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Klimawandel, Änderungen der Landnutzung und Habitatzerstörung sowie die Globalisierung tragen zu einer zunehmenden Ausbreitung von bekannten und noch unbekannten Viren bei, die eine Gefahr für Mensch und Tier darstellen können. Um potenziell gefährliche Viren frühzeitig zu entdecken, kann das in dieser Arbeit vorgestellte Protokoll für einen pan-viralen DNA-Microarray-gestützten (PVM) Virusnachweis verwendet werden, der optional mit einer Hochdurchsatzsequenzierung gekoppelt werden kann.
Für die Etablierung des PVM-Protokolls wurde die Leistungsfähigkeit von drei Probenbearbeitungs- und Datenauswertungsmethoden beim Nachweis von zwei Modellviren, einem DNA-Virus und einem RNA-Virus, verglichen. Für die Kopplung mit dem PVM wurden verschiedene Systeme für die Hochdurchsatzsequenzierung verwendet.
Das Ziel der Arbeit war die Etablierung eines optimierten PVM-Protokolls für einen robusten, breiten Virusnachweis, welcher einzeln oder in Kombination mit einer Hochdurchsatzsequenzierung als Teil einer mehrstufigen Analysepipeline verwendet werden kann.
Beim Nachweis beider Modellviren wies die Library-basierte Probenbearbeitungs- und Datenauswertungsmethode Limma die höchste Sensitivität auf. In der darauf folgenden Validierung konnten alle Viren, unabhängig von ihrer Genomorganisation und Komplexität der Probenmaterialien, korrekt identifiziert werden. In zwei publizierten Studien konnte der Nachweis der zum Zeitpunkt der Untersuchung noch unbekannten BBLV und SqAdV-1 gezeigt werden. Durch die Rückgewinnung von Virus-spezifischen Nukleinsäuren vom PVM und der anschließenden Sequenzierung
mittels Hochdurchsatzsequenzierung konnte das SqAdV-1 im Rahmen einer mehrstufigen Analysepipeline vollständig identifiziert, annotiert und taxonomisch eingeordnet werden. Durch die Kombination von PVM und Hochdurchsatzsequenzierung wurden für sechs Viren eine Virus-spezifische Anreicherung und ein damit verbundener Gewinn an Sequenzinformation erreicht. Die Library-basierte Probenbearbeitung mit Limma erlaubte einen robusten und sensitiven Virusnachweis; deshalb wurden beide Methoden für das PVM-Protokoll ausgewählt. Die Fähigkeit des hier etablierten PVM-Protokolls, Viren unabhängig von der Genomorganisation und in komplexen Probenmaterialien zu identifizieren, zeigt dessen Gleichwertigkeit mit bereits etablierten PVM-Systemen. Die Verwendung des PVM-Protokolls in einer mehrstufigen Analysepipeline erlaubt auch die Identifikation von bisher unbekannten Viren. Der durch die Kombination mit einer Hochdurchsatzsequenzierung erreichte Gewinn an Sequenzinformation ermöglicht eine Identifizierung und detailliertere Charakterisierung von Viren.
Der PVM stellt einzeln und in Verbindung mit einem Hochdurchsatzsequenzierungs- System ein wertvolles Werkzeug für die Virusdiagnostik dar, dessen Anwendung den Zeitaufwand für die Virusidentifizierung deutlich reduzieren kann.
Virale Erreger können bei Mensch und Tier schwere bis fatale Enzephalitiden auslösen. Jedoch wird in nur ca. 50 % der Fälle das ätiologische Agens identifiziert. In dieser Arbeit wurde das Potential der Next Generation Sequencing-basierten Metagenomdiagnostik (mNGS) zur Identifizierung neuer Erreger bei infektiösen Enzephalitiden von Mensch und Tier untersucht. Ein weiteres Ziel war es, die Endemiegebiete des Virus der Borna’schen Krankheit 1 (BoDV-1) in Deutschland, Österreich, der Schweiz und Liechtenstein mittels phylogeographischer Analysen genauer zu definieren.
Es konnte im Rahmen dieser Arbeit ein wahrscheinlichkeitsbasiertes mathematisches Modell entwickelt und validiert werden, das die individuellen Nachweisgrenzen von mNGS-Analysen und die minimal benötigte Datensatzgröße zur Detektion mindestens eines Virus-Reads in Abhängigkeit des Virus-Wirts-Verhältnisses und der Datensatzgröße berechnet (Ebinger et al. (2020), Comput Struct Biotechnol J).
Des Weiteren wurde mNGS bei fatalen Enzephalitiden von Zoo- und Haussäugetieren angewendet, was einerseits zur Identifizierung von Rustrela-Virus (RusV) als ätiologischem Agens führte, einem Virus, das mit dem im Menschen vorkommenden Rötelnvirus verwandt ist. RusV wurde zudem in Gelbhalsmäusen (Apodemus flavicollis) detektiert, die aufgrund der phylogenetischen Nähe des Virus und den fehlenden Anzeichen einer Entzündung als Reservoirwirt identifiziert wurden (Bennett, Paskey, Ebinger et al. (2020), Nature). Andererseits wurde ein bislang unbekanntes ovines Enterovirus in Lämmern bei einem akuten Ausbruchsgeschehen auf einem österreichischen Milchschafbetrieb als Ursache von fatalen Enzephalitiden identifiziert (Weissenböck, Ebinger et al. (2021), Transbound Emerg Dis).
Die phylogeographische Analyse von insgesamt 246 BoDV-1-Infektionen in Mensch, Haussäugetieren und in den als Reservoirtier geltenden Feldspitzmäusen (Crocidura leucodon) ergaben eine umfassende und detaillierte Definition der BoDV-1-Endemiegebiete. Es konnte belegt werden, dass sich die verschiedenen speziesübergreifenden phylogenetischen Cluster in kaum überlappende regionale Subkladen aufteilen und die meisten zoonotischen Spillover-Infektionen in der Nähe der Wohn- oder Haltungsorte der jeweiligen Fälle auftraten (Ebinger et al. (2023), eingereicht).
Insgesamt tragen die Ergebnisse zu einem deutlich verbesserten Verständnis der Sensitivität und Interpretierbarkeit von mNGS-Analysen im klinischen und wissenschaftlichen Kontext bei und geben wichtige Hinweise zum Vorkommen, Verbreitung, Wirtsspektrum und genetischer Diversität von Rubiviren, ovinen Enteroviren und BoDV-1.