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Streptococcus pneumoniae remains a significant global threat, with existing vaccines having important limitations such as restricted serotype coverage and high manufacturing costs. Pneumococcal lipoproteins are emerging as promising vaccine candidates due to their surface exposure and conservation across various serotypes. While prior studies have explored their potential in mice, data in a human context and insights into the impact of the lipid moiety remain limited. In the present study, we examined the immunogenicity of two pneumococcal lipoproteins, DacB and MetQ, both in lipidated and non-lipidated versions, by stimulation of primary human immune cells. Immune responses were assessed by the expression of common surface markers for activation and maturation as well as cytokines released into the supernatant. Our findings indicate that in the case of MetQ lipidation was crucial for activation of human antigen-presenting cells such as dendritic cells and macrophages, while non-lipidated DacB demonstrated an intrinsic potential to induce an innate immune response. Nevertheless, immune responses to both proteins were enhanced by lipidation. Interestingly, following stimulation of dendritic cells with DacB, LipDacB and LipMetQ, cytokine levels of IL-6 and IL-23 were significantly increased, which are implicated in triggering potentially important Th17 cell responses. Furthermore, LipDacB and LipMetQ were able to induce proliferation of CD4+ T cells indicating their potential to induce an adaptive immune response. These findings contribute valuable insights into the immunogenic properties of pneumococcal lipoproteins, emphasizing their potential role in vaccine development against pneumococcal infections.

In den Industrieländern zählen kardiovaskuläre Erkrankungen zu den häufigsten Todesursachen. Pathologische linksventrikuläre Hypertrophie (LVH) und Herzinsuffizienz mit reduzierter Ejektionsfraktion (HFrEF) sind mit einer erhöhten Morbidität und Mortalität der betroffenen Patienten assoziiert. Bei der pathologischen LVH kommt es zu einer inadäquaten Reaktion des Herzens (maladaptives Remodeling) auf verschiedene Stressreize, wie z.B. Drucküberlastung durch eine Aortenklappenstenose oder eine arterielle Hypertonie. Das kardiale Remodeling wird von Kardiomyozyten-Hypertrophie, interstitieller und perivaskulärer Fibrose begleitet. Damit einhergehend kommt es zu Veränderungen des kardialen Proteoms und zu einem Anstieg kardialer Stressmarker (ANF, BNP, α-Skelett-Aktin) sowie zu einer Verschiebung des Verhältnisses von α-MyHC zu β-MyHC. Unter physiologischen Bedingungen ist der Stoffwechsel des Herzens überwiegend auf die Verwertung freier Fettsäuren durch die Fettsäureoxidation (FAO) und nur in geringem Maße auf die Verwertung von Glukose durch die Glukoseoxidation (GO), Laktat, Ketonkörpern und Aminosäuren zur ATP-Generierung ausgerichtet. Unter pathologischen Bedingungen, wie bei LVH und HFrEF, kommt es zu einer metabolischen Verschiebung, die sich in einer verminderten FAO und einer erhöhten GO äußert und als metabolisches Remodeling bezeichnet wird. Untersuchungen zum Zusammenhang zwischen metabolischem und kardialem Remodeling haben gezeigt, dass das metabolische Remodeling den strukturellen Störungen (kardialem Remodeling) in den Kardiomyozyten vorausgeht. Ein Regulator metabolischer Prozesse ist der nährstoffsensitive Transkriptionsfaktor EB (TFEB). TFEB fördert die Expression von Genen, die an der FAO (PGC-1α/PPARGC1A, PPARα/PPARA), der GO (HKII/HK2, GLUT1/SLC2A1, GLUT4/SLC2A4, und IRS2/IRS2) und der Energiegewinnung durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS, Komplex I-V) beteiligt sind. TFEB könnte daher eine Rolle beim stressinduzierten metabolischen Remodeling des Herzens spielen. In bereits publizierten Arbeiten führte die Überexpression von TFEB in murinen Herzen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu einem erhöhten kardialen Remodeling und einer reduzierten Herzfunktion. Aus diesen Erkenntnissen wurde folgende Hypothese formuliert: "Die Deletion von Tfeb im Herzen verhindert das kardiale Remodeling durch Unterdrückung des metabolischen Remodelings und führt so zu einer verbesserten Herzfunktion unter chronischer Drucküberlastung". Zur Bestätigung dieser Hypothese wurde im ersten Teil dieser Arbeit untersucht, ob eine Kardiomyozyten-spezifische Deletion von Tfeb das metabolische und kardiale Remodeling in männlichen Mäuseherzen während einer durch TAC-induzierten LVH und HFrEF beeinflusst und ob die Deletion von Tfeb zu einer Verbesserung der Herzfunktion führt. Die Untersuchungen zeigten, dass unter physiologischen Bedingungen die Kardiomyozyten-spezifische Deletion von Tfeb (TfebloxP/loxP; αMHC-CRE; cKO) im Vergleich zu Kontrollen (TfebloxP/loxP; WT) zu einer leicht verminderten Herzfunktion und zu einem kardialen und metabolischen Remodeling führt. Um den Einfluss der Tfeb-Deletion unter pathologischen Bedingungen zu untersuchen, wurde in WT- und cKO-Mäusen eine LVH bzw. HFrEF durch 21- bzw. 56tägige transversale Konstriktion der Aorta thorakalis (TAC, 27G) induziert. Schein-operierte Geschwistertiere, die derselben Prozedur unterzogen wurden, allerdings ohne Aortenkonstriktion, wurden als Kontrollen verwendet. Die 21-tägige TAC-Behandlung führte zu LVH und die 56-tägige TAC-Behandlung führte zu HFrEF sowohl bei WT- als auch bei cKO-Mäusen. Morphologische, histologische und qRT-PCR-Analysen zeigten ein erhöhtes Herzgewicht, interstitielle Fibrose und eine Zunahme der Expression kardialer Stress- und Remodeling-Gene bei LVH und HFrEF in cKO- und WT-Mäusen, respektive. Proteomanalysen der Herzen zeigten eine Hemmung der FAO und der OXPHOS in HFrEF, was auf eine Verschiebung des Metabolismus von FAO zu GO hinweist. Im LVH-Modell wurden keine Veränderungen der Herzfunktion, wenige Unterschiede im metabolischen Remodeling, jedoch ein erhöhtes kardiales Remodeling in cKO- im Vergleich zu WT-Mäusen beobachtet. Im Modell der HFrEF zeigte der cKO eine verbesserte linksventrikuläre Ejektionsfraktion, Verkürzungsfraktion und Herzzeitvolumen. Damit einhergehend zeigten die cKO Tiere eine weniger starke Zunahme der linksventrikulären Masse, kleinere Myozyten-Querschnittsflächen und ein geringeres Herzgewicht als die WT-Tiere nach TAC. Im Modell der LVH zeigten die cKO Tiere ein erhöhtes kardiales Remodeling wohingegen im Modell der HFrEF ein geringerer Anstieg von Myh7 und β-MyHC zwischen cKO- und WT-Mäusen gefunden wurde. Diese Daten zeigen, dass die cKO-Mäuse eine bessere Herzfunktion in der TAC-induzierten Drucküberlastung haben und dass eine Verminderung von TFEB im Modell der HFrEF von Vorteil sein könnte. Hinsichtlich des metabolischen Remodelings wurden keine Unterschiede zwischen cKO- und WT-Mäusen gefunden. Aufgrund der Ergebnisse des ersten Teils dieser Arbeit stellte sich die Frage, ob die Überexpression von TFEB das metabolische Remodeling bzw. die Energiehomöostase in Kardiomyozyten stärker beeinflusst als die Deletion von Tfeb. Daher wurden im zweiten Teil dieser Arbeit die Veränderungen der zellulären Atmung, der ATP-Produktionsraten und die metabolischen Veränderungen im Proteom nach Überexpression von TFEB in Kardiomyozyten untersucht. Die Überexpression von TFEB in Kardiomyozyten führte zu einer Verschiebung der metabolischen Aktivität von einer primär OXPHOS-orientierten Atmung hin zu einer stärker glykolytisch-orientierten Atmung und insgesamt zu einer erhöhten (energiereicheren) metabolischen Aktivität bzw. Atmung. Dies war mit einer höheren ATP-Produktionsrate und einer Zunahme der maximalen Atmung und der Reserve Atmungskapazität assoziiert. Die erhöhte Reserve Atmungskapazität ermöglicht es den Kardiomyozyten, besser auf einen erhöhten Energiebedarf zu reagieren und erhöht die Flexibilität der Kardiomyozyten in Stresssituationen. Das Proteom zeigte, dass die Überexpression von TFEB die Abundanz mitochondrialer Proteine erhöht und die OXPHOS aktiviert. Diese Ergebnisse zeigen den positiven Einfluss von TFEB auf den Energiemetabolismus und seinen Einfluss auf das metabolische Remodeling in Kardiomyozyten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Überexpression und Deletion von Tfeb in Kardiomyozyten in Abhängigkeit von den vorherrschenden physiologischen und pathologischen Bedingungen (LVH und HFrEF) sowohl positive als auch negative Auswirkungen auf die Energiehomöostase und die Herzfunktion haben kann. Schlüsselwörter: TFEB, linksventrikuläre Hypertrophie, Herzinsuffizienz mit reduzierter Ejektionsfraktion, metabolisches Remodeling, Fettsäureoxidation, transversale Aorten-Konstriktion.

Binding of general transcription factors TFIID and TFIIA to basal promoters is rate-limiting for transcriptional initiation of eukaryotic protein-coding genes. Consequently, activator proteins interacting with subunits of TFIID and/or TFIIA can drastically increase the rate of initiation events. Yeast transcriptional activator Ino2 interacts with several Taf subunits of TFIID, among them the multifunctional Taf1 protein. In contrast to mammalian Taf1, yeast Taf1 lacks bromodomains which are instead encoded by separate proteins Bdf1 and Bdf2. In this work, we show that Bdf1 not only binds to acetylated histone H4 but can also be recruited by Ino2 and unrelated activators such as Gal4, Rap1, Leu3 and Flo8. An activator-binding domain was mapped in the N-terminus of Bdf1. Subunits Toa1 and Toa2 of yeast TFIIA directly contact sequences of basal promoters and TFIID subunit TBP but may also mediate the influence of activators. Indeed, Ino2 efficiently binds to two separate structural domains of Toa1, specifically with its N-terminal four-helix bundle structure required for dimerization with Toa2 and its C-terminal β-barrel domain contacting TBP and sequences of the TATA element. These findings complete the functional analysis of yeast general transcription factors Bdf1 and Toa1 and identify them as targets of activator proteins.

Transcriptional corepressors Sin3, Cyc8 and Tup1 are important for downregulation of gene expression by recruiting various histone deacetylases once they gain access to defined genomic locations by interaction with pathway-specific repressor proteins. In this work we systematically investigated whether 17 yeast repressor proteins (Cti6, Dal80, Fkh1, Gal80, Mig1, Mot3, Nrg1, Opi1, Rdr1, Rox1, Sko1, Ume6, Ure2, Xbp1, Yhp1, Yox1 and Whi5) representing several unrelated regulatory pathways are able to bind to Sin3, Cyc8 and Tup1. Our results show that paired amphipathic helices 1 and 2 (PAH1 and PAH2) of Sin3 are functionally redundant for some regulatory pathways. WD40 domains of Tup1 proved to be sufficient for interaction with repressor proteins. Using length variants of selected repressors, we mapped corepressor interaction domains (CIDs) in vitro and assayed gene repression in vivo. Systematic comparison of CID minimal sequences allowed us to define several related positional patterns of hydrophobic amino acids some of which could be confirmed as functionally supported by site-directed mutagenesis. Although structural predictions indicated that certain CIDs may be α-helical, most repression domains appear to be randomly structured and must be considered as intrinsically disordered regions (IDR) adopting a defined conformation only by interaction with a corepressor.

Bei der familiären Form zerebraler kavernöser Malformationen (CCMs) handelt es sich um eine autosomal-dominant erbliche Erkrankung, die durch pathogene Keimbahnvarianten in den Genen CCM1/KRIT1, CCM2 bzw. CCM3/PDCD10 ausgelöst wird und mit einer Prävalenz von 1:3300 bis 1:3800 in der Allgemeinbevölkerung vorkommt. Neben Punktmutationen und kleinen Indels werden auch Strukturvarianten (SVs) in den Krankheitsgenen beobachtet. Diese sind jedoch mithilfe von Short-Read-basierten Genpanel- oder Exomsequenzierungen in der Routinediagnostik zum Teil nur schwer zu identifizieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher eine neue CRISPR/Cas9-basierte Nanopore-Sequenzierung der Gene CCM1, CCM2 und CCM3 sowie der flankierenden genomischen Regionen etabliert. Die Abdeckung der Zielregionen mit Reads länger als 20 kb erlaubte die zuverlässige Detektion von Kopienzahlveränderungen. Darüber hinaus konnte anhand einer interchromosomalen Insertion und einer 24 kb großen Inversion gezeigt werden, dass die Methode auch komplexere SVs nachweisen kann. Das Protokoll einer Cas9-basierten Sequenzierung ausgewählter genomischer Zielregionen auf der MinION-Plattform kann gut auf andere Fragestellungen übertragen werden und lässt sich mit vergleichsweise geringem Aufwand in vielen Laboren etablieren. Ein zweiter Schwerpunkt der Promotionsarbeit lag auf der Entwicklung neuer, vielseitig einsetzbarer Zellkulturmodelle der CCM-Erkrankung. Mithilfe CRISPR/Cas9-vermittelter Genomeditierungen in fluoreszenzmarkierten humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) konnten komplexe Kokulturmodelle sowie dreidimensionale vaskuläre Organoidkulturen etabliert werden. Anhand von aus CCM3-defizienten hiPSCs differenzierten humanen Endothelzellen (ECs) und vaskulären Mosaikorganoiden ließ sich ein klonaler Überlebensvorteil von CCM3-/--Zellen in Kokultur mit Wildtyp-Zellen nachweisen, welcher kürzlich auch in CCM-Mausmodellen als Schlüsselelement der CCM-Pathogenese beschrieben wurde. In den neuen Zellkulturmodellen ließ sich auch der positive Effekt des in der Greifswalder Arbeitsgruppe identifizierten Kandidatenwirkstoffs NSC59984 auf die tumorähnliche Proliferation von CCM3-/--Zellen in Kokultur validieren. Durch systematische RNA-Sequenzierungen konnte zudem nachgewiesen werden, dass CCM1 für die Differenzierung von ECs aus hiPSCs nicht erforderlich ist, jedoch die physiologische Funktion von ECs aufrechterhält. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeiten belegen nicht nur die Praktikabilität und Sicherheit der Identifizierung komplexer genomischer Strukturvarianten mittels CRISPR/Cas9-vermittelter Nanopore-Sequenzierungen, sondern sie ebnen zudem den Weg zur effektiven Testung neuer CCM-Therapieansätze im Hochdurchsatzverfahren und erlauben einen neuen Einblick in die noch immer unvollständig verstandene CCM-Pathogenese.