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The aim of this work was to characterize the distribution of TULV in European common vole populations, to clarify the host association of TULV and to investigate correlations between host population dynamics and changes in TULV prevalence. Furthermore, the potential of common voles as reservoir for other rodent-borne pathogens was examined in comparison to other rodent species.
Molecular and serological analysis of rodents captured at 87 locations in Germany, France, Luxembourg, and Austria revealed TULV infections at 53.6 % of all trapping locations. The seroprevalence in common voles was low with a mean of 8.5 % (range: 0 – 19 %). TULV RNA was more often detected (mean: 15.3 %, range 0 - 37.5 %). Field voles (Microtus agrestis) and water voles (Arvicola amphibius) were less often tested positive for TULV: mean seroprevalence was 7 % for field voles and 6.7 % for water voles. RNA could be detected in 5.4 % of all tested field voles and 3.2 % of water voles and with exception of a single field vole only when TULV-RNA-positive common voles were trapped at the same location. Those results indicate that TULV infections of field and water voles are spillover infections from sympatric TULV-infected common voles. Phylogenetic analysis revealed distinct genetic differences between TULV sequences of regions of greater geographical distance which were associated with different evolutionary common vole lineages. Furthermore, we could detect genetic differences between TULV strains from trapping sites close to each other (ca. 10 km).
In a capture-mark-recapture study 1042 common voles captured in live traps in Germany were sampled as well as 225 captured in snap traps. When analyzing the seroprevalence of fluctuating common vole populations over several years and seasons we found a negative correlation between prevalence and population density in the current season but a delayed density-dependent positive correlation between the current population density and seroprevalence in the next season. However, this trend varied geographically between the four trapping locations. Usually, population density as well as seroprevalence peaked at the end of the reproductive period in autumn with the exception of Weissach (2010-2012), Jeeser (2010) and Gotha (2012) where population peaks in summer were observed.
In a pilot study in Austria common voles were captured as well as three other rodent species. They were investigated not only for presence of different viruses (TULV, Dobrava- Belgrade orthohantavirus (DOBV), Puumala orthohantavirus (PUUV), Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus (LCMV), Cowpox virus (CPXV)) but also pathogenic bacteria and endoparasites (Leptospira spp., Toxoplasma gondii, Borrelia afzelii, Coxiella burnetii, Rickettsia spp. und Bartonella spp.). Of all four captured species, common voles were most often infected with at least one pathogen (66.7 %), followed by wood mice (Apodemus sylvaticus) (57.7 %), bank voles (Myodes glareolus) (35 %) and yellow-necked field mice (Apodemus flavicollis) (34.5 %). Common voles were also exceptionally susceptible to multiple infections: 66.7 % of them were infected with two or three different pathogens, compared to 6.9 % of yellow-necked field mice and 2.5 % of bank voles. No multiple infections could be detected in wood mice.
The broad geographic distribution of TULV in its reservoir host is in contrast to the rare reports of human infection but might be explained with a low pathogenicity for humans or with the low prevalence in host populations. In addition, the rare detection of human TULV infections could be a result of the used diagnostic methods. Since the reservoir population is known for its dramatic changes in population density and recurring superabundances which facilitates frequent contact to humans, TULV should more often be considered as cause for human disease in future analysis. In
addition, several other zoonotic pathogens could be detected in common voles which could influence TULV infections in the reservoir host but also TULV transmission to humans and therefore deserve more attention in future research.
Compared to other human pathogens, S. aureus outstands with a remarkably broad spectrum of deseases: from minor skin infections over endocarditis, pneumoniae, and osteomyelitis, to septic shock. The prerequisite is an arsenal of adaptation strategies, encoded in the core and variable genome. It includes the coordinated expression of adhesins and toxins, evasion of the immune system, response to stress and starvation, adaptation of the metabolism, formation of biofilms and capsules, antibiotic resistance, and persistence on the skin, in nasal epithelial cells, and even in the inner of macrophages after phagocytosis. All these adaptation strategies enable S. aureus to colonize a diversity of niches within the human host. The inevitable requirement is the ability to activate the appropriate adaptation strategy at the right time and at the right place. S. aureus overcomes this challenge with a sophisticated regulatory network. This PhD thesis covers a broad spectrum of transcriptional regulators, involved in S. aureus pathogenesis: (1) the quorum sensing system Agr (regulation of early- and late stage virulence factors), (2) the Sar family (regulation of early- and late stage virulence factors), (3) SaeRS (regulation of accessory exotoxins and adhesins), (4) CodY (response to amino acid starvation, including extracellular proteases), (5) Sigma B (general stress response, including virulence factors), (6) Rex (anaerobic energy metabolism), (7) CtsR and HrcA (protein quality control), (8) PerR and Fur (oxidative stress response), and (9) antibiotic resistance. Traditionally, Proteomics constitute the long-lasting reputation of the Institute. In fact, the majority of investigations presented in this PhD thesis was initialized by proteomic analyses as the ultimate starting point. From the first day, a major goal of this PhD thesis was to add regulator-promoter interaction studies to the methodical spectrum. In particular, to complement transcriptomic and proteomic results by answering the logical follow-up question: Which regulator is responsible for the observed changes in gene expression and protein synthesis after application of a specific stimulus?
The first chapter provides specific analyses for three major regulators: Rex, CodY, and SarA. Publications were achieved for Rex (Hecker et al., 2009; Pagels et al., 2010). Results were mainly achieved by establishing regulator-promoter interaction methods (in particular EMSA and “footprinting”). Additionally, this chapter describes method development of a novel easy-to-apply method, named REPA (restriction endonuclease protection assay).
The second chapter presents method development for the genome-wide identification of regulator-promoter interactions, named “global footprinting”. This approach combines two already well-established methods: (A) Purification of a recombinant Strep-tagged regulator via Strep-tag affinity chromatography. The modification in “global footprinting” is to incubate the regulator with fragmented genomic S. aureus DNA, resulting in co-purification and enrichment of DNA streches with specific regulator binding sites. (B) Identification and quantification of these DNA streches via “next generation sequencing” (NGS). Using this combined approach, this PhD thesis was able to localize the most affine promoter binding site for the regulator Rex precisely down to one single base pair across the whole S. aureus genome.
The third chapter describes the assembly of a data library, collecting the majority of DNA microarray data and regulator-promoter interaction studies from the worldwide literature. This data library summarizes more than 50,000 regulatory events and more than 2,000 regulator binding sites. As published in the perspectives in Fuchs et al. (2018), this data library can be incorporated into the free-accessible online data base “Aureowiki” (provided and maintained by the Department of Functional Genomics, University of Greifswald). The major effort is the consolidation of these “big data” via in silico cluster analysis, comparing 282 different experimental conditions at once. The major finding of this analysis is the identification of seven functional and regulatory gene clusters in S. aureus pathogenesis that are conserved across S. aureus strain diversity. These findings allowed the creation of a prediction tool, to provide novel experimental starting points for the worldwide S. aureus research community. This prediction tool was successfully applied on several topics, and partially published: functional and regulatory prediction for a set of 20 selected lipoproteins as potential virulence factors (Graf et al., 2018), and prediciton of protein complexes (Liang et al., 2016).
Alltogether, this PhD thesis provides new insights into the molecular mechanisms of three pathogenesis-relevant regulators: Rex, CodY, and SarA. It describes the development of three novel experimental methods for wet and dry lab applications that can be used on research topics beyond S. aureus: REPA, “global footprinting”, and cluster analysis. Finally, cluster analysis identifies seven conserved fuctional and regulatory gene clusters, involved in S. aureus pathogenesis. This cluster anaysis is used as a prediction tool to provide novel experimental starting points, and to predict the physiological mode of action of newly discovered anti-staphylococcal agents.
A significant fraction of the decaying algal biomass in marine ecosystems is expected to be mineralized by particle-associated (PA) heterotrophic bacterial communities, which are thus greatly contributing to large-scale carbon fluxes. Whilst numerous studies have investigated the succession of free-living (FL) marine bacteria, the community structure and functionality of PA bacterial communities remained largely unexplored and knowledge on specific contributions of these microorganisms to carbon cycling is still surprisingly limited. This has mostly been due to technical problems, i.e., caused by the enormous complexity of marine particles and the high abundance of eukaryotic microorganisms within these particles. This thesis presents (a) an optimized metaproteomics protocol for an in-depth characterization of marine PA bacteria, (b) an application example with FL and PA communities sampled during a spring phytoplankton bloom in 2009 in the North Sea, which confirmed the reliability of the optimized metaproteomic workflow, (c) the metaproteomic analysis of particulate communities sampled during a spring phytoplankton bloom in 2018, resulting in an as yet unprecedented number of identified protein groups of the bacterial response bloom and (d) a proteomic analysis of a PA bacterial isolate grown on the two naturally abundant marine polysaccharides laminarin and alginate. The observed succession of bacterial clades during metaproteomic analyses of the investigated blooms highlights individual niche occupations, also visible on genus level. Additionally, functional data shows evidence for the degradation of different marine polysaccharides e.g., laminarin, alginate and xylan supporting the important role of PA bacteria during the turnover of oceanic organic matter. Furthermore, most of the identified functions fit well with the current understanding of the ecology of an algal- or surface-associated microbial community, additionally highlighting the importance of phytoplankton-bacterial interactions in the oceans. More detailed insights into the metabolism of PA bacteria were gained by the proteomic characterization of a selected PA bacterial isolate grown on laminarin and alginate. Functional analyses of the identified proteins suggested that PA bacteria employ more diverse degradation systems partially different from the strategies used by FL bacteria.
The genus Capripoxvirus of the family Poxviridae consists of the species lumpy skin disease virus, sheeppox virus and goatpox virus that affect cattle, sheep and goats, respectively. Whereas lumpy skin disease virus (LSDV) is transmitted mainly mechanically via blood-feeding insects and possibly hard ticks, the major transmission routes of sheeppox virus (SPPV) and goatpox virus (GTPV) are via direct contact and aerosols. Affected animals develop fever and display clinical signs such as ocular and nasal discharge, lymphadenopathy and characteristic lesions of the skin. Severe clinical course, especially in combination with respiratory signs, can result in the death of the affected animals. In endemic regions, mortality of capripox virus-induced diseases is low (1-10%). However, mortalities of up to 75% have been reported for LSDV and up to 100% for SPPV and GTPV in exotic breeds and high-producing dairy or beef animals. The loss of quality of the leather, reduced weight gain and milk yield as well as complete loss of affected animals have severe impact on national and global economies. Therefore, capripox virus-induced diseases have significant impact on both the affected individual animal as well as on the existence of small-scale farmers and large agricultural enterprises. However, until now, only live attenuated vaccines are commercially available. These attenuated vaccines are not authorized in the European Union and their administration would comprise the disease-free status of the respective country. Thus, reliable diagnostic tools for the detection and characterization of capripox viruses as well as safe and efficient control measures are of high importance.
The objectives of the present thesis were the development, validation and comparison of diagnostic tools, the establishment of challenge infection models and the performance of pathogenesis studies for all three capripox virus species, and the development and testing of different inactivated prototype vaccine candidates against LSDV.
First, new real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) assays for robust detection and differentiation of LSDV field strains, LSDV vaccine strains, SPPV and GTPV were developed and extensively validated. In the following, two single assays were combined to duplex assays, one for the differentiation between LSDV field strains and LSDV vaccine strains, and the second for discrimination of SPPV and GTPV. Finally, a diagnostic workflow based on these new duplex assays in combination with already published methods was established. This workflow enables time-saving, robust and reliable detection, species-specific identification and genetic and phylogenetic characterization of all three capripox virus species. In addition, already existing serological examination methods (serum neutralization assay and commercial enzyme-linked immunosorbent assay) were compared regarding their sensitivity and specificity. Furthermore, pathogenesis studies with different capripox virus isolates were performed in the respective target species, and the suitability of selected virus isolates as challenge viruses for future vaccine studies was analyzed. Pathogenesis studies with isolates GTPV-“V/103” and LSDV-“Macedonia2016” revealed that both are proper candidates for challenge models. Finally, three different SPPV isolates (SPPV-“V/104”, SPPV-“India/2013/Surankote” and SPPV-“Egypt/2018”) were tested in sheep regarding their virulence to find a suitable challenge model for SPPV, and SPPV-“India/2013/Surankote” was chosen for future vaccine studies.
Once appropriate challenge models were established, different inactivated prototype vaccines against LSDV were developed, and vaccine safety as well as vaccine efficacy were tested in cattle. Eventually, a Polygen-adjuvanted inactivated LSDV-vaccine candidate was selected that is able to fully prevent cattle from any LSDV-related clinical signs after severe challenge infection. Furthermore, molecular and serological data indicate that this inactivated prototype vaccine is even able to induce a kind of “sterile immunity” against LSDV in those cattle. It has to be mentioned that a commercially available vaccine similar to this prototype vaccine would be a great advance for the control of LSDV.
In the future, additional studies addressing diagnostics and optimized control of capripox viruses should be performed. Firstly, probe-based real-time qPCR assays for the differentiation of SPPV and GTPV vaccine strains from their respective virulent field strains should be developed and included into the diagnostic workflow. Secondly, further tests of the inactivated prototype vaccine, e.g. determination of the minimum protective dose and the possibility of cross-protection in sheep and goats against SPPV and GTPV, respectively, should be performed.
Der Kernexport neusynthetisierter Kapside stellt einen Schlüsselprozess in der Herpesvirus-Replikation dar. Die zugrundeliegenden Mechanismen dieser Vesikel-vermittelten Translokation sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Der nuclear egress wird dabei maßgeblich von zwei viralen Proteinen dirigiert, die in PrV und HSV-1/-2 als pUL31 und pUL34 bezeichnet werden und in allen Herpesviren konserviert sind. Beide Proteine interagieren an der inneren Kernmembran, wo sie den sogenannten nuclear egress complex (NEC) bilden. Während pUL34 ein membranständiges Protein in der Kernmembran ist, gelangt das lösliche pUL31 über einen aktiven Transport in den Kern. Obwohl der erste Schritt der Freisetzung aus dem Kern, die Vesikelbildung und Abschnürung an der inneren Kernmembran, schon gut untersucht ist und auch die Kristallstrukturen des NEC für verschiedene Herpesviren ermittelt werden konnte, sind noch viele Fragen offen. So war zu Beginn dieser Arbeit noch unklar wie die Kapside in diese Hüllen rekrutiert werden und welche Rolle die nicht konservierte und offensichtlich flexible N-terminale Domäne von pUL31, die nicht in den Kristallstrukturen dargestellt werden konnte, für die Regulierung dieses Prozesses spielt. So konzentrierte sich diese Arbeit auf die Fragen, wie die Kapside mit dem NEC interagieren (Paper I und II) und wie der pUL31-N-Terminus diesen ungewöhnlichen Transportweg beeinflusst (Paper III).
Paper I und II: Untersuchungen zur Nukleokapsid/NEC Interaktion
Unklar ist, wie der NEC mit seiner Fracht, den Nukleokapsiden, interagiert. Auf Grundlage der vorhandenen Kristallstrukturen des Komplexes unterschiedlicher Herpesviren wurde eine Interaktionsdomäne in pUL31 postuliert und angenommen, dass dies mittels elektrostatischer Wechselwirkungen erfolgt. Um dies näher zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit geladene Aminosäuren, die als mögliche Interaktionspartner in Frage kommen, zu Alanin mutiert. Die so generierten pUL31 Mutanten wurden, nach Transfektion entsprechender Expressionsplasmide in Kaninchennierenzellen (RK13), auf ihre Lokalisation und nach Koexpression mit pUL34 auf Interaktion getestet. Die Funktionalität der mutierten Proteine während der Virusreplikation wurde mit Hilfe stabiler Zelllinien nach Infektion mit PrV-∆UL31 untersucht. Über elektronenmikroskopische Analysen wurde der Einfluss auf den Kernexport im Detail betrachtet. Hierbei konnte einem konservierten Lysin an Position 242 in PrV pUL31 im Prozess der Kapsidumhüllung eine Schlüsselrolle zugeordnet werden. Dieses Lysin befindet sich im membrandistalen Bereich des NECs, in der Alphahelix H10 von PrV pUL31. Die Substitution des K242 zu Alanin führte zu einem Abschnüren und einer Akkumulation leerer, Virushüllen-ähnlicher Vesikel im PNS, obwohl reife Kapside im Kern und in unmittelbarer Nähe zu den Akkumulationen vorhanden waren. Dies führte zu der Hypothese, dass die Ladung des Lysins direkt an der Interaktion mit dem Kapsid beteiligt ist (Paper I).
Obwohl das Lysin 242 in der Struktur des Dimers oberflächenexponiert erschien, zeigten Modellierungen im NEC Oligomer, dass diese Aminosäure vermutlich zu tief in der Struktur verborgen ist um als direkter Interaktionspartner in Frage zu kommen. Um die im vorherigen Paper aufgestellte Hypothese zu verifizieren oder auch zu widerlegen, wurde das Lysin nicht nur durch Alanin, sondern auch durch andere nicht geladene, sowohl positiv als auch negativ geladene oder in ihrer Größe variierende Aminosäuren substituiert (Paper II).
Die neu generierten Substitutionsmutanten wurden nach Transfektion der Expressionsplasmide auf ihre Lokalisation und nach Kotransfektion mit pUL34, auf ihre Interaktion untersucht. Die Funktionalität der mutierten Proteine wurde ebenfalls mit Hilfe stabil exprimierender Zelllinien analysiert. Die vorliegenden Phänotypen wurden weiter mittels elektronenmikroskopischer Analysen bestimmt. Es stellte sich heraus, dass unabhängig von der vorhandenen Ladung der Aminosäure an Position 242 der Kernexport signifikant beeinträchtigt wurde. In Strukturanalysen der einzelnen Mutanten zeigte sich, dass vielmehr die Ausrichtung und Größe der Seitenkette der ersetzten Aminosäure entscheidend war. So störte beispielsweise die Substitution zu Serin und Tyrosin, die die Lage der Seitenketten des ursprünglich vorliegenden Lysins imitierten, die Funktion des pUL31 am wenigsten und die Titer erreichten fast Wildtypwerte. Dagegen führten Substitutionen zu deutlich längeren Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Arginin, zu massiven Beeinträchtigungen des nuclear egress. Allerdings führte keine der Substitutionen zu einem unkontrollierten Abschnüren von Vesikeln ohne Aufnahme eines Kapsids an der inneren Kernmembran.
Die hier gezeigten Ergebnisse entkräfteten die Annahme einer elektrostatischen Interaktion über pUL31 K242 mit den Nukleokapsiden in PrV. Vielmehr deuteten sie auf eine strukturell basierte Störung der Kapsidaufnahme in die Vesikel hin (Paper II).
Mittels serieller Passagen von Virusmutanten die das UL31 mit der K242A Substitution exprimierten, wurde nach möglichen kompensatorischen (second-site) Mutationen gesucht, die den Defekt ausgleichen und darüber hinaus Aufschluss auf die molekularen Ursachen ziehen lassen.
Die generierten Virusrekombinanten erreichten bereits nach ca. 10 Passagen Wildtpy-ähnliche Titer. Aus den Passagen wurden verschiedene Isolate charakterisiert. Es zeigte sich zwar keine Reversion zum Lysin 242, vielmehr waren jedoch entweder weitere Mutationen in pUL31 oder in pUL34 zu finden. Während die detektierten pUL34 Mutationen zu einem späteren Zeitpunkt charakterisiert werden müssen, wurden die second-site mutierten pUL31 Proteine auf Lokalisation, Kolokalisation und Kompensation des K242A Defektes getestet. Die Ergebnisse bestärkten die Annahme eines Strukturdefektes durch K242A. Darüber hinaus konnten durch Rückmutation des K242A Defektes in den second-site mutierten pUL31 zwei Helices bestätigt werden (H5 und H11), die ähnlich der H10 einen starken Einfluss auf den Kernexport besitzen.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die Aminosäure an Position 242 nicht direkt mit den Nukleokapsiden interagiert, dass eingeführte Mutationen jedoch die Umorganisation des NEC-Oligomers, welche offensichtlich notwendig für die effiziente Kapsidumhüllung an der inneren Kernmembran ist, stört und so den nuclear egress inhibiert (Paper II).
Es zeigte sich, dass sich die Struktur-Funktions-Beziehungen in den NECs komplexer darstellen als vermutet. Die Ergebnisse dieser Arbeit können zwar nicht den Mechanismus des Kapsidexports bzw. der Kapsidbindung und -inkorporation aufklären doch zeigen sie, dass die Interaktionen der NECs miteinander sehr viel komplexer aber auch wesentlich flexibler sind als zunächst angenommen.
Paper III: Untersuchung der N-terminalen Domäne von PrV pUL31
Neben einem Kernlokalisationssignal (NLS) beherbergt der N-terminus verschiedener pUL31 Homologer auch zahlreiche vorhergesagte Phosphorylierungsstellen, die an der Regulation des Kernexportes beteiligt sind bzw. sein könnten. Dieser flexible N-terminale Bereich hat in PrV pUL31 eine Länge von 25 Aminosäuren, wobei auffallend viele basische Aminosäuren in Clustern und verschiedene mögliche Phosphorylierungsstellen enthalten sind. Computer-unterstütze Analysen (NLStradamus) erkennen in der Aminosäuresequenz ein bipartites NLS (AS 5-20). Um die Rolle des N-terminalen Bereiches in PrV pUL31 näher zu untersuchen, wurde dieser schrittweise verkürzt und die basischen Aminosäuren, sowie die möglichen Phosphorylierungsstellen, durch gerichtete Mutagenese durch Alanin ersetzt. Getestet wurden diese Mutanten nach Transfektion der entsprechenden Expressionsplasmide in RK13 Zellen auf ihre Lokalisation und, nach Koexpression von pUL34, auf Interaktion und der Umorganisation der Kernmembran. Über stabil-exprimierende Zelllinien und nach Infektion mit der UL31 negativen Virusmutante (PrV-∆UL31) wurde die Funktionalität in eplikationsassays und auch ultrastrukturell charakterisiert. Erstaunlicherweise zeigte sich, dass weder das bipartite NLS noch die vorhergesagten Phosphorylierungsstellen eine entscheidende Rolle spielen. Vielmehr konnte der größte Teil des N-Terminus ohne sichtbaren Funktionsverlust deletiert werden, sofern mindestens ein Cluster basischer Aminosäuren in dieser Region erhalten blieb. Die Ergebnisse zeigten, dass der basische Charakter dieser Region entscheidend für die korrekte Lokalisation, sowie für die Bildung und Funktionalität des NEC ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung im N-Terminus von PrV pUL31, wie auch die roteinkinase pUS3, zwar nicht essenziell für die Freisetzung der Nukleokapside aus dem perinukleären Spalt sind, jedoch diesen Prozess unterstützen (Paper III).
Phenolics and its derivatives are aromatic compounds with a wide range of industrial applications. Gallic acid, protocatechuic acid, catechol or pyrogallol are only a few examples of industrially relevant aromatics. The production of bulk fine chemicals primarily for chemical and pharmaceutical industry has put a strong emphasis on optimizing manufacturing conditions. Commercial production of many chemicals is still based on organic chemical synthesis using petroleum derivatives as starting material. Since these processes are considered environmentally unfriendly and posing an irresponsible strain on limited fossil resources, much attention is paid to the development of new microbial factories for the bioproduction of industrially relevant chemicals using renewable sources or organic pollutants as starting material. Arxula adeninivoras is a non-conventional yeast possessing attractive properties for industrial application such as thermo- and osmotolerance. Another major advantage of this organism is its broad substrate spectrum with tannin at the forefront. The present project is dedicated to the study of the tannic acid degradation pathway in A. adeninivorans. Two genes encoding enzymes annotated as gallic acid decarboxylase (AGDC1) and catechol-1,2-dioxygenase (ACDO1) have been selected and investigated. Both enzymes were characterized and their function in tannin catabolism analyzed.
Herstellung sicherer und wirksamer Lebendvakzine gegen die Koi Herpesvirus Infektion von Karpfen
(2019)
Das Koi Herpesvirus (KHV, Cyprinid herpesvirus 3) verursacht eine tödliche Erkrankung bei Kois und Karpfen. Um sichere und wirksame Lebendvirusimpfstoffe zu erhalten, haben wir Einzel- und Doppeldeletionsmutanten von KHV erzeugt, aus deren Genom die für die beiden Nukleotidstoffwechselenzyme Thymidinkinase (TK, ORF55) und Desoxyuridin-Triphosphatase (DUT, ORF123) codierenden Leserahmen gezielt entfernt worden waren. Die Mutationen wurden durch homologe Rekombination in den zellkulturadaptierten aber noch virulenten Stamm KHV-T eingeführt. Umfangreiche in vitro Tests zeigten, dass die Deletion der TK- und DUT- Gene die KHV-Replikation in Zellkultur (CCB Zellen) nicht erkennbar beeinträchtigt. In vivo Tests an Jungkarpfen zeigten jedoch eine im Vergleich zum Ausgangsvirus signifikant reduzierte Virulenz der Einzelgen-Deletionsmutanten eine fast vollständige Attenuierung der Doppelmutante. Dennoch waren alle immunisierten Karpfen gegen eine letale Belastungsinfektion mit virulentem KHV geschützt. Mittels einer neu entwickelten Triplex-Real-Time-PCR und aus Kiementupferproben isolierter DNA war es möglich, mit TK-negativem KHV immunisierte und Wildtyp- infizierte Karpfen zu differenzieren. Daher könnte die Doppelmutante KHV- TΔDUT/TK als genetischer Marker-Impfstoff geeignet sein.
In einer zweiten Studie wurde die Funktion von vier immunogenen Hüllglykoproteinen der ORF25-Genfamilie (ORF25, ORF65, ORF148 und ORF149) von KHV untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass alle vier Gene für die Virusreplikation in Zellkultur entbehrlich sind. Während die Deletion von ORF65 keinen erkennbaren Einfluss auf die Virusvermehrung hatte, führte die Deletion von ORF148 sogar zu einer leicht erhöhten Replikationsrate. Im Gegensatz dazu bewirkten Deletionen von ORF25 oder ORF149 einen verzögerten Eintritt in die Wirtszellen und damit auch eine verlangsamte Vermehrung und Ausbreitung der Viren. Interessanterweise führte die gemeinsame Deletion der Gene ORF148 und
ORF149 zu einem wildtypähnlichen Wachstumsverhalten, das auf gegensätzlicher Funktionen der beiden Proteine hindeutete. Elektronenmikroskopische Untersuchungen von CCB-Zellen, die mit den verschiedenen Glykoproteindeletionsmutanten infiziert waren, zeigten keine Auswirkungen auf die Bildung und Reifung der Virionen im Zellkern oder im Zytoplasma, oder die Virusfreisetzung. Im Tierversuch erwiesen sich KHV-Mutanten mit Deletionen der Gene ORF148 und/oder ORF149 als geringfügig, aber für eine Verwendung als Lebendvirus-Impfstoff nicht ausreichend abgeschwächt. Überlebende Fische waren jedoch gegen Belastungsinfektionen ebenso gut geschützt wie Wildtyp-infizierte Karpfen, so dass die Deletion dieser antikörperinduzierenden Proteine zur Entwicklung von KHV-Markerimpfstoffen beitragen könnte, die eine serologische Differenzierung von Wildtyp-infizierten und geimpften Fischen erlauben (DIVA- Prinzip). In einer dritten Studie wurden durch serielle Zellkulturpassage von virulentem KHV und anschließende in vivo Infektionsversuche Hinweise darauf gefunden, dass das bislang nicht näher charakterisierte, neben dem ORF149 Gen lokalisierte ORF150 für einen weiteren Virulenzfaktor von KHV codiert. Möglicherweise könnte also durch eine kombinierte Deletion der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten KHV-Gene ein sicherer und wirksamer, genetisch und serologisch differenzierbarer Markerimpfstoff hergestellt werden.
Die Spezies Kuhpockenvirus (CPXV), ein Mitglied des Genus Orthopoxvirus, ist endemisch in weiten Teilen Europas und Asien verbreitet. CPXV besitzt ein sehr breites Wirtsspektrum und zählt zu den zoonotischen Erregern. Phylogenetische Analysen deuten darauf hin, dass CPXV polyphyletisch ist. Die bisher definierten Kladen wurden in vorliegender Arbeit bestätigt. Die 20 neu gewonnenen CPXV-Stämme verschiedenster Wirtsspezies gruppieren vorrangig in die CPXV-like 1 und CPXV-like 2 Kladen. Ein CPXV-Stamm, isoliert von einem Neuweltaffen, erscheint jedoch als single branch und lässt sich keiner bisher bekannten Klade zuordnen.
Gegenwärtig ist über die Rolle der Wühlmäuse, die als Reservoirwirt der Kuhpockenviren betrachtet werden, wenig bekannt. In vorliegender Arbeit sollte deshalb das aus einer Feldmaus (Microtus arvalis) stammende CPXV-Isolat FM2292 eingehend charakterisiert werden. CPXV FM2292 weist das bisher längste CPXV-Genom auf, das in die CPXV-like 1 Klade clustert. Neben der Sequenzanalyse sollten vergleichende experimentelle Infektionsstudien in Feldmäusen und Wistar-Ratten durchgeführt werden. Der Krankheitsverlauf nach intranasaler CPXV FM2292-Infektion bei Feldmäusen verlief subklinisch; Wistar-Ratten hingegen zeigten ausgeprägte klinische Symptome. Im Gegensatz dazu verursachte die Infektion mit einem aus einer Schmuseratte isolierten CPXV-Stamm bei den Feldmäusen eine starke Klinik. Daraus lässt sich schließen, dass Feldmäuse gegenüber Wühlmaus-assoziierten Stämmen, wie CPXV FM2292, eine Adaptation entwickelt haben. Die nachgewiesene Virusausscheidung weist auf eine Tröpfchen-basierte Übertragung hin.
Neben Feldmäusen sollten auch Rötelmäuse im Tierversuch näher betrachtet werden. Unabhängig vom eingesetzten CPXV-Stamm resultierten die experimentellen CPXV-Infektionsstudien in Rötelmäusen (Myodes glaerolus) in subklinischen Verläufen. Eine nasale Virusausscheidung konnte nicht detektiert werden, was im starken Kontrast zu den Ergebnissen aus experimentell infizierten Feldmäusen steht. Dennoch deuteten die Serokonversionsraten der Rötelmäuse darauf hin, dass eine Replikation im Wirt stattgefunden hat. Zudem entwickelten zwei Kontakttiere ebenfalls OPV-spezifische Antikörper, was auf eine Übertragung des Virus schließen lässt.
Wühlmäuse als Reservoirwirt dienen der Übertragung des Kuhpockenvirus auf akzidentielle Wirtsspezies wie Hauskatzen oder Nutztiere. Der in dieser Arbeit betrachtete Fallbericht eines mit CPXV-infizierten Fohlens zeigt, dass CPXV-Infektionen bei akzidentiellen Wirten mit stark ausgeprägter Klinik verbunden sein können. Zudem wird die wachsende Gefahr der Übertragung von CPXV auf Nutztiere und Menschen deutlich.
Zusammenfassend unterstreicht die in der vorliegenden Arbeit verwendete phylogenetische Betrachtung die genetische Variabilität der Spezies CPXV. Zudem konnten neue Erkenntnisse zu Feldmäusen und Rötelmäusen als Reservoirwirtsspezies gewonnen werden. CPXV-Infektionen von Wühlmäusen verlaufen subklinisch, im Gegensatz zu dem hier ebenfalls beschriebenen, lethal endenden CPXV-Infektionsverlauf eines akzidentiellen Wirts, eines abortierten Fohlens.
Next Generation Sequencing (NGS)-technologies developed very fast in recent years and is used widely in current research areas. The aim of this study was to use NGS (i) for the identification of pathogens in outbreaks and (ii) for the identification of virulence-relevant sequencepolymorphisms when comparing whole genome sequences. Therefore, a previous developed workflow was used to identify a new virus of the family Bornaviridae. The generation of whole genome sequences elucidated the molecular epidemiological connection of infection of variegated squirrels (Sciurus variegatoides) and three human cases of fatal encephalitis. By generating the whole genome sequence of a Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) in Germany it was possible to find difference compared to circulating high virulent strains in the USA. This led to potential virulence marker to distinguish strain in the USA and Germany. Connections between sequence variation and virulence were further investigated for the bovine viral diarrhea virus 2c (BVDV-2c), cowpox viruses (CPXV) and classical swine fever virus (CSFV). Here, for a highly virulent BVDV-2c strain a mixture of different genome structure variants could be found. The majority of these genomes harbors a duplication within the p7/NS2 coding region and might cause a high virulence. For CPXV virus isolated of different hosts were analyzed and a correlation between genome sequence and the A-type inclusion body phenotype could be found. Furthermore, several deletion/insertion events were detected which might influence the virulence of these strains. Finally, the virus population of CSFV strains in pigs was characterized. However, the population of the inoculum as well as of acute-lethal and chronically infected animals gave no indication that the virus itself causes the different types of disease outcome. In conclusion, this thesis shows the great potential of NGS for virus identification and characterization. Furthermore, it makes the identification of potential virulence marker possible which subsequently can be analyzed by reverse genetics.