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Im ersten Teil dieser Arbeit wurden zur Beantwortung der Forschungsfrage 1 Lagerungsversuche durchgeführt. Diese zeigten, dass bei einem Lagerungszeitraum von bis zu sieben Tagen die Intensität aller gefärbten Strukturen mit der Zeit abnahm. Die Abnahme der Intensität war bei den meisten angefärbten Strukturen bereits ab dem ersten Lagerungstag zu beobachten. Zudem zeigte sich, dass Thrombospondin nur mit EDTA-antikoaguliertem Blut darstellbar war. Mit Hilfe dieser Arbeit konnte aber nicht nur die Abnahme der Intensität über den Lagerungszeitraum nachgewiesen werden, sondern auch, dass es innerhalb des Lagerungszeitraum zu Veränderungen der Strukturverteilung der angefärbten Strukturen kam. Filamin A und NMMIIA lagen an Tag 0 fixiert und gefärbt noch diffus verteilt im Thrombozyten vor und stellten sich im Anschluss ab dem ersten Lagerungstag vermehrt als eine Ringstruktur dar. Veränderungen der Struktur über den Lagerungszeitraum fand sich ebenso bei ß1-Tubulin. Alle weiteren Strukturen blieben über den gelagerten Zeitraum unverändert. Zusätzlich wurden im Rahmen dieser Arbeit Blutausstriche nach ihrer Intensität und Struktur beurteilt, die an Tag 0 fixiert wurden und im Anschluss fixiert bis Tag 7 gelagert wurden. Erst nach der fixierten Lagerung bis zu dem entsprechenden Lagerungstag wurden die Blutausstriche gefärbt. Bei dieser Methode, der an Tag 0 fixierten Blutausstriche, zeigte sich eine stärkere Intensität der angefärbten Strukturen, als wenn sie unfixiert gelagert wurden. Zur Beantwortung der Forschungsfrage 2 wurde im zweiten Teil dieser Arbeit die Visualisierung der Signalkaskade mit Hilfe von phosphorylierten Kinasen und der Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Durch die Anfärbung der phosphorylierten Kinasen in der Fluoreszenzmikroskopie konnte keine ausreichende Sensitivität und Spezifität erreicht werden und wurde aus diesem Grund nicht weiterverfolgt. Der parallele Ansatz mit der Durchflusszytometrie zeigte hingegen erfolgreiche Ergebnisse. Mit Hilfe von Zeitreihen konnte der optimale Zeitpunkt der Inkubation mit den Induktoren vor der duchflusszytometrischen Untersuchung bestimmt werden. Dieser lag bei drei Minuten. Durch die Verwendung verschiedener Induktoren konnte eine Phosphorylierung der SRC-, SYK- und AKT1/2/3-Kinasen gezeigt werden. Bei der SRC-Kinase eigneten sich besonders TRAP-6, U46619 und Kollagen als potente Induktoren. Bei der SYK-Kinase waren es U46619, TRAP-6, Convulxin und ADP. Zusätzlich zeigte die SYK-Kinase in der Negativkontrolle die geringste Hintergrund-Phosphorylierung. Zur niedrigsten nachweisbaren Phosphorylierung kam es bei der AKT1/2/3-Kinase. Eine Induktion mit TRAP-6 zeigte dabei die für AKT1/2/3 stärkste Phosphorylierung. Durchflusszytometrisch war somit eine gute Darstellung der Phosphorylierung der verwendeten drei Kinasen durch kleinsten Blutmengen möglich. Für die gezielten Inhibitionsversuche dieser Arbeit wurde unter anderem die Medikamentenfamilie der Sartane zur GPVI-Rezeptorinhibition verwendet. Es zeigte sich, dass besonders bei der Induktion mit U46619 und Verwendung eines Vertreters der Familie der Sartane bei allen drei Kinasen die Phosphorylierung der Kinase deutlich gesenkt werden konnte. Die Phosphorylierung lag durch die Inkubation (1 min) mit einem Sartan auf dem Niveau der Negativkontrolle. Bei Induktion mit Convulxin und Verwendung von Losartan steigerte sich hingegen die Phosphorylierung bei allen drei Kinasen. Bei durchflusszytometrischer Untersuchung von Patientenblut, bei in vivo-Einnahme von Telmisartan, konnte im Vergleich mit drei gesunden Spendern gezeigt werden, dass die Phosphorylierung der SRC-Kinase bei Convulxin und Kollagen deutlich reduziert ist. In der Aggregometrie nach Born konnte bei allen verwendeten Sartanen eine Reduktion der Thrombozytenaggregation nachgewiesen werden. Die weiteren Versuche mit dem PAR4-Rezeptorblocker Vorapaxar, zeigte im Durchflusszytometer bei der AKT1/2/3-Kinase keine Reduktion. Stattdessen konnte hier in der höchsten verwendeten Konzentration, sogar eine Zunahme der Phosphorylierung beobachtet werden. In der parallel durchgeführten Aggregometrie nach Born zeigte sich hingegen eine komplette Hemmung der Thrombozytenaggregation. Um festzustellen, ob Proben für die Untersuchungen mit dem Durchflusszytometer versendet werden können, wurden in einem letzten Schritt erneut Lagerungsversuche durchgeführt. Durch die verwendeten Lagerungszeiträume sollte die Dauer, die durch den Transport bei einer Zentralisierung zustande kommt, imitiert werden. In dem durchgeführten Untersuchungsansatz war eine Lagerung über den Tag 0 nicht möglich. Zu einem späteren Zeitpunkt waren nur noch wenige bis keine Thrombozyten nachweisbar.

For the last two decades, heparins have been widely used as anticoagulants. Besides numerous advantages, up to 5% patients with heparin administration suffer from a major adverse drug effect known as heparin-induced thrombocytopenia (HIT). This typical HIT can result in deep vein thrombosis, pulmonary embolism, occlusion of a limb artery, acute myocardial infarct, stroke, and a systemic reaction or skin necrosis. The basis of HIT may lead to clinical insights. Recent studies using single-molecule force spectroscopy (SMFS)-based atomic force microscopy revealed detailed binding mechanisms of the interactions between platelet factor 4 (PF4) and heparins of different lengths in typical HIT. Especially, SMFS results allowed identifying a new mechanism of the autoimmune HIT caused by a subset of human-derived antibodies in patients without heparin exposure. The findings proved that not only heparin but also a subset of antibodies induce thrombocytopenia. In this review, the role of SMFS in unraveling a major adverse drug effect and insights into molecular mechanisms inducing thrombocytopenia by both heparins and antibodies will be discussed.

Zusätzlich zu ihrer Zielstellung humane Thrombozyten auf das Vorkommen von NAP1L1 zu untersuchen, liefert diese Arbeit Anhalt für die potenzielle Funktion diese „nukleären“ Proteins in diesem anukleären Zelltyp. Eine Enflussnahme von NAP1L1 auf den Transport und ggf. Import eines Schlüsselenzyms des mitochondrialen Stoffwechsels (DLAT) erscheint als ein möglicher Mechanismus für die Einflussnahme auf systemische entzündliche Prozesse durch NAP1L1. Für humane Thrombozyten sind die beschriebenen Veränderungen von DLAT eine der ersten Hinweise auf eine aktive Regulation der intramitochondrialen Proteinausstattung in Reaktion auf die systemische Infektion mit bakteriellen und viralen Erregern. Bislang existierten in dieser Situation nur Daten, welche z.B. die direkte Beeinflussung von Plättchen durch Erreger, z.B. durch induzierte Degradation des anti-apoptotischen BcL-x208, beschreiben. In der Zukunft wird es wichtig sein zu ergründen, welche funktionellen Konsequenzen aus einer Mehr- oder Minderexpression von NAP1L1 im Bezug auf die thrombozytäre Mitochondrienfunktion entstehen, im Weiteren welchen pathophysiologischen Stellenwert diese Änderungen besitzen und wie man diese dann therapeutisch beeinflussen kann. Fest steht, dass die in der Einleitung aufgeworfene Frage, ob die im Rahmen einer akuten, systemischen Entzündungsreaktion beobachteten metabolischen Veränderungen eher Ausdruck einer aktiven Regulation als eines pathologischen Defektes sind, auch auf die humanen Thrombozyten übertragen werden muss.

Für die Hemmung der plasmatischen Gerinnung kommen orale und parenterale Antikoagulantien in Betracht. Bei stationären Patienten spielt das parenteral verabreichte Heparin, vorkommend als höher- und niedermolekulares Heparin, die größte Rolle. Neben Blutungskomplikationen, kann Heparin auch die gefürchtete Nebenwirkung Heparin-induzierte Thrombozytopenie auslösen. Aufgrund der Bildung von Immunkomplexen durch Bindung von Antikörpern an Komplexe aus PF4 und Heparin, kommt es zu einer Thrombozytenaggregation mit eventuell auftretenden Thromboembolien. Das Risiko für diese Entstehung erhöht sich mit steigender Kettenlänge des Heparins, mit einer zehnfach erhöhten Prävalenz bei UFH gegenüber LMWHs. Das Protein PF4 ist ein tetrameres Protein aus der Familie der CXC-Chemokine und wird in den α-Granula der Thrombozyten gespeichert. Durch deren positive Ladung zeigt es eine hohe Affinität zu negativ geladenem Heparin, wodurch antigene Komplexe aufgrund der strukturellen Veränderung des PF4s formiert werden. In dieser Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Heparine mit aufsteigender Kettenlänge auf die Struktur von PF4 getestet und untersucht, inwieweit ein Polysaccharid mit einem bestimmten Sulfatierungsgrad in Kombination mit einem Standardheparin die Antigen/Antikörper-Interaktion von PF4/Heparin-Antikörper verändern kann. Hierfür kamen unterschiedliche Verfahren zum Einsatz. Hauptaugenmerk wurde auf den Zirkulardichroismus gelegt, mit deren Hilfe die Sekundärstruktur und Konformationsänderung von PF4 im Zusammenspiel mit den Heparinen und Polysacchariden untersucht werden kann. Für den Nachweis von antigenen PF4/Heparin-Komplexen wurde der Enzym-gekoppelte Immunologische Test ELISA und der Heparin-induzierte Plättchenakivierungstest (HIPA) angewendet. Die durch die Standardheparine ausgelöste Änderung der Konfirmation von PF4 lässt sich durch die Zugabe des synthetisch hergestellten Polysaccharids 12mer-3, das 12 Sulfatgruppen hat, hemmen. Dies war nicht mit den anderen synthetischen 12mer-Polysacchariden möglich. Auch zeigte sich keine Interaktion von 12mer-3 auf die Wechselwirkung von PF4 mit 12mer-6, welche durch die geringere Anzahl an Sulfatgruppen des 12mer-3 zu interpretieren ist. Die Bindung von humanen anti-PF4/Heparin-Antikörpern wurde mit ELISA und dem Funktionstest HIPA untersucht. Hier wurden sieben menschliche Seren mit enthaltenen Anti-PF4/Heparin-IgG-Ak verwendet und nach Hinzugabe der synthetischen Polysaccharide die Ak-Bindung an den antigenen PF4/Heparin-Komplexen und die nachfolgende Thrombozytenaggregation getestet. Das wichtigste Ergebnis dieser Arbeit ist, dass das Polysaccharid 12mer-3die Struktur von PF4 in PF4/Heparin-Komplexen verändert und dadurch die Bindung von PF4/Heparin-Antikörper reduziert. Durch eine gleichzeitige Gabe von Heparin zusammen mit dem Polysaccharid 12mer-3, könnte das Risiko der unerwünschten Arzneimittelwirkung Heparin-induzierte Thrombozytopenie reduziert werden. Neben der klinischen Wichtigkeit des Ergebnisses, bietet die hier vorliegende Dissertation auch eine Reihe von Ansatzpunkten für weitere Projekte. Zu nennen wäre hier beispielsweise die Testung der Reaktionen von 12mer-3 in Wechselwirkung mit den Standardheparinen UFH, Reviparin und Enoxaparin und 12mer-3 in Kombination mit 12mer-6 im ELISA und im HIPA, um eine Kongruenz hinsichtlich der bereits durchgeführten CD-Messungen zu liefern. Auch wäre es in klinischen Studien interessant herauszufinden, ob die Expression des Antigens auf PF4/Heparin-Komplexe auch in vivo gehemmt werden könnte. Weiterhin kann unser Ansatz zur Synthese von sichereren Wirkstoffen führen, die an PF4 binden.

Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen des demographischen Wandels auf die Blutversorgung in Mecklenburg-Vorpommern (MV) zu analysieren. Dabei sollten Grundlagen für die Entwicklung von gesundheitspolitischen Strategien geschaffen werden, um einem Defizit in der Versorgung entgegenwirken zu können. Durch eine prospektive Longitudinalstudie mit Daten zu allen Vollblutspendern und Empfängern von Erythrozytenkonzentraten (EK) in MV in den Jahren 2005, 2010 und 2015 wird die Versorgungskette vollständig abgebildet. Derartige Informationen liegen zum jetzigen Zeitpunkt für kein anderes Bundesland vor. Es konnte gezeigt werden, dass die demographischen Veränderungen durch eine Abnahme der Spenderzahlen zu einem ausgeprägten Rückgang der Vollblutspenden geführt haben (-18,0%). Dies wird verstärkt durch einen Rückgang der Spendebereitschaft um -10,6% insbesondere bei den <30-Jährigen. Gleichzeitig konnte trotz alternder Bevölkerung auch der Blutbedarf dank des medizinischen Fortschritts um 13,5% reduziert werden. Dennoch deckten bereits im Jahr 2015 die gewonnenen Blutspenden nur noch knapp den Blutbedarf der Patienten. Die durchgeführten Vorausberechnungen für 2030 lassen erwarten, dass es mit einem Defizit von circa 18.000 EK zu erheblichen Versorgungsproblemen im Bundesland kommen wird, wenn Spendebereitschaft und Transfusionsbedarf auf dem Niveau von 2015 verbleiben. Die demographische Situation Mecklenburg-Vorpommerns ist denen der westlichen Bundesländer Deutschlands circa 10 Jahre voraus. Damit nimmt Mecklenburg- Vorpommern als Modellregion eine Vorreiterrolle bezüglich der Bewältigung der damit einhergehenden Herausforderungen für die Blutversorgung ein. Um den Blutbedarf der Patienten langfristig und überregional decken zu können, wird in Zukunft eine noch engere interdisziplinäre Kooperation von Blutspendediensten, Krankenhäusern und Gesundheitspolitik sowohl auf Landes- als auch Bundesebene notwendig sein.