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The detection and discrimination of chemical signals are fundamental across the animal kingdom, and chemical senses like olfaction, gustation and chemoreception are key mechanisms for processing these cues. Although the olfactory sense organs and their associated neurons exhibit morphological variation, certain patterns are indicative of arthropod olfactory systems. Olfactory sensory neurons are associated with specialized sensory organs, the sensilla, and project their axons into the brain, where they form synapse-dense regions with inter- and projection neurons, called olfactory glomeruli due to their spherical shape. A notable feature of olfactory systems is the convergence of numerous olfactory sensory neurons onto fewer inter- and projection neurons, forming a smaller number of olfactory glomeruli. These connectivity patterns of cells with the same function point towards homology. However, differences in the olfactory pathway exist across pancrustacean groups. Insects evolved from a crustacean-like ancestor and with malacostracan crustaceans form the group of Pancrustacea. Insect olfactory systems have apomorphies like metabotropic receptor molecules in the olfactory sensory neurons in addition to the more ancient ionotropic receptor molecules, as well as differences in the number and connectivity of the involved cells and glomeruli. Within Pancrustacea, the olfactory systems of insects are well-studied, particularly Drosophila species. Therefore, analysing the olfactory system of malacostracan crustaceans and comparing it to the olfactory system of insects offers a multitude of insights into patterns of convergence, divergence, and the evolution of olfactory systems. The most detailed analysis of an olfactory system of malacostracan crustaceans comes from the group of Decapoda (“ten-footed” crustaceans), whereas comparatively little data is available for peracarid crustaceans (“crustaceans with a pouch” for offspring development). In addition to being an understudied crustacean group, peracarid crustaceans are likely closer to the stem line than the highly derived Decapoda. The similar body size of Peracarid and Hexapoda makes their olfactory systems more comparable, as they are likely to be faced with similar energy constrains, a selective pressure on neural tissue. Therefore, two members of Peracarida were analysed in this thesis: the amphipod Parhyale hawaiensis, and the mysid Neomysis interger. Within this thesis, a high level of neurochemical diversity was demonstrated in the olfactory pathway of both species. Contrary to decapods or insects, peracarid crustaceans develop without a larval stage. For P. hawaiensis, the morphology of the olfactory pathway and the neurotransmitter pattern in hatchlings mirrored the morphology of adults, indicating that the complexity of the olfactory system is established early in ontogeny and reflects their environment. In N. integer, a sexual dimorphism in the olfactory pathway was observed in the presence of male and female-specific sensilla and the male-specific neuropil. Within both species, morphological variability was observed for the spherical olfactory glomeruli, and an extensive analysis of the olfactory pathway of P. hawaiensis showed high variability in the morphology and the number of cells and glomeruli of the olfactory pathway, indicating a so-called distributed olfactory coding. It can be hypothesised that a more distributed olfactory coding was found in the common pancrustacean ancestors and insect species like Drosophila melanogaster developed a highly derived stereotyped one-to-one olfactory coding.
Der Ösophagus ist aufgrund seiner Physiologie und der dort herrschenden Bedingungen ein schwer zugänglicher Applikationsort für eine lokale Arzneimitteltherapie. Nichtsdestotrotz besteht für einige Krankheitsbilder wie beispielsweise eosinophile Ösophagitis (EoE) ein ansteigendes Bedürfnis für Möglichkeiten zur lokalen Pharmakotherapie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Übersichtsartikel verfasst, der die anatomischen und physiologischen Besonderheiten dieses Applikationsortes hervorhebt und diskutiert, wie diese überwunden werden können.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich außerdem mit der Weiterentwicklung eines Modells zur Simulation der Speiseröhre unter dem Aspekt der Biorelevanz. In einer vorausgegangenen Arbeit wurde bereits der Einfluss von Peristaltik, Flussrate des Freisetzungsmediums und Neigungswinkel des Modells auf die Verweildauer eines Polymerfilms untersucht. Aufgrund der komplexen physiologischen Vorgänge im Ösophagus ist es schwierig den Einfluss dieser Parameter auf eine Arzneiform separat voneinander zu untersuchen. Auf Basis bereits durchgeführter Untersuchungen an dem etablierten EsoPeriDiss-Modell wurden zwei Testszenarien entwickelt. Der stimulierte und nicht stimulierte Modus simulieren physiologische Zustände in wachen Proband*innen tagsüber beziehungsweise entsprechend in schlafenden Proband*innen nachts. Die Untersuchungen mit einem mukoadhäsiven Polymerfilm und einer viskosen Lösung zeigen, dass die Verweilzeit beider Arzneiformen verlängert ist, im Vergleich zu einer Standardlösung. Erhöhte Stressbedingungen für die Arzneiform im stimulierten Modus, welche durch eine erhöhte Flussrate, hohen Neigungswinkel und häufige peristaltische Ereignisse gekennzeichnet sind, führen außerdem zu einer kürzeren Verweilzeit in dem EsoPeriDiss-Modell. Des Weiteren wurde eine Temperierung des gesamten Modells implementiert, wodurch nicht nur das Freisetzungsmedium, sondern auch der Applikationsort auf 37 °C beheizt werden konnte. Zur Steigerung der Biorelevanz wurden außerdem verschiedene künstliche Speichelmedien hergestellt und getestet. Es zeigte sich, dass vor allem der Zusatz eines Viskositätserhöhers zu einer Änderung der Verweilzeit eines applizierten Films beitrug. Insgesamt bildet das weiterentwickelte EsoPeriDiss-Modell die Komplexität des Ösophagus als Applikationsort gut ab und stellt eine gute Alternative zu kompendialen Testmethoden dar. Die Simulation von Peristaltik und verschiedenen Flussraten des Freisetzungsmediums bilden die physiologischen Bedingungen im Ösophagus genauer ab, als es mit Standardtestapparaturen der Arzneibücher möglich ist. Daraus ergibt sich ein Erkenntnisgewinn über ein mögliches Verhalten der Arzneiform in vivo. Zukünftige Untersuchungen mit diesem Ösophagus-Modell könnten einen Fokus auf die Abbildung von peristaltischen Dysfunktionen legen. Durch die Integration von In vivo-Daten könnte die Funktionalität von Arzneiformen wie der EsoCap in der Anwendung in erkrankten Patient*innen besser untersucht werden.
Ein weiterer Teil der Arbeit befasst sich mit der Herstellung von patientenindividuellen Filmen mit innovativen Verfahren wie dem 2D-Druck. Die Herstellung von ösophageal applizierten Polymerfilmen kann neben bewährten Methoden wie dem Solvent-Casting-Verfahren auch mittels neuerer Technologien geschehen. Der 2D-Druck von Arzneiformen ist neben dem 3D-Druck eine bereits viel untersuchte Herstellungstechnik. Sie bringt vor allem in der Zubereitung von individualisierter Arzneimitteltherapie einige Vorteile mit sich. In den durchgeführten Versuchen wurde allerdings deutlich, dass die Verwendung eines herkömmlichen Tintenstrahldruckers zwar eine gute Auflösung von gedruckten Formen auf Placebo-Filmen hervorbringt, eine Gehalteinstellung mittels der genutzten Software allerdings nicht ohne weiteres möglich ist. Untersuchungen mit hochkonzentrierten Koffeinlösungen zeigten, dass es durch ein Verdunsten der leicht flüchtigen Bestandteile der wirkstoffhaltigen Tinte zu einer Verstopfung der Druckkopfdüsen kommt. Durch diese Problematik wird im Vergleich zur offizinellen Herstellung von Kapseln eine geringere Präzision und Richtigkeit des Gehalts erreicht. Die durchgeführten Versuche zeigen die zum aktuellen Zeitpunkt bestehenden Limitationen dieser Technologie. Es bedarf weiterer Forschung im Bereich der Entwicklung von wirkstoffhaltigen Tinten, Implementierung von Überwachungssystemen zur Qualitätskontrolle und Nutzung der Systeme unter GMP-Bedingungen. Insbesondere für die Herstellung von Arzneiformen mit empfindlichen aktiven Substanzen wie beispielsweise Proteine oder Nukleinsäuren, könnte der 2D-Druck in der Zukunft eine vielversprechende Herstellungstechnologie sein.
This thesis is structured around six interconnected studies that contribute to advancing enzymatic plastic recycling. The first two articles address the development of (ultra-) high-throughput screening methods, introducing a halo formation assay tailored for thermostable polyester hydrolases (Article I) and a growth selection assay for (poly)amidases (Article II). Such advanced screening methods facilitate the discovery of novel (polymer) hydrolases, such as the urethanases identified through metagenomic mining (Article III), which were shown to break down urethane bonds within polymers, as demonstrated in Articles IV and V. In Articles IV and V, structural insights into two of these urethanases, UMG-SP-1 and UMG-SP-2, respectively, were gained by solving their crystal structures, which guided rational enzyme engineering. Finally, Article VI shifted focus to applying these enzymes in a dual-enzyme system for the simultaneous depolymerization of mixed plastics, producing a feedstock suitable for microbial upcycling.
SC administration is used for delivering drugs which cannot be administered via the oral route. Yet, the absorption profile after SC administration is difficult to predict from preclinical studies. One of the main reasons for this poor prediction may be the differences in the physiology that preclinical species and humans have, but there is a lack of information about the SC tissue composition and, particularly, about the fluid that perfuses this area, the ISF. Better knowledge on the composition and physicochemical properties of the ISF may provide better insights into in vivo drug performance and even allow for developing simulated ISF to be used in in vitro models, to further investigate in vivo drug performance. To date, a comparison of ISF from different preclinical species and humans has not been published. Furthermore, few simulated ISF media have been proposed. Yet, those are literature-based and most of them cannot be regarded as biorelevant since non-physiological components are part of the composition. In this context, this study aimed to investigate the composition and physicochemical properties of the ISF from preclinical species and humans, to discern interspecies differences and, ultimately, to develop SISFs for in vitro predictive assays.
As a first step, ISF was isolated from the SC tissue of preclinical species and humans using the centrifugation method. This technique results in undisturbed ISF, a critical factor to consider given the invasiveness of the isolation process. Secondly, the isolated ISF samples were characterized using the same techniques across all samples, to enable data comparison. The characterization studies constituted a considerable contribution towards the understanding of the ISF composition across species. Similar values for pH, electrolyte content and osmolality were found for the ISF samples from the different species, while significant differences were observed for some parameters, particularly for albumin content. For instance, non-human primates ISF samples showed significantly higher albumin content than rodents ISF samples, while being in the same range than human ISF samples.
After the isolation and characterization of ISF samples, the resulting data were utilized to develop simulated ISF media. These SISFs aimed to replicate as closely as possible, the experimental characterization data, while keeping overall composition and preparation of the media simple to ensure easy implementation in the laboratory. pH, osmolality, and electrolyte and albumin content were set as target parameters. Meanwhile, buffer capacity, colloid osmotic pressure and surface tension were defined as reference parameters, i.e., were only assessed after preparation. Initially, a buffer was prepared, considering the target pH, electrolyte content, and osmolality, as these parameters were consistent across all species. The physicochemical properties of this buffer were measured, and the buffer was designated as Blank SISF. Different albumin concentrations were incorporated into the Blank SISF for representing ISF of mice and rats (17.5 g/L) and non-human primates and humans (30.0 g/L), developing in this way two media: the SMR-ISF and the SHM-ISF. After preparation, the SISFs were screened in the same manner as the ISF samples, and the resulting data were compared. At this step, slight adjustments were made in the electrolyte composition to better approximate the desired physicochemical properties.
Finally, in vitro experiments with the SISFs were conducted to analyze the influence of their composition, particularly their albumin content, on drug diffusion from the interstitial to the intravascular space. Liraglutide was selected as the model drug due to its high affinity for albumin. For these experiments, the Artificial Subcutaneous Tissue assay was utilized. The latter consists of a transwell plate with a gel-like artificial matrix mimicking key components of the extracellular matrix, such as collagen and hyaluronic acid. For these studies, SISF was added on the matrix prior to the incorporation of the formulation to be tested and PBS was used as receiver medium. Since PBS does not contain albumin, it was defined as Blank SPlasma. In a second step, Blank SPlasma was spiked with albumin to mimic the composition of the plasma samples determined in the characterization studies (25 g/L for the SMR-Plasma and 60 g/L for the SHM-Plasma). In this way, the SMR-ISF was used in conjunction with the SMR-Plasma in one setup, and the SHM-ISF was used together with the SHM-Plasma in a second setup. Higher diffusion rates were observed when the respective SISF at the apical side was combined with Blank SPlasma at the basolateral side, i.e., in absence of albumin in the receiver media. The samples analysis revealed the diffusion of both liraglutide and albumin through the membrane until equilibrium was achieved. Therefore, the results obtained with Blank SPlasma may be more representative of the physiological diffusion of liraglutide than those obtained with SPlasma containing albumin. Overall, these new media are promising tools in the context of developing new biorelevant models aiming to explain the differences in the in vivo performance of SC injectables in preclinical species and humans. This is because biorelevant components such as albumin significantly impact the physicochemical properties of the media. However, other aspects, such as the fat content difference in the SC tissue or even the exact injection point, may also influence in vivo performance and could be considered for future investigations.
In conclusion, this study has provided essential insights into the composition and properties of the SC ISF, clarifying previously limited data. The findings suggest that, among the studied preclinical species, the ISF of non-human primates is the most similar to human ISF. Yet, further research is needed to understand which differences between non-human primates and humans influence the bioavailability profile disparities. The ISF characterization data were utilized to develop SISFs. The addition of albumin at targeted concentrations resulted in physicochemical properties closer to those of the reference ISF data. The results presented here indicate that these media offer several advantages over those previously described in literature. Principally, the SISFs provide a better representation of the ISF composition and physicochemical properties, while also accounting for the differences among species. Although the in vitro model used for the first in vitro experiments still requires refinement, the SISFs will undoubtedly help to better understand the in vivo performance of subcutaneously injected formulations. Furthermore, the SISFs can provide insights into how results obtained in preclinical species can be extrapolated to humans and, more importantly, avoid unnecessary animal testing. Overall, the work presented in this research therefore marks a significant step forward in developing in vitro tools to investigate the behavior of SC injectables and should inspire further investigation and refinement for future applications.
Staphylococcus aureus (S. aureus) is a Gram-positive bacterium known to colonize parts of the human population persistently at various niches on the body surface, with the nares as main area of colonization [Wertheim 2004]. In a 19-month longitudinal study at the Statens Serum Institut in 1995, different modes of colonization were described: 14.4% of the 104 persons investigated were characterized as persistent carriers showing detectable amounts of S. aureus in over 90% of swabs, 16.3% as intermittent carriers (over 50% of swabs positive for S. aureus), 52.9% as occasional carriers (over 10% of swabs positive) and 16.3% as non-carriers with not a single culture-positive swab [Eriksen 1995]. With the introduction of more sensitive culture-independent detection technologies, the separation of groups was rephrased in 2009 by van Belkum et al.: only two groups, namely persistent colonization and intermittent carriage should remain due to similar responses of intermittent carriers and non-carriers to artificial inoculation [van Belkum 2009]. Colonization itself can remain unnoticed since no clinical symptoms are triggered, but due to the constant challenge with the bacterium, an increased risk of surgical site infections (SSIs) was described in persistent carriers [Kluytmans 1995]. Additionally, invasive events occur more often, when staphylococci are able to enter the organism e. g. via micro-lesions in the skin [Wertheim 2004]. Due to the persistent challenge in carriers, it was hypothesized that these individuals should reflect these circumstances with higher titers of anti-staphylococcal antibodies together with matching B- and T-cells primed to staphylococcal antigens [Wertheim 2004, Holtfreter 2006]. This idea was addressed in multiple small case-control studies [Verkaik 2009, Dryla 2005, Rigat 2019], but the bigger picture studying the general population was still missing.
The work described in this dissertation focuses on the detection of specific antibodies against a set of 79 staphylococcal antigens in a multiplex bead-based assay format to describe the anti-staphylococcal antibody repertoire in a study population resembling the general population. To achieve this goal, a highly sensitive analysis strategy was designed which is described in the first publication of this thesis “Technical report: xMAPr - High-dynamic-range (HDR) quantification of antigen-specific antibody binding”. This report addresses the challenge of measuring over the wide dynamic range expected in the plasma samples of the Study of Health in Pomerania (SHIP), of which the SHIP-TREND cohort was used as a population-based cohort for the second publication “A Comprehensive View on the Human Antibody Repertoire Against Staphylococcus aureus Antigens in the General Population”. The resulting antibody dataset was added to the multi-factor analyses of the SHIP-TREND cohort allowing a correlation of the individual anti-staphylococcal antibody response to the genetic features of the study subjects in a genome-wide association study (GWAS). The findings concerning one of the included antigens “toxic shock syndrome toxin 1” (TSST-1) are described in the third publication “Toxin exposure and HLA alleles determine serum antibody binding to toxic shock syndrome toxin 1 (TSST-1) of Staphylococcus aureus”. The xMAPr assay setup can be applied to further fields of research where a quantitative antibody detection is needed, e. g. the induction of specific antibodies after vaccination as shown in the fourth publication “Intranasal Vaccination With Lipoproteins Confers Protection Against Pneumococcal Colonisation”, where mice were immunized with antigens derived from Streptococcus pneumoniae.
Die chronische Niereninsuffizienz (CKD) stellt weltweit ein immer größer werdendes
Gesundheitsproblem dar [1, 2]. Hohe Prävalenz und Gesundheitskosten sowie eine verminderte
Lebensqualität bei den Betroffenen, sind Faktoren, die eine Weiterentwicklung der Früherkennung
der CKD zwingend erfordern [3–8]. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, mithilfe des Plasmaund
Urinmetaboloms in explorativen Analysen Metabolite zu identifizieren die mit der
Nierenfunktion assoziiert sind.
In die Studie wurden die Daten von 920 Probanden, darunter 407 Männer und 513 Frauen, der
Basisuntersuchung der populationsbasierten Study of Health in Pomerania-TREND (SHIPTREND)
eingeschlossen. Die Probanden waren zwischen 20-79 Jahre alt und lebten in der Region
Vorpommern. Die durchgeführten Untersuchungen fanden zwischen 2008 und 2012 statt. Alle
eingeschlossenen Probanden waren nierengesund und hatten keinen selbstberichteten Diabetes
Mellitus. Als Parameter zur Abschätzung der Nierenfunktion wurde die geschätzte glomeruläre
Filtrationsrate (eGFR) basierend auf Cystatin C (eGFRcys) verwendet. Probanden mit einer
eGFRcys > 60 ml/min/1,73m² wurden als nierengesund definiert. Das Plasma- sowie Urinmetabolom
wurde mittels Flüssigchromatographie (liquid chromatography) kombiniert mit Tandem-
Massenspektrometrie am Helmholtz Zentrum München gemessen. Anschließend wurden die
Metaboliten durch einen kommerziellen Anbieter (Metabolon, Inc.) quantifiziert. Insgesamt konnten
474 Plasmametaboliten und 558 Urinmetaboliten quantifiziert werden, von denen 200 sowohl im
Blut als auch im Urin vorkamen. Es erfolgten multivariable lineare Regressionsanalysen, bei der die
abhängige Variable die eGFRcys darstellte. Unabhängige Variablen waren alle quantifizierten
Plasma- und Urinmetaboliten, sowie die inter- und intra-fluid Ratios in allen möglichen
Kombinationen. Die Regressionsanalysen wurden für Alter, Geschlecht, Taillenumfang,
Triglyceride, Rauchen und Hypertonie adjustiert. Zur Vermeidung einer Kumulierung von
Alphafehlern wurde zur Bestimmung des Signifikanzniveaus die Bonferroni-Korrektur verwendet.
Intra- und inter-fluid Ratios mussten zusätzliche einen P-gain Schwellenwert überschreiten, der es
ermöglicht die Assoziation eines Ratio mit der eGFRcys unabhängig von der Signifikanz eines
Einzelmetaboliten zu bewerten.
Insgesamt zeigten sich in den Analysen im Plasma 72, und im Urin 56 signifikant mit der eGFRcys
assoziierte Metaboliten. Zusätzlich konnten 26 intra-fluid Ratios im Plasma, 34 intra-fluid Ratios im
Urin und 150 inter-fluid Ratios detektiert werden, die signifikant mit der eGFRcys assoziiert waren.
Aus der Vielzahl der detektierten Assoziationen stachen vier Plasmametaboliten hervor, die bisher
in keiner anderen Studie im Zusammenhang mit der Nierenfunktion beschrieben wurden: Gamma-Butyrobetain, 3-Methylglutarylcarnitin, N4-Acetylcytidin und 1-Methyl-2-Piperidin-carboxylsäure.
Andere Plasmametaboliten wie Pseudouridin und Kynurenin wurden bereits in vorherigen Studien
[25–27] als signifikant mit der Nierenfunktion bzw. Nierenfunktions-einschränkungen assoziiert,
beschrieben. Im Urinmetabolom zeigten sich vor allem N-acetylierte Aminosäuren und Metaboliten
des AS-Stoffwechsels von Leucin, Isoleucin und Valin, die alle positiv mit der eGFRcys assoziiert
waren. Zudem gab es vier invers assoziierte inter-fluid Ratios die denselben Metaboliten, sowohl im
Plasma als auch im Urin beinhalteten: Beta-hydroxyisovalerat, 3-Indoxylsulfat, N1-Methyl-2-
pyridon-5-carboxamid und ein unbekannter Metabolit.
Die Einordnung der eigenen Ergebnisse in die Erkenntnisse aus vorherigen Studien trug zur
Validierung der vorliegenden Resultate bei. Dabei wurden auch eigene Hypothesen zu
pathophysiologischen Zusammenhängen zwischen den Metaboliten bzw. den Metabolitenratios und
der eGFR aufgestellt. Jedoch können mit den vorgestellten querschnittlichen und explorativen
Analysen keine kausalen Zusammenhänge detektiert werden. Es ist daher notwendig in zukünftigen
prospektiven Studien sowie randomisierten Fall-Kontroll Ansätzen die herausgearbeiteten
Metaboliten in Bezug auf ihre Bedeutung für die Nierenfunktion genauer zu beleuchten. Zudem
sollte in experimentellen Ansätzen Grundlagenforschung zum Thema Nierenmetabolismus der
detektierten Metaboliten betrieben werden um herauszufinden, ob einer oder mehrere dieser Stoffe
als laborchemische Biomarker zur Detektion geringfügiger Nierenfunktionseinschränkungen
geeignet sind. Die vorliegende, explorative Studie schafft somit einen Ausgangspunkt für weitere,
zielgerichtete Forschung.
The Fennoscandian Ice Sheet (FIS) was one of the largest inland ice bodies in the northern hemisphere during the Quaternary. At the end of the Quaternary, during the Weichselian, large ice masses strongly shaped the landscape of Northern Europe. Repeating advances of the FIS led to the development of various glacial landforms in NE Germany. Especially in the federal state of Mecklenburg-Western Pomerania (MWP) the landforms related to the Late Weichselian ice advances are abundant in a large diversity. Although Quaternary research in NE Germany is ongoing since more than a century, many questions on the number and chronology of the different ice advances are still unanswered.
In the last decades numerical dating provided an approach to answer these questions. But with the amount of datings, an uncertainty about the progression of the FIS arouse. In the last years, a partly strong asynchrony of the ice margin is controversially discussed. In MWP, where the remnants of the latest glaciation are strongly distinctive, the number of numerical age data was low so far. This thesis aims to strengthen the data base for numerical age data in accordance to estimate the chronology and the development of Late Weichselian ice margins. By means of Optical Stimulated Luminescence (OSL) dating, key sites for ice sheet development were investigated and the results are integrated into regional ice-dynamic models of the FIS during Marine Isotope Stages (MIS) 3 to 2, which are partly been challenged.
As there is age data which contradicts with the ongoing estimation of the LGM in NE Germany, the here presented data confirms the LGM in the study area to ~24-22 ka. For a post-LGM ice advance this thesis confirms to reach its maximum extent at ~20-18 ka. The evolution of the Jasmund Glacitectonic Complex (JGC), which is in focus to reflect small-dimensioned ice sheet dynamics, was directly determined for the first time by dating of syn-kinematic deposits. Although the assumed two-step (main) evolution could not been differentiated by OSL age data, the development of the two main sub-complexes of the JGC was dated to 22-20 ka. The here presented age data provides robust ages for the development of the FIS and contributes to a better understanding of ice dynamics in the SW Baltic Sea area during MIS 2.
Vor dem Hintergrund einer höchst diffusen Umgebung in Ozeanen spielt die Saccharidaufnahme und -verwertung eine entscheidende Rolle als Energiequelle in marinen Bacteroideten. Die Substratspezifität ihrer zuckerverwertenden Proteine ist jedoch weitesgehend unerforscht und scheint bei verschiedenen saccharid-verwertenden Systemen (engl.: saccharide uptake system, Sus) stark unterschiedlich zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit untersuchten wir die Ligandenpräferenz ausgewählter Bindeproteine mariner Bacteroideten, um Schlussfolgerungen auf die Substratspezifität und Anpassungen an verschiedenartige Saccharide aus Algen zu ziehen. Mithilfe von Affinitätsgelelektrophorese (engl.: affinity gel electrophoresis, AGE) und Mikroskaliger Thermophorese (engl: microscale thermophoresis, MST) konnte gezeigt werden, dass sogenannte SusDähnliche Proteine aus verschiedenen Typen von Polysaccharidverwertungsloci (engl: polysaccharide utilization loci, PUL) unterschiedliche Spezifitäten gegenüber poly- und oligomeren Laminarinen besitzen. Zusätzliche Mutagenesestudien konnten Spezifitäten von GMSusD gegenüber bestimmten Polysacchariden auf Schlüsselreste zurückführen. Zuvor wurden verschiedene Analysemethoden für diese peripheren Membranproteine und Expressionsansätze ihrer Gene getestet und optimiert. Darüber hinaus wurden vermutlich xylan-bindende SusD-ähnliche Proteine zweier PULs aus Flavimarina sp. untersucht.
Nowadays, life expectancy is consistently rising, and the population of older people is growing exponentially worldwide. Even though older people are the main end users of drug products, yet they are significantly underrepresented in clinical trials focused on new drug entities. Currently, clinical trials predominantly involve younger adults, overlooking the physiological changes relevant to oral drug absorption in older individuals. This exclusion is concerning given the incidence of changes in the physiology of the aging gastrointestinal tract that may impact gastric emptying and motility and therefore oral drug absorption. In particular, gastric emptying of water is an important parameter for oral biopharmaceutics since clinical bioavailability and bioequivalence studies typically include the ingestion of oral formulations with a glass of water under fasted and fed state conditions.
Even though plentiful of studies have investigated gastric water emptying in younger volunteers, this is not the case in older people. Data from gastric emptying studies in older people is limited and contradictory, whereas the occurrence of the Magenstrasse in the fed state in older individuals has been up to date not investigated. A patient-centred approach to drug development is crucial, ensuring that medications are appropriately tested and optimized for the physiological needs of older patients, particularly under varying prandial conditions. To close these knowledge gaps, in this work the gastric emptying rate of water was assessed using the indirect method of salivary caffeine kinetics. This non-invasive method was further advanced by the development of a novel formulation containing the salivary marker caffeine to increase its suitability for use in older people, and therefore patient acceptability and compliance with the study procedure.
Summarized, the results of this thesis can be outlined as follows:
First, an extensive literature review was conducted to gather all relevant information regarding previous clinical studies investigating age-dependent changes in the physiological characteristics of the gastrointestinal tract relevant to oral drug absorption. Results from gastric emptying studies in older individuals are controversial, mainly because of different methods, study designs, and measurement parameters used.
Second, a novel rapid-disintegrating and dissolving tablet formulation containing caffeine was developed to advance the salivary caffeine method to be applied in the study including older individuals. According to this method, gastric water emptying is indirectly assessed by evaluating the pharmacokinetic profile of salivary caffeine concentrations. The new tablet formulation was successfully validated against the previous formulation (i.e. the ice capsule) in healthy young adults in a clinical study under fasted and fed state conditions.
Third, the impact of advanced age in gastric water emptying was investigated with the aforementioned method. Healthy older and healthy younger volunteers were recruited in a clinical study in fasted (after overnight fasting) and fed state (after the intake of a low-fat breakfast). Differences between gastric emptying of the two population groups was evaluated indirectly by evaluating the AUC ratios (%) of salivary caffeine concentrations in specific time segments. No significant difference could be proven (p > 0.05), which indicates that gastric water emptying remains unchanged in relation to healthy aging.
These results provide a better understanding in oral drug absorption in older individuals and facilitate the drug development of oral drug products specified to the needs of the aging population. However, taking into consideration the high proportion of older people affected by multimorbidity, polypharmacy and frailty, we could surely say that these outcomes are not representative of the whole cohort of older individuals. As the aging population is very heterogeneous, a useful approach would be to investigate the impact of these factors by creating subgroups of this population and studying specific parameters separately (e.g. older individuals with multimorbidity versus healthy older individuals). Given these factors, future studies are needed to better understand how they may affect gastric emptying rates and motility. This will lead to a better understanding of the underlying mechanism of any changes observed in oral drug absorption and disposition in older adults, and therefore improve oral drug development.
Innerhalb der individualisierten Medizin steht zunehmend der einzelne Patient mit seinen spezifischen Voraussetzungen und Bedürfnissen im Fokus der Arzneimitteltherapie. Die Verwendung von 3D-Drucktechnologien bietet ein hohes Potenzial für die individualisierte Herstellung von Arzneiformen, die spezifisch auf die Bedürfnisse des jeweiligen Patienten zugeschnitten sind. Aufgrund der hohen Flexibilität hinsichtlich der Anpassung von Form und Größe der gedruckten Arzneiformen sowie der damit verbundenen Dosis oder des Freisetzungsverhaltens eröffnet der 3D-Druck neue vielversprechende Möglichkeiten diesen individuellen Anforderungen zu begegnen.
Das Ziel dieser Arbeit war die Eignung des 3D-Drucks für die Herstellung von individualisierten wirkstoffbeladenen Arzneiformen im nicht-oralen Applikationsbereich zu untersuchen und relevante Einflussfaktoren zu identifizieren. Hierzu wurden reproduzierbare Herstellungsprozesse unter der Verwendung von zwei extrusionsbasierten 3D-Drucktechnologien (FDM, Fused Deposition Modeling und SSE, Semi-Solid Extrusion) für die Herstellung von Sinus-Implantaten und Suppositorien entwickelt und optimiert. Während bei der Herstellung von Suppositorien primär die Form und Größe mittels des 3D-Drucks angepasst werden können, erfordert die Entwicklung von Sinus-Implantaten aufgrund der hohen anatomischen Variabilität eine exakte Anpassung der Implantatform an die komplexe patientenindividuelle Anatomie.
Ein Schwerpunkt dieser Arbeit stellt die Untersuchung des Einflusses der individualisierten Form auf das Freisetzungsverhalten im Zusammenhang mit den entwickelten Sinus-Implantaten dar. Anhand von Modell-Implantaten mit vereinfachter Geometrie wurden die zugrundeliegenden mathematischen Zusammenhänge ermittelt und die Möglichkeit zur Vorhersage des Freisetzungsverhaltens von patientenindividuell geformten Implantaten untersucht. Die hierbei erlangten Erkenntnisse könnten aus regulatorischer Sicht vielversprechend sein, um zukünftig umfangreiche und zerstörerische In vitro-Untersuchungen an der spezifischen Implantatform zu umgehen und somit den Aspekt der Einzelanfertigung im Rahmen der individuellen Herstellung zu stärken.
Des Weiteren wurden wesentliche Einflussfaktoren auf die Wirkstoffstabilität während des Prozesses der Schmelzextrusion zur Herstellung wirkstoffbeladener Polymerfilamente als Ausgangsmaterial für den 3D-Druck sowie während des 3D-Druckprozesses selbst am Beispiel des antiinflammatorischen Wirkstoffs Dexamethason untersucht. Hierbei konnte neben dem maßgeblichen Einfluss der verwendeten Prozesstemperaturen ebenfalls der Einfluss der Polymerauswahl auf die Wirkstoffstabilität demonstriert werden, was die Relevanz von Stabilitätsuntersuchungen für den spezifischen Prozess unabhängig von den Ergebnissen thermogravimetrischer Analysen unterstreicht.
Insgesamt verdeutlicht die vorliegende Arbeit die Eignung des 3D-Druckverfahrens insbesondere für die fokussierten Applikationsformen der Sinus-Implantate sowie der Suppositorien, wobei sich die erlangten Erkenntnisse hinsichtlich der Herstellung, Individualisierung und erzielbarer Eigenschaften zusätzlich auf weitere Applikationsorte übertragen lassen. Insgesamt stellt der 3D-Druck ein gut geeignetes Verfahren für die reproduzierbare Herstellung von Arzneiformen dar, das insbesondere aufgrund des hohen Freiheitsgrades an realisierbaren Formen entscheidende Vorteile für verschiedene Darreichungsformen bietet, die einen ausgeprägten Individualisierungsgrad benötigen.