unter anderem mit Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts auf mechanische Dehnung reagieren. Die vorliegende Arbeit zeigt zum einen, dass kultivierte Podozyten unter mechanischer Dehnung vermehrt das Protein Fibronektin bilden. Fibronektin ist ein essentielles Matrixprotein und spielt als Mechanotransducer in der Literatur eine große Rolle. Zum anderen zeigt die Arbeit, dass Fibronektin eine Schlüsselrolle hinsichtlich der Adhäsivität von kultivierten Podozyten unter mechanischer Dehnung spielt. Um das zu untersuchen, wurden Podozyten mit Fibronektin-Knockdown und -Knockout generiert und der Einfluss auf die Morphologie und Adhäsiviät der Podozyten untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Podozyten ohne Fibronektin bei mechanischer Dehnung nach drei Tagen nur noch zu etwa 20 % auf der Membranoberfläche adhärent waren. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Fibronektin für die Adhäsion von kultivierten Podozyten unter mechanischer Dehnung eine zentrale Rolle spielt. Durch Immun¬fluoreszenz¬färbung konnte an Biopsien nachgewiesen werden, dass Fibronektin in der GBM von Patienten mit DN vermehrt eingelagert wird. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass mechanische Dehnung der Podozyten in vivo zu einer Akkumulation von Fibronektin in der GBM führt, was langfristig sehr wahrscheinlich die Eigenschaften der GBM und die glomeruläre Filtration negativ beeinflusst. Die genaueren Zusammenhänge zwischen Mechanotransduktion und Fibronektin-expression aufzuschlüsseln sollte daher Ziel weiterführender Forschungsarbeiten sein, um in Zukunft einen therapeutischen Ansatz zur Behandlung der diabetischen Nephropathie zu entwickeln.