Open Access

Over the past several years, various important articles focusing on cancer therapy approaches in head and neck squamous cell carcinomas (HNSCCs) using cold atmospheric plasma (CAP) have been published (SEMMLER et al. 2020 [53], METELMANN et al. 2018 [44], KEIDAR et al. 2011 [33]). This doctoral thesis presents selected results from a prospective observational clinical study in CAP therapy of palliative HNSCC patients, carried out at the Department of Oral and Maxillofacial Surgery/Plastic Surgery of the Greifswald University Medicine. For oral and maxillofacial surgeons, ulcerated surfaces of locally advanced head and neck squamous cell carcinomas (UICC IV) offer a challenging treatment assignment with microbial contamination and tumour progression. The clinical attempt appears to eradicate microbial contamination and to initiate tumour regression. This doctoral thesis will describe the processes of human tumour biology and tumour immunology in HNSCCs and the extent of present knowledge concerning plasma medical oncology as an anticancer modality. In the introduction of the doctoral thesis clinical results of plasma therapy in locally advanced HNSCCs (UICC IV) are set out. This mainly includes the investigation of a therapeutic concept, the treatment phases, the tumour size development and the morphological changes of the infected tumour surface following cold atmospheric plasma therapy. In the main part, a detailed immunological interpretation is proposed on the basis of present preclinical and clinical immunological knowledge. Finally, unexplored questions in plasma medical oncology are highlighted. This is highly significant for future plasma research and clinical anticancer therapy.

Zusammenfassung Die Wundheilung stellt einen komplexen und sensiblen Prozess dar, wobei neben Keratinozyten auch besonders Immunzellen eine wesentliche Rolle spielen. Besonders in der Medizin ist die Behandlung von Wunden eine zentrale Aufgabe und erfordert immer mehr Techniken, um diesen Prozess effizienter ablaufen zu lassen. Seit einigen Jahren steht die Behandlung von Wunden mittels Niedertemperatur Plasma immer mehr im Fokus der Wissenschaft. Dabei besteht Plasma aus zahlreichen Komponenten, wobei jede Komponente die Zelle unterschiedlich beeinflussen kann. Da auch jede Wunde einzigartig im Hinblick auf Beschaffenheit und Erregerspektrum ist, sollte dies auch mit einer individuellen Abstimmung der Plasamkomponenten einhergehen um so die Wundheilung noch effizienter zu gestallten. Ziel dieser Arbeit ist die Modifizierung der Plasma-Komponenten durch einen Gasmantel, um herauszufinden, welche Modifizierung am effektivsten auf Immunzellen und somit auch auf die Wundheilung wirkt.Dafür wurde in der vorliegenden Arbeit die Auswirkungen von fünf Gaszumischungen im Mantelgas eines argonbetriebenen kalten Atmosphärendruckplasmajets (kINPen 11) auf die Generierung von reaktiven Spezies in Flüssigkeiten und auf Monozyten in vitro untersucht. Der kINPen (ein Gerät der Firma neoplas,zur Erzeugung von Niedertemperatur-Plasma) war dabei auf 5slm(Standardliter pro Minute Argon) und Burstmodus eingestellt. Die Gaszusammensetzung variiert von 100% Stickstoff (N2) und 0% Sauerstoff (O2) in 25íger Schritten zu 100% O2 und 0% N2. Dabei entstehen abhängig von der O2- und N2-Zufuhr im Gasmantel unterschiedliche reaktive Spezies. Als repräsentativ für die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wird Wasserstoffperoxid (H2O2) und für reaktiven Stickstoffspezies (RNS) werden Nitrit (NO2–) und Nitrat (NO3–) erfasst. Die Experimente wurden nach Flüssigkeitsanalytik und zellphysiologischen Aspekten gegliedert. Es wurde die THP-1-Monozytenzelllinie verwendet. Zu den Methoden der Flüssigkeitsanalytik gehören die Bestimmung des pH-Werts, die Detektion der NO2–-, NO3–- und H2O2-Konzentration. Zellphysiologisch wurde die Zellviabillität,die Apoptoserate,der Wachstumsfaktor HB-EGF,sowie die Zytokinsekretion detektiert. Zudem wurde die direkte und indirekte Plasma-Behandlung verglichen.Bei derdirekten Plasma-Behandlung stehen die Zellen mit dem Plasmaeffluenten im direkten, kontinuierlich Kontakt, wohingegen bei der indirekten Behandlung nur das Zellkulturmedium behandelt wird und anschließend auf die Zellen gelangt. Die Zellen haben keinen Kontakt mit dem Plasmaeffluenten. Zu der Flüssigkeitsanalytik gehört die gezielte Messung der durch das Plasma entstehenden ROS und RNS in phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) und Zellkulturmedium (RPMI-Medium, Roswell Park Memorial Institute). Es konnten keine pH-Wert-Veränderungen durch die Plasma-Behandlung gemessen werden, aber mit Zunahme der Behandlungszeit stieg die Menge an reaktiven Spezies. Der Gasmantel hat besonders Auswirkungen auf den Gehalt der Flüssigkeiten an reaktiven Spezies. Die niedrigsten Nitrat-Anion (NO3–)- und Nitrit-Anion (NO2–)-Konzentrationen ergaben sich bei der 100% und 0%N2-Mantelgaszumischung. Die75%N2-Mantelgaszumischung zeigte die höchste NO3–-Konzentration in PBS. Die H2O2-Konzentration nahm mit dem Anteil an O2 im Mantelgas zu und erreicht ihr Maximum bei Mantelgaszumischung gezeigt werden. Alle anderen Mantelgaszumischungen zeigten zwar bei der Flüssigkeitsanalytik deutliche Unterschiede, doch durch die Anwesenheit von THP-1-Zellen wurde der Einfluss deutlich geringer. Die Gaszumischungen hatten trotz unterschiedlicher Bildung von reaktiven Stickstoff- und Sauerstoffspezies keinen großen Effekt auf die Zelltoxizität. Die 50%-N2-Mantelgaszumischung bewirkte die höchsten Konzentrationen an reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies (RONS), was mit einer erhöhten frühen und späten Apoptose einherging und mit niedrigen IL-8-Werten. Die 100% N2-Mantelgaszumischung zeigte die größten Effekte auf die Zytokinsekretion. Die IL-6-Konzentration sank sowohl bei den direkt als auch indirekt mit Plasma behandelten und mit Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierten Proben. Gleichzeitig wurde für die unstimulierte, indirekte Plasma-Behandlung ein deutlicher Anstieg der IL-8-Konzentration gemessen. Neben den erwähnten Ergebnissen konnten weitere zelluläre Effekte unabhängig von den Mantelgaszumischungen gemessen werden. Zum Einen zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen der direkten und indirekten Plasma-Behandlung. Die indirekte Plasma-Behandlung,d.h.diePlasma-Behandlung von Zellkulturmedium und die anschließende Inkubation der Zellen, zeigte eine starke Erhöhung der IL-8-Konzentration, die mit der N2-Konzentration im Mantelgas anstieg. Auch für die IL-6- und IL-8-Konzentrationen nach LPS-Stimulation zeigten sich Unterschiede zwischen der direkten und indirekten Behandlung. Die indirekte Plasma-Behandlung zeigte eine stark reduzierte Zellviabilität gegenüber der direkten Plasma-Behandlung (1 min), die eher aktivierend wirkte. Zum Zweiten zeigte sich nach der Plasma-Behandlung, dass die Zellen im Durchflusszytometer eine Erhöhung des Volumens und der Granularität nach langen Behandlungszeiten aufwiesen und scheinbar erhöhte Zellviabilität. Eine Detektion des Wachstumsfaktors HB-EGF mit Hilfe der FACS-Analyse konnte nicht gezeigt werden. Drittens, konnte durch Zugabe von Katalase ein Anstieg der NO2–-Konzentration im RPMI im Vergleich zur Behandlung ohne Katalase gezeigt werden. Somit spiegelt die Flüssigkeitsanalytik nicht die Stituation in Gegenwart von Zellen in vitro wieder. Erstmalig konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Modifizierung der Umgebungsgase bei der Plasma-Behandlung einen Einfluss auf die Bildung von ROS, RNS und Zytokinen hat. Besonders die 50% N2-Mantelgaszumischung hat mit der Reduktion der IL-8-Konzentration und damit der Reduktion eines für die Angionese relevanten Faktors möglicherweise einen negativen Effekt auf die Wundheilung. Im Gegensatz dazu bewirkt die 100% N2-Mantelgaszumischung durch Abnahme von IL-6 eine Verringerung der Entzündungsmediatoren und durch die Erhöhung von IL-8 eine Zunahme eines für die Angiogenese in Wunden wichtigen Parameters. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass der Einfluss durch die Behandlungszeit und der direkten und indirekten Behandlung einen weitaus größeren Effekt auf Monozyten haben könnte als bisher angenommen. Somit leistet diese Arbeit einen zusätzlichen Beitrag für das weitere Verständnis bei der Aufklärung der zellulären Effekte durch die Plasma-Behandlung. Es kamen aber auch neue Fragen auf, die noch nicht hinreichend geklärt wurden: Erstens, welcher Mechanismus steht hinter der Zunahme der Granularität und des Volumens nach langen Plasma-Behandlungen. Zweitens, in wie weit sind die ohne Katalase-Behandlung gemessenen NO2–-Konzentrationen aussagekräftig. Drittens, haben die indirekte und direkte Plasma-Behandlung den gleichen Effekt in vivo wie in vitro. Um diese Fragen weiter zu klären ist weitere Forschung nötig.

Reactive species play an essential role in orchestrating wound healing responses. They act as secondary messengers and drive redox-signaling pathways that are involved in the hemostatic, inflammatory, proliferative and remodeling phases of wound healing. Cold plasma produces a profusion of short- and long-lived redox species that promotes wound healing, however, until today, the knowledge of CAP mediated wound healing remained scarce. In this thesis, CAP mediated wound healing mechanism and their effect on extracellular matrix and adhesion molecules have been investigated. To this end, a keratinocyte cell line (HaCaT), skin fibroblast cell line (GM Fbs) and an in vitro coculture model including both HaCaT and GM Fbs at a 2:1 ratio, were employed to investigate the cross talk between these two skin cell types. We examined the impact of CAP on extracellular matrix proteins and cell adhesion molecules in GM Fbs and observed a significant impact of cold plasma treatment on the expression level of collagen moieties, cell adhesion molecule like integrin, cadherin, versican, MMPs as well as extracellular matrix proteins. Moreover, scratch assays with monocultures of HaCaT, GM Fbs and coculture of these two cell types were performed. We detected that, CAP accelerated the migratory capability of HaCaT cells cocultured with fibroblasts. In fact, compared to HaCaT monoculture, a significant acceleration on cell migration was observed in coculture upon CAP treatment. NAC, a potent antioxidant could abrogate this CAP-stimulated cell migration in coculture, further pointing towards the importance of well-orchestrated reactive species in wound healing. To better understand this CAP-mediated effect on cell migration, we examined the signaling pathways involved in tissue homeostasis and regeneration. We checked the HIPPO signaling pathway and observed an upregulation of several signaling molecules at transcriptional level in GM Fbs upon CAP treatment. YAP is the central nuclear executer of HIPPO signaling pathway. YAP was upregulated in both HaCaT cells and GM Fbs. The major downstream effectors of the HIPPO signaling pathway (CTGF and Cyr61) were also upregulated in dermal fibroblasts at both transcriptional and protein level. However, administration of antioxidant NAC inhibited CAP-mediated wound healing and abrogated the gene expression of the HIPPO downstream effectors. These results confirm that the upregulation of YAP-CTGF-CYR61 axis is due to CAP-generated redox species. In HaCaT cells, both CTGF and Cyr61 was minimally transcribed. Even though CTGF was rarely detected in HaCaT cells on the protein level,Cyr61 remained undetected. This again shows the importance of the cross talk between fibroblasts and keratinocytes. The coculture with the inclusion of fibroblasts showed an accelerated migration rate, compared to HaCaT monoculture which specifies a cross talk between these two cell types. Thus, monoculture of HaCaT cells were incubated with CAP-treated and untreated fibroblast conditioned medium. Interestingly, we observed that HaCaT cells exhibited an improved cell migration rate when incubated with CAP-treated fibroblast-conditioned media compared to that observed after incubation with untreated media. Upon investigation, an induction of CTGF and Cyr61 secretion was observed upon CAP treatment in the fibroblast-conditioned media. Furthermore, exposure to recombinant CTGF and Cyr61 could also significantly improve HaCaT cell migration which confirms that CAP mediated accelerated cell migration is due to activation of YAP-CTGF-Cyr61 axis. In conclusion, this study revealed a completely new mechanical insight of CAP mediated wound healing. Along with several other ECM molecules, CAP activates a regenerative signaling pathway i.e., HIPPO signaling pathway in dermal fibroblasts at the onset of wound healing. Dermal fibroblasts drive a paracrine interaction by secreting CTGF and Cyr61 in close vicinity of wound, resulting in accelerated keratinocyte migration and wound healing in coculture.

Zusammenfassung und Ausblick Die Forschungshypothese, dass eine Plasmabehandlung der Haut mit kaltem Atmosphärendruckplasma zu einer lokalen Änderung der physikochemischen Eigenschaften des Stratum corneum und dessen Struktur und (Barriere-)Funktion führt, konnte bestätigt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden morphologisch sichtbare Hautveränderungen, die Penetrationseigenschaften verschiedener Substanzen vor und nach Plasmabehandlung sowie Veränderungen der Lipidzusammensetzung des Stratum corneum auf molekularer Ebene analysiert. Der wesentliche Erkenntnisgewinn der Arbeit besteht im qualitativen und quantitativen Nachweis der gefahrlosen durch kaltes Atmosphärendruckplasma vermittelten Penetrationssteigerung von Substanzen in die Haut mit speziellem Fokus auf das Stratum corneum. Die Plasmabehandlung der Haut mit einem Plasmajet lockert abhängig von der Plasmabehandlungszeit das aus Corneozyten und einer interzellulären Lipidmatrix bestehende Stratum corneum auf. Die aufgelockerte Struktur des Stratum corneum ermöglicht eine beschleunigte Penetration verschiedener, nach Plasmabehandlung applizierter Substanzen durch die Haut (Kapitel 4.2.). Die Penetrationssteigerung variiert dabei abhängig von den Stoffeigenschaften der penetrierenden Substanz (zum Beispiel Molekülgröße und Lipophilie). Die morphologische Auflockerung des Stratum corneum spiegelt sich im nach der Plasmabehandlung veränderten Ceramid-Profil wieder. Die veränderten Barriereeigenschaften in den obersten Schichten des Stratum corneum nach einer einminütigen Plasmabehandlung lassen sich über die Interaktion von plasma-produzierten reaktiven Spezies mit Lipiden der Haut (insbesondere Triacylglycerolen) und die dadurch vermittelte Bildung von Triacylglycerol-Oxidationsprodukten erklären (Kapitel 4.4.). Eine Plasmabehandlung hat im Bereich der in der Dermatologie für den kINPen MED empfohlenen Anwendungsdauer von 15 s/cm² bis 1 min/cm² keine negativen Auswirkungen auf die Haut (keine gesteigerte Anzahl an Apoptosen im Stratum basale, Möglichkeit der Regeneration des aufgelockerten Stratum corneum von basal, (Kapitel 4.3.)). Längere Behandlungszeiten von 2 min/cm² bis 5 min/cm² können jedoch zu Apoptosen in für die Zellregeneration bedeutenden Schichten führen. Im Gegensatz zu anderen Methoden zur transdermalen Penetrationssteigerung besteht bei der Plasma- vermittelten Penetrationssteigerung auf Grund der antibakteriellen Plasmaeigenschaften und der Penetrationsbeschleunigung von ausschließlich kleinen Stoffen (Größe unter 689 nm) ein geringeres Risiko der Infektion der behandelten Hautbereiche durch die Einwanderung von Bakterien und Pilzen. Die Plasmabehandlung stellt demnach eine zukunftsträchtige Möglichkeit zur gefahrlosen Penetrationssteigerung von Arzneistoffen durch die Hautbarriere dar. Da die in dieser Arbeit gewonnenen Daten in vitro mit Hilfe eines Schweineohrmodells ermittelt wurden, ermöglichen sie einen ersten Einblick in die Reaktion der gesunden menschlichen Haut auf die Plasmabehandlung, lassen sich jedoch nicht eins zu eins auf die in vivo-Situation am menschlichen Körper übertragen. Zudem sollte bei der Plasmabehandlung in vivo beachtet werden, dass es am menschlichen Körper große intra- und interindividuelle Unterschiede in der Beschaffenheit der Hautbarriere gibt, welche zu unterschiedlich starken Effekten der Plasmabehandlung führen könnten. Ein Vergleich der Penetrationseigenschaften weiterer Stoffe mit unterschiedlichen hydro- und lipophilen Stoffeigenschaften sowie unterschiedlichen Molekülgrößen vor und nach Plasmabehandlung wäre für weitere Forschungsarbeiten empfehlenswert. Auf diese Weise könnte erforscht werden, auf welche Substanzen die Plasmabehandlung der Haut den größten Einfluss hat und es wären weitere Rückschlüsse auf die Form der aufgelockerten Bindungen, sowie auf eine eventuelle Interaktion modifizierter Stratum corneum-Bestandteile mit der penetrierenden Substanz möglich. Gleichzeitig könnten die Versuche mit längeren Penetrationszeiten wiederholt werden, um zu überprüfen, ob tatsächlich eine Rechtsverschiebung des Peaks der Konzentration der penetrierten Substanzen (siehe Kapitel 3.4. und Kapitel 3.5.) in tiefere Hautbereiche stattfindet. Ein direkter Vergleich penetrationssteigernder Methoden (beispielsweise Mikronadeln und Plasmajet) wäre interessant, um die verschiedenen Systeme auch quantitativ vergleichen zu können und zu analysieren, ob die Vorteile der plasmavermittelten Penetrationssteigerung gegenüber der Mikronadelmethode durch die Menge an penetrierter Substanz ausgeglichen werden können. Neben den Lipiden könnte auch die Modifikation weiterer Stratum-corneum-Bestandteile ursächlich für die veränderten Barriereeigenschaften der Haut nach Plasmabehandlung sein. Interessant wäre deshalb auch die Untersuchung der Stratum-corneum-Peptide und -Proteine vor und nach Plasmabehandlung. Um die Reaktion der Haut in vivo auf die Plasmabehandlung besser vorhersagen zu können und damit die im Rahmen dieser Arbeit erlangten Erkenntnisse in die klinische Praxis übertragen zu können, sind weitere Studien nötig. Diese könnten die in vitro-Experimente am Schweineohr beispielsweise auf ein in vivo-Mäusehautmodell übertragen. An einem frischen Mäusehautmodell wäre auch die Untersuchung längerer Penetrationszeiten sowie die Geschwindigkeit der Hautregeneration und dem damit Verbundenen Wiederaufbau der Hautbarriere nach Plasmabehandlung möglich. Nach einer Verifizierung der Ergebnisse in vivo könnten die im Rahmen dieses Projekts gewonnenen Erkenntnisse in Zukunft auf den klinischen Alltag übertragen werden. Für Langzeittherapien bei speziellen Patientengruppen mit Problemen bei der oralen Medikamentenaufnahme (beispielsweise in Form von Resorptionsstörungen im Magen-Darm-Trakt) oder bei einem starken First-Pass-Effekt des Medikaments in der Leber ist die transdermale Medikamentenapplikation eine Ausweichmöglichkeit, welche durch eine vorherige Plasmabehandlung der Haut noch verbessert werden würde. Im Rahmen des bereits etablierten medizinischen Anwendungsfelds von kaltem Atmosphärendruckplasma bei der Behandlung chronischer Wunden könnte eine Plasmabehandlung der Wundränder und angrenzender gesunder Hautbereiche die Penetration von nach der Behandlung applizierten wundheilungsfördernden Cremes und Gels im betroffenen Gebiet beschleunigen und so die Heilungsaussichten noch weiter verbessern.