Klinik und Poliklinik für Innere Medizin Abt. Gastroenterologie, Endokrinologie und Ernährungsmedizin
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Zusammenfassung
Die chronische Pankreatitis ist eine durch wiederkehrende Entzündungsschübe gekennzeichnete Erkrankung des Pankreas, die meist mit einem ausgeprägten Verlust der endokrinen und exokrinen Organfunktion verbunden ist. Der Übergang einer akut rekurrierenden in eine chronische Form ist meist fließend.
Trotz der prinzipiell unbekannten Ätiologie sind mit Mutationen in u.a. dem SPINK1- und CFTR- Gen bereits genetische Risikofaktoren für die Entstehung einer idiopathischen Pankreatitis beschrieben. Für die bisher am umfangreichsten untersuchte Leu26Val-Mutation im CTSB existieren unterschiedliche Konklusionen in indischen und europäischen Arbeitsgruppen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Patientenkohorten auf Sequenzvarianten im Bereich des Promotors, der 5’UTR und des Translationsstartes des CTSB als Risikofaktoren für die idiopathische Pankreatitis und deren möglicher Einfluss auf die Entstehung von Spleißvarianten und die Genexpression untersucht und mit lokalen Blutspendern sowie der europäischen Kontrollkohorte des 1000-Genome-Projektes verglichen. Hierfür wurden 278 Patienten mit einer idiopathisch chronischen und 83 Patienten mit einer idiopathisch akut rekurrierenden Pankreatitis mittels bidirektionaler Sanger-Sequenzierung und Taqman-Assays genotypisiert.
Besonders hervorzuhebende SNP sind die beiden Missense-Varianten c.76C>G (Leu26Val) und c.157A>G (Ser53Gly) sowie der zwar nur bei einem Patienten detektierte, aber direkt innerhalb der Exon-/Intron-Grenze lokalisierte c.-100+1G>A. Die Varianten c.76C>G und c.157A>G zeigten bei Pankreatitis-Patienten eine signifikant geringere Prävalenz als bei den Kontrollen. Für weitere Varianten fanden sich keine signifikanten Assoziationen mit der idiopathischen Pankreatitis.
Bei der Haplotypenanalyse kam der Haplotyp TCGCG mit den mutierten Allelen der beiden Missense-Mutationen ebenfalls bei Pankreatitis-Patienten signifikant seltener als bei den Kontrollen vor.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Grundlage für die Untersuchung der Assoziation zwischen unterschiedlichen Transkriptionsstartpunkten im Promotorbereich des CTSB-Gens und der Genexpression geschaffen. Hierfür wurden Reportergenkonstrukte aus dem pEGFP1-Vektor, SV40-Promotor und den Spleißvarianten 1, 2 und 4 des CTSB in HEK293- und PatuT-Zellen stabil transfiziert und die Genexpression mittels Fluoreszenzmikroskopie gezeigt.
Anhand dieser Arbeit erscheinen Sequenzvarianten im CTSB zwar weiterhin möglich, wenn auch unwahrscheinlich als Risikofaktoren für die idiopathische Pankreatitis. Anhand der erstellten Reportergenkonstrukte kann der Hypothese zur unterschiedlichen Aktivität des CTSB in pankreatischem Gewebe, hervorgerufen durch verschiedene Spleißvarianten des Gens, weiter nachgegangen werden.
Infolge des Verlustes von exokriner und endokriner Pankreasfunktion besteht bei Patienten mit chronischer Pankreatitis ein erhöhtes Mangelernährungsrisiko. Zu Früherkennung, Diagnostik und Therapie von Mangelernährung bei dieser Krankheitsentität liegen indes nur unzureichende Erkenntnisse vor. Ziel dieser Arbeit ist es daher, die bestehenden Wissenslücken hinsichtlich Risikofaktoren, Früherkennung und Behandlung von Mangelernährung bei chronischer Pankreatitis zu schließen.
Zur Identifizierung von Behandlungsansätzen erfolgte mittels einer systematischen Übersichtsarbeit mit Metaanalyse eine Auswertung der Evidenz aus randomisierten kontrollierten Studien. Risikofaktoren, Phänotyp und gesundheitliche Folgen der Mangelernährung wurden in einer prospektiven multizentrischen Querschnittstudie untersucht. Schließlich erfolgte die Testung der Umsetzbarkeit und des Effekts einer intensivierten ernährungsmedizinischen Therapie im Rahmen einer einarmigen Machbarkeitsstudie.
Die systematische Übersichtsarbeit mit Metaanalyse ergab, dass hinsichtlich der Behandlung von Mangelernährung bei chronischer Pankreatitis nur sehr begrenzt Daten aus hochwertigen randomisierten kontrollierten Studien vorliegen. Aktuelle Empfehlungen basieren daher in der Regel auf Erkenntnissen aus Beobachtungsstudien oder Expertenmeinungen. In der Querschnittstudie zeigte sich, dass eine Mangelernährung bei etwa zwei Dritteln der Patienten vorlag. Die mangelernährten Individuen wiesen häufiger eine kürzere Krankheitsdauer sowie eine höhere Krankheitsschwere auf. Der Phänotyp der Mangelernährung war insbesondere durch den Verlust von Muskelmasse nicht aber -funktion charakterisiert und trat bei Vorliegen einer schweren Mangelernährung ausgeprägter in Erscheinung als bei moderatem Schweregrad. Infolge der intensivierten Ernährungstherapie konnten diese pathologischen Veränderungen teilweise umkehrt werden. Neben einer Gewichtssteigerung resultierte die Intervention in einer Zunahme an Muskelmasse sowie einer Verbesserung des Krankheitsschweregrades. Hinsichtlich der Umsetzbarkeit konnte für die meisten Interventionskomponenten eine hohe Compliance beobachtet werden. Zudem ergab sich nur eine geringe Dropout-Rate im Interventionsverlauf.
Mangelernährung stellt in der Tat eine häufige Komplikation der chronischen Pankreatitis dar und ist insbesondere durch eine verringerte Muskelmasse charakterisiert. Hierdurch ist die Muskelfunktion zwar kaum kompromittiert, allerdings geht dieser Zustand mit einer höheren Krankheitsschwere einher. Eine intensivierte ernährungsmedizinische Therapie bei mangelernährten Patienten mit chronischer Pankreatitis ist umsetzbar und verbessert effektiv den Ernährungszustand, aber auch funktionale und prognostische Parameter. Anschließende Untersuchungen sind indes erforderlich, um Früherkennung und Behandlung weiter zu optimieren und die notwendige Evidenz für starke Empfehlungen zu generieren.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass miR-502 in vitro in der pankreatischen Tumorzelllinie
PaTuT Proteine des cNHEJ supprimiert. Dazu wurden in PaTuT-Zellen die miR-502
überexprimiert und mittels qPCR, Luciferase-Assay und Western-Blot die mRNA sowie die
Proteinmenge im Bezug zu einer Kontrollgruppe bestimmt. Dabei konnte gezeigt werden, dass
sowohl die Proteine Ku70 und XLF herunterreguliert werden, als auch deren mRNAs, während
Ku80 nur auf Proteinebene signifikante Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte.
Für Ligase 4, die in Vorversuchen der Arbeitsgemeinschaft Moskwa auch potentiell von miR-
502 inhibiert wurde, konnten keine Unterschiede zur Kontrollgruppe festgestellt werden.
Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass miR-502 am stärksten in der G1 und S-Phase des
Zellzyklus exprimiert ist und somit in den Phasen, indem das cNHEJ inhibiert ist. Damit ist
miR-502 die erste bekannte miRNA, die mehrere Proteine des cNHEJ reguliert und daher eine
interessante miRNA für einen möglichen Therapieansatz. Eine Verschiebung des Zellzyklus
durch miR-502 konnte nicht nachgewiesen werden. Dies kann durch Zelllinien-spezifische
Unterschiede verursacht worden sein. Nach Bestrahlung der Zellen konnte gezeigt werden, dass
Zellen mit überexprimierter miR-502 nach Bestrahlung mehr Doppelstrangbrüche aufwiesen
und nach Bestrahlung weniger Zellen überlebten, was darauf hinweist, dass Zellen mit
überexprimierter miR-502 die Doppelstrangbrüche schlechter reparieren können.
In dieser Arbeit wurden drei Fragestellungen bearbeitet:
1. Welche Rolle spielt TNF-α bei der durch Gangligatur-induzierten Pankreatitis und der resultierenden Fibrose des Pankreasgewebes?
2. Welche Rolle spielt TNF-α für die Einwanderung von Zellen der angeborenen Immunantwort in das Pankreasgewebe und die Freisetzung von Zytokinen (außer TNF-α) bei der im Gangligatur-induzierten Pankreatitis?
3. Ist TNF-α ein therapeutisches Target der Pankreatitis?
Um diese Fragen beantworten zu können, wurden Experimente mit zwei Tiermodellen durchgeführt. Im ersten Teil wurden Wildtyp Mäuse mit TNF-α knock out Mäusen verglichen. Da knock-out Tiere immer ein Modell darstellen, welches physiologischer Weise nicht vorkommt, sind Ergebnissen mit knock-out Tieren mit Vorsicht zu betrachten. Zusätzlich sollte eine therapeutische Hemmung des TNF α Signalswegs mittels Gabe eines blockierenden Antikörpers untersucht werden. Daher wurden im zweiten Teil die gleichen Experimente wiederholt mit Wildtyp Mäusen bei denen TNF-α durch einen monoklonalen Antikörper blockiert wurde. Auch hier wurden die Ergebnisse mit Wildtyp Mäusen verglichen.
Es lässt sich mit den Ergebnissen dieser Arbeit klar beantworten, dass TNF-α, im Modell der Gangligaturpankreatitis, im Hinblick auf die resultierende Fibrose eine eher untergeordnete Rolle spielt. Dies konnten wir in beiden Versuchsreihen feststellen. Die gemessene Fibrose, anhand der Masson-Goldner-Färbung und der prozentual gemessenen gefärbten Fläche, zeigte in beiden Versuchsgruppen einen vergleichbaren, sehr regelhaften Beginn, signifikante Unterschiede ergaben sich auch zu späteren Zeitpunkten nicht (siehe Ergebnisse Fibrose).
Auch können wir sagen, dass das Fehlen von TNF-α zu einer verstärkten pro-inflammatorischen Immunantwort in der Initialphase der Pankreatitis führt. Diese betrifft das angeborene Immunsystem, vor allem neutrophile Granulozyten. Dies konnten wir sowohl systemisch (siehe Ergebnisse MPO) als auch lokal im Pankreas nachweisen (Ergebnisse CD45, Ly6g und Il-6). MCP1 und IFNγ, weitere Zytokine, die eine Rolle in der pro- und anti- inflammatorischen Immunreaktion spielen wurden gemessen, zeigten jedoch keine signifkanten Unterschiede. IL-12 (pro- inflammatorisch) und IL-10 (anti- inflammatorisch) zeigten höhere Serumspiegel in der Gruppe der TNF-α Knock-out Tiere, da IL-12 bereits an Tag 0 erhöht war gehen wir hier von keiner durch die Pankreatitis ausgelösten Reaktion aus. Da die Erhöhung von IL-10 in den TNF-α -/- Tieren für eine erhöhte anti- inflammatorische Reaktion sprechen, stehen diese Ergebnisse jedoch mit den vorherigen Ergebnissen, dass TNF-α -/- Tiere eine erhöhte pro- inflammatorischen Antwort zeigen im Widerspruch (siehe Ergebnisse Il-12 und Il-10).
Bemerkenswert ist die mögliche Rolle von CD4 positiven T-Lymphozyten, welche bei der Pankreatitis nur eine sehr untergeordnete Rolle spielen. In unseren Experimenten zeigte sich jedoch ein klarer Unterschied zwischen Wildtyp Mäusen und TNF-α Knock-out Tieren. Während bei den Wildtyp Tieren wie in der Literatur beschrieben keine CD4 positiven Lymphozyten im Pankreasgewebe nachgewiesen werden konnten, haben wir zu allen Zeitpunkten in der Gruppe der TNF-α Knock-out Tiere CD4 positive Lymphozyten im entzündeten Pankreasgewebe nachweisen können. Dieses Ergebnis ist ein möglicher Hinweis darauf, dass TNF-α die Einwanderung der CD4 positiven Lymphozyten bei der Pankreatitis inhibiert (siehe Ergebnisse CD4).
Die Ergebnisse dieser Arbeit stehen teilweise im Gegensatz mit publizierten Studien, die gezeigt haben, dass das Fehlen von TNF-α zu einem geringeren Gewebeschaden und somit zu einer weniger schweren Pankreatitis und in Folge Fibrose des Pankreasgewebes führt. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, dass das Gangligatur-Modell eine zu schwer ausgeprägte Pankreatitis auslöst, sodass durch die massiven Effekte der Gewebezerstörung mögliche zusätzliche Effekte von TNF-α bzw. das nicht Vorhandensein von TNF-α nicht mehr ausreichend sensitiv gemessen werden konnten. Dies sollte in weiteren Experimenten überprüft werden.
Die vorgelegte Arbeit beantwortet die drei gestellten Fragen:
1. TNF-α spielt bei der im Gangligatur-induzierten Pankreatitis und der resultierenden Fibrose des Pankreasgewebes nur eine untergeordnete Rolle.
2. TNF-α spielt für die Einwanderung von Zellen der angeborenen Immunantwort in das Pankreasgewebe und die Freisetzung von Zytokinen (außer TNF-α) bei der durch Gangligatur-induzierten Pankreatitis keine entscheidende Rolle hinsichtlich der maximalen Einwanderung/Freisetzung, beeinflusst aber die Dynamik der Entzündungsantwort. TNF-α scheint die Einwanderung von T-Lymphozyten in das Pankreasgewebe bei Pankreatitis zu hemmen.
3. TNF-α ist wahrscheinlich kein geeignetes therapeutisches Target zur Behandlung der schweren akuten Pankreatitis.
Das duktale Adenokarzinom des Pankreas gehört zu den Tumorentitäten mit geringen therapeutischen Möglichkeiten. Neue Erkenntnisse über relevante Signalwege in der Tumorprogression und Metastasierung sind daher von hoher Relevanz für den klinischen Alltag. Die vorliegende Arbeit untersuchte den Einfluss der Humanen neutrophilen Elastase (HNE) auf humane Pankreaskarzinomzelllinien über den Protease-aktivierten Rezeptor 2 (PAR-2).
In Immunfluoreszenzfärbung und Western Blot konnte gezeigt werden, dass PAR-2 von verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien exprimiert wird. Die HNE ist ein bekannter Aktivator dieses Rezeptors, wobei der zugrunde liegende Mechanismus einzigartig im Vergleich zu anderen Proteasen wie bspw. Trypsin ist. Im Folgenden wurden die grundlegenden Tumorcharakteristika wie gesteigerte Proliferation, Migration und Unabhängigkeit von externen Wachstumsfaktoren in verschiedenen Verfahren untersucht. Hierfür wurden neben der HNE das synthetische PAR-2- Aktivierungspeptid (SLIGKV) bzw. reverse Peptid (VKGILS) genutzt. Dabei zeigten sich signifikante Steigerungen von Migration und Proliferation im Scratch- bzw. MTT-Assay für HNE und SLIGKV, jedoch nicht für VKGILS. Auch nach kombinierter Inkubation mit HNE und VKGILS konnte kein signifikanter Unterschied zur Kontrolle festgestellt werden, was einen PAR-2-abhängigen Wirkmechanismus der HNE belegt. Eine Ausnahme bildet hierbei die Zelllinie Patu-89888T bezogen auf den Scratch-Assay. Dieser und weitere Unterschiede stellen die Komplexität der Interaktionen in verschiedenster Weise dar.
Des Weiteren zeigte die Inkubationen mit HNE und SLIGKV vergleichbare Ergebnisse im Western Blot bezüglich einer Aktivierung des MAP/Erk- und des PI3K/Akt-Signalweges.
Darüber hinaus steigern sowohl HNE als auch SLIGKV die Sekretion von Vascular endothelial growth factor wie mittels ELISA demonstriert werden konnte.
Abschließend kann also davon ausgegangen werden, dass die Effekte die HNE auf Pankreaskarzinomzelllinien in bedeutendem Maße über PAR-2 vermittelt werden. Hierbei werden verschiedene Signalkaskaden stimuliert, die letztendlich zu einer gesteigerten Proliferation, Migration und VEGF-Sekretion der Zellen führen. Sowohl eine Inhibition des PAR-2 als auch der HNE könnten daher neue mögliche Therapieoptionen darstellen.
Zusammenfassung:
Die akute Pankreatitis ist eine der häufigsten nicht-malignen Erkrankungen bei hospitalisierten Patienten, der verschiedenste pathophysiologische Prozesse zugrunde liegen. Während sie in den meisten Fällen komplikationslos ausheilt, wird jedoch in ca. 10 – 20 % der Fälle eine schwere Verlaufsform mit Ausbildung von Nekrosen und häufig auch weiteren lokalen und systemischen Komplikationen beobachtet. Zu diesen gehört beispielsweise eine sekundäre Infektion der Pankreasnekrosen, wobei sowohl bakterielle als auch fungale Krankheitserreger auftreten können. Obwohl einzelne Prädiktoren für einen schweren Verlauf der akuten Pankreatitis identifiziert werden konnten, erlaubt die bisherige Datenlage jedoch noch keine sichere Identifikation der infizierten Nekrose.
Ziel dieser Arbeit ist daher die Identifikation von klinischen und paraklinischen Variablen, die als mögliche Prädiktoren der infizierten Pankreasnekrose dienen können. Des Weiteren soll untersucht werden, inwieweit eine infizierte Nekrose die Krankenhausverweildauer sowie die extrapankreatischen Komplikationen und die Mortalität beeinflussen. Hierzu wurden die Befunde von insgesamt 127 Patienten mit akuter nekrotisierender Pankreatitis über den Zeitraum von 2012 – 2018 retrospektiv aufgearbeitet. Bei 51 Patienten ließ sich eine infizierte Nekrose nachweisen, bei 21 Patienten war die Nekrose steril und bei 55 Patienten wurde die Nekrose wiederum weder punktiert noch drainiert.
Es fand sich ein signifikanter Zusammenhang der Entzündungsparameter Leukozyten, CRP und PCT sowie der Nierenretentionswerte Kreatinin und Harnstoff mit dem Vorhandensein einer infizierten Pankreasnekrose. Auch eine kompromittierte Blutgerinnung, ein verminderter Serumalbuminspiegel sowie ein reduzierter Hämatokrit wurden deutlich häufiger bei der inifizierten nekrotisierenden Pankreatitis beobachtet. Bei den Vitalparametern fand sich eine Assoziation zwischen erhöhter Herzfrequenz und erniedrigtem mittleren arteriellen Blutdruck. Begleitend war eine infizierte Nekrose deutlich häufiger mit einem respiratorischen und/oder renalen Organversagen vergesellschaftet.
Die Krankenhausverweildauer war bei Patienten mit infizierter Nekrose um beinahe das Dreifache verlängert, wobei die Verweildauer bei Nachweis grampositiver Bakterien im Punktat am längsten war. Ein signifikanter Einfluss auf die Mortalität konnte bei infizierter Pankreasnekrose nicht beobachtet werden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass anhand von einfach zu erhebenden klinischen und laborchemischen Routineparametern die Identifikation einer Pankreasnekrose vorhergesehen werden kann. Welche Bedeutung einzelne Bakterienstämme auf den Verlauf der akuten nekrotisierenden Pankreatitis und ihre Komplikationen haben, muss in weiteren Analysen untersucht werden.
Die Regulation der adaptiven Immunantwort im Verlauf der schweren akuten Pankreatitis im Mausmodell
(2020)
Die akute Pankreatitis ist eine weit verbreitete gastrointestinale Erkrankung, die assoziiert sein kann mit Multiorganversagen und einer nicht unwesentlichen Mortalität. Die Pankreatitis beginnt mit einer sterilen Entzündung, die eine überschießende inflammatorische Immunantwort (SIRS) induzieren kann. Die dahinter stehenden Mechanismen sind bisher noch nicht verstanden und eine Behandlung aus diesem Grund schwierig.
Um die systemische Immunantwort während der Pankreatitis genauer zu untersuchen, wurde in dieser Studie in unterschiedlichen Mausstämmen (IL-12p40-, NLRP3- und IL-18 knockout Mäuse) eine akute Pankreatitis mittels Gangligatur und der Applikation von Caerulein induziert. Die Aktivierung der erworbenen Immunantwort wurde mittels durchflußzytometrischer Analyse der T-Zellen in der Milz gemessen. Die Differenzierung der T-Zellen zu Th1/Th2/Treg-Zellen wurde durch die Färbung der nukleären Transkriptionsfaktoren Tbet, Gata3 und FoxP3 und CD4+-Zellen untersucht.
Im Zuge dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des erworbenen Immunsystems abhängig von NLRP3 ist. Während der Pankreatitis zeigte sich eine klare Th2-Antwort in Abwesenheit einer Th1-Antwort. Diese Immunantwort war abhängig von IL-18 in Abwesenheit von IL-12. Die therapeutische Inhibition von NLRP3 zeigte eine deutliche Reduktion der T-Zell-Aktivierung und einen milderen Krankheitsverlauf der Pankreatitis.
Im Gegensatz zu anderen Arbeiten, die davon ausgehen, dass es erst zu einer überschießenden Inflammation (SIRS) und dann zu einer zu starken Gegenreaktion, Anti-Inflammation (CARS), kommt, konnte gezeigt werden, dass im Verlauf der Pankreatitis SIRS und CARS parallel verlaufen. Durch die Inhibition von NLRP3 kommt es zu einer milderen Immunantwort und milderen Krankheitsverlauf. Aus diesem Grund kann der Einsatz von Inhibitoren gegen NLRP3 ein guter therapeutischer Ansatz für den klinischen Alltag und bei der Behandlung der akuten Pankreatitis sein.
Background/Aims: To develop a clinically relevant immunocompetent murine model to study pancreatic cancer using two different syngeneic pancreatic cancer cell lines and to assess MRI for its applicability in this model. Methods: Two cell lines, 6606PDA and Panc02, were employed for the experiments. Cell proliferation and migration were monitored in vitro. Matrigel™ was tested for its role in tumor induction. Tumor cell growth was assessed after orthotopic injection of tumor cells into the pancreatic head of C57/BL6 mice by MRI and histology. Results: Proliferation and migration of Panc02 were significantly faster than those of 6606PDA. Matrigel did not affect tumor growth/migration but prevented tumor cell spread after injection thus avoiding undesired peritoneal tumor growth. MRI could reliably monitor longitudinal tumor growth in both cell lines: Panc02 had a more irregular finger-like growth, and 6606PDA grew more spherically. Both tumors showed local invasiveness. Histologically, Panc02 showed a sarcoma-like undifferentiated growth pattern, whereas 6606PDA displayed a moderately differentiated glandular tumor growth. Panc02 mice had a significantly shorter (28 days) survival than 6606PDA mice (50 days). Conclusion: This model closely mimics human pancreatic cancer. MRI was invaluable for longitudinal monitoring of tumor growth thus reducing the number of mice required. Employing two different cell lines, this model can be used for various treatment and imaging studies.