570 Biowissenschaften; Biologie
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Herpesviren weisen einen komplexen Replikationszyklus auf, innerhalb dessen die einzelnen Schritte der Morphogenese der Nachkommenviren in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten ablaufen. Während die Kapsidmorphogenese und Genomverpackung im Zellkern der infizierten Zelle stattfinden, erfolgt die weitere Reifung zu infektiösen Virionen im Cytoplasma. Voraussetzung hierfür ist ein als nuclear egress bezeichneter Prozess, durch den die Kapside mittels eines envelopment-deenvelopment-Mechanismus an der Kernhülle Zugang zum Cytoplasma erhalten. Zielstellung der vorliegenden Arbeit war, mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie eine geeignete live-cell imaging-Methodik zu entwickeln, mit der der Transport der Kapside durch die Kernhülle dargestellt werden konnte, um die Dynamik dieses Prozesses aufzuklären.
Inflammation is an adaptive response that is triggered by noxious stimuli and conditions, such as infection and tissue injury. Neutrophils, eosinophils, monocytes, tissue macrophages and dendritic cells can all ingest bacteria, tissues debris and apoptotic cells after injury or infection. These cells derived from bone marrow progenitors, circulate in the blood and migrate to peripheral tissues. Macrophages produce and secrete a cascade of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines, such as interleukin-6 (IL-6), IL-10, and IL-12 that are trafficked and secreted by constitutive exocytosis. IL-10 and IL-6 are known to be rapidly induced during infection and / or injury, which make them possible mediators of early phagocyte recruitment. This thesis work aimed at detailed investigation of role of these cytokines in peritoneal inflammation. Under normal physiological conditions peritoneal cavity of normal BALB/c mice contains mainly CD45+ lymphocytes and CD11b+ myeloid cells with typical macrophage phenotype. The resident peritoneal cells play an important role in organismal homeostasis by taking part in innate and adaptive immunity. To explore this in detail, the physiological properties of peritoneal resident macrophage populations were studied under steady state and during inflammation conditions. Upon rapid induction of sterile inflammation by thioglycollate or lipopolysaccharide, the resident peritoneal cells could no longer be recovered in a peritoneal wash 6h after treatment. During ceacal content (CC) peritonitis, these cells were lost even more rapidly. Neutrophils, monocytes and lymphocytes replace the resident peritoneal phagocyte populations. During sepsis the absence of peritoneal macrophages decreases neutrophils recruitment to the inflammatory site and subsequently increases sepsis. Upon peritoneal wash cell transfer, total peritoneal cells could be recovered from the peritoneum of non infected mice, whereas these cells disappeared after CC infection in mice. The fate of resident peritoneal cells and their migration into lymphoid organs such as omentum and parathymic lymph nodes was further studied following induction of peritoneal infection. The CC infection induced lost cells from peritoneum were emigrated into omentum and parathymic lymph nodes but not in mesenteric lymph nodes. R1 cells were mostly observed in parathymic lymph nodes after 72h of infection but not after 1h, whereas, R2 cells were selectively observed in omentum just 1h after infection and 72h as well. These results were further confirmed by adoptive transfer showing emigration of R2 cells into omentum 1h after infection. Additionally, analysis of cytokine production after CC peritonitis showed early production of IL-10 and IL-6, which is in agreement with earlier findings and further supports the importance of these cytokines in phagocyte recruitment. The role of IL-10, IL-6 and other cytokines as possible mediators of early inflammation and in the recruitment of monocytes, neutrophils or eosinophils to the peritoneum during inflammation was determined by cytokine application. The intraperitoneal application of IL-10 recruited monocytes, neutrophils, T cells, B cells and eosinophils to the peritoneum. However, IL-10 knockout mice showed even increased recruitment of leucocytes to the peritoneal cavity in CC infection suggesting their IL-10 independent recruitment with the exception of eosinophils. Even though eosinophils are effector cells which are recruited to the site of inflammation; during homeostasis eosinophils constitute an abundant leukocyte population in the gastrointestinal tract. Therefore, possible role of eosinophils in bacterial infection was further studied using Δdbl GATA mice which lack mature eosinophils. In the absence of eosinophils, the monocyte and neutrophil recruitment was unaffected after CC infection, while there was increased T and B cell recruitment at the same time. The Δdbl GATA mice also showed reduced production of IL-4, 18h after infection. The eosinophils secrete IL 4 which may induce alternative macrophage activation. These results together with cytokine administration and IL-10 ko mouse data suggest a novel and major role of IL-10 in attracting and in recruiting eosinophils after peritoneal infection. Altogether, present thesis work demonstrates a new aspect of IL-10 interaction with eosinophils in mouse peritoneal environment during peritonitis. It gives a new insight for understanding the possible role of eosinophils in modulating the peritoneal environment in resolution of bacterial infection and can be useful in designing new approaches for therapeutic strategies in combating sepsis and peritoneal inflammation.
Reactive oxygen species (ROS) can damage all cellular macromolecules and also produce secondary reactive intermediates, like reactive electrophilic species (RES) that include quinones or aldehydes. Low molecular weight (LMW) thiols are small thiol-containing compounds that play essential roles in the defense against ROS and RES in all organisms. The best studied LMW thiol is the tripeptide glutathione (GSH). Firmicutes bacteria including Bacillus und Staphylococcus species have been recently discovered to utilize the redox buffer bacillithiol (BSH). LMW thiols function as redox buffers to maintain the reduced state of the cytoplasm. Under conditions of oxidative stress, LMW thiols also react with protein thiols to form mixed LMW thiol – protein disulfides, termed S-thiolations, as major protection mechanism. Investigating the role of BSH in oxidative stress response and ROS-induced S-thiolations in Firmicutes bacteria was one subject of this PhD thesis. Specifically, the regulatory mechanisms and post-translational thiol-modifications in response to NaOCl stress were studied in the model bacterium for low-GC Gram-positive bacteria Bacillus subtilis. The transcriptome profile after NaOCl stress was indicative of disulfide stress and overlapped strongly with the response to diamide. NaOCl stress caused induction of the thiol- and oxidative stress-specific Spx, CtsR, PerR and OhrR regulons. Thiol redox proteomics identified only few NaOCl-sensitive proteins with reversible thiol-oxidations. Using mass spectrometry, eleven proteins were identified that were oxidized to mixed BSH protein disulfides (S-bacillithiolated) in B. subtilis cells after NaOCl-exposure. Methionine synthase MetE is the most abundant S-bacillithiolated protein in B. subtilis and other Bacillus species after NaOCl exposure. S-bacillithiolation of OhrR repressor leads to upregulation of the OhrA peroxiredoxin that confers together with BSH specific protection against NaOCl. S-bacillithiolation of MetE, YxjG, PpaC, and SerA causes hypochlorite-induced methionine starvation as supported by the induction of the S-box regulon. To further assess the conservation of targets for S-bacillithiolations in other Firmicutes bacteria, we studied the S-bacillithiolomes of Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, and Staphylococcus carnosus under NaOCl stress conditions. In total, 54 S-bacillithiolated proteins were identified, including 29 unique proteins and 8 conserved proteins involved in amino acid and cofactor biosynthesis, nucleotide metabolism, translation, protein quality control, redox and antioxidant functions. Together our data support a major role of BSH redox buffer in redox control and thiol protection of conserved and essential proteins against irreversible oxidation by S-bacillithiolations in Firmicutes bacteria. In response to ROS and RES, bacteria also activate the expression of antioxidant and detoxification enzymes, such as catalases, peroxidases, thiol-dependent peroxiredoxins and other specific oxidoreductases to detoxify ROS and RES. These defense mechanisms are often controlled by redox-sensitive transcription factors. B. subtilis encodes redox-sensing MarR-type regulators belonging to the OhrR and DUF24-families that are conserved among bacteria. Hence, we were further interested in this PhD thesis to study at the molecular and structural level the redox-sensing mechanisms of novel redox-sensing MarR/DUF24-type regulators in B. subtilis. We have characterized the regulatory mechanisms of HypR, YodB and CatR that sense and respond to hypochlorite, diamide and quinones stress. HypR is the first DUF24-family regulator whose crystal structure was resolved. HypR senses specifically disulfide stress and controls positively expression of the flavin oxidoreductase HypO after NaOCl and diamide stress. HypR resembles a 2-Cys-type regulator with a reactive nucleophilic N-terminal Cys14 and a second C-terminal Cys49. Besides HypR, B. subtilis encodes further MarR/DUF24-family members including the paralogous YodB and CatR repressors that sense quinones and diamide. YodB controls the azoreductase AzoR1, the nitroreductase YodC, and the Spx regulator. YodB resembles a 2-Cys-type MarR/DUF24-family regulator with three Cys residues (Cys6, Cys101, and Cys108) that form intermolecular disulfides in vivo under oxidative stress. YodB and its paralog CatR were further identified as repressors of the catDE operon encoding a catechol-2,3-dioxygenase that also contributes to quinone resistance. Although CatR is a 1-Cys-type regulator, our data showed that CatR also forms intermolecular disulfide in response to diamide and quinones in vitro. Thus, HypR, YodB and CatR are controlled by 2-Cys-type thiol-disulfide redox switches to sense disulfide and RES stress conditions, and to control specific RES detoxification enzymes.
Die Analyse bakterieller Phosphoproteome rückt durch die Einflussnahme von Phosphorylierungsereignissen im Virulenzgeschehen pathogener Mikroorganismen immer weiter in den Vordergrund. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der globalen Analyse bakterieller Phosphoproteome unter Anwendung verschiedener Techniken der Proteomforschung. Ziel war es, einen möglichst umfassenden Überblick über das cytosolische Phosphoproteom zu gewinnen, die Dynamik der Protein-Phosphorylierungen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu analysieren und daraus folgend Hinweise auf regulatorische Mechanismen zu erhalten. Im Zuge der Untersuchungen zum Phosphoproteom von Bacillus subtilis wurde das auf den phosphosensitiven Pro-Q® Diamond-Farbstoff basierende 2D-Gel-Färbeprotokoll optimiert und validiert. Ferner wurde dieses Protokoll erfolgreich für die Untersuchungen des Phosphoproteoms von Mycoplasma pneumoniae und Staphylococcus aureus eingesetzt. Durch die Etablierung einer Methode zur Phosphopeptidanreicherung konnte der Blick auf das Gesamtphosphoproteom von S. aureus komplementiert werden. Insgesamt war es dadurch möglich, 103 phosphorylierte Proteine und 68 verschiedene Phosphorylierungsstellen von S. aureus zu identifizieren, darunter z. B. den Virulenzregulator SarA, dessen Phosphorylierung einen Hinweis auf seine mögliche Regulation aufzeigt. Zusätzlich konnten die Phosphorylierungsergebnisse der Fruktose-1,6-Bisphosphataldolase erste Hinweise auf eine Regulation der Substratbindung liefern und einen Erklärungsansatz enstehen lassen, der die Wirkungslosigkeit einiger in der Literatur beschriebenen Enzyminhibitoren (potentielle antimikrobielle Wirkstoffe) in in vivo Studien darlegt. In einem auf der Pro-Q® Diamond-Färbung beruhenden Quantifizierungsansatz konnten 10 signifikante Veränderungen in der Signalintensität der phosphorylierten Proteine unter Glukosehunger, nitrosativem, oxidativem und osmotischem Stress festgestellt werden. Diese liefern erste Indizien auf durch Phosphorylierungsereignisse gesteuerte Regulationsmechanismen. Besonders die unter nitrosativen Stress neu auftretenden putativ phosphorylierten Proteinspots der Proteine FdaB (Fruktose-Bisphosphataldolase) und HchA (molekulares Chaperon Hsp31/Glyoxalase 3) lassen Spekulationen über neue Stoffwechselwege, wie z. B. einen Methylglyoxal detoxifizierenden Mechanismus, zu. Darüber hinaus konnten durch die Glukosehungerexperimente und die Spezifizierung der Phosphorylierungsstelle T537 der Pyruvatkinase von S. aureus ein Regulationsmechanismus vorgeschlagen werden, der das "Finetuning" des Energieladungszustandes der Zelle über einen Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsmechanismus beschreibt. Von weiterem Interesse war die Identifizierung von am Arginin phosphorylierten Peptiden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde hierfür das Phosphopeptid-anreicherungsprotokoll optimiert, so dass in Zusammenarbeit mit A. Elsholz (Inst. f. Mikrobiologie, EMAU Greifswald) die Identifizierung von phosphorylierten Argininresten der Argininkinase McsB und der ATPase ClpC in B. subtilis möglich wurde. Darüber hinaus wurde die Methode in globalen Untersuchungen einer Phosphatasemutante (∆ywlE, B. subtilis) angewandt. Mittels der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten massenspektrometrischen Analyse der angereicherten Peptide konnten 111 Arginin-Phosphorylierungsstellen identifiziert werden. Zur Verbesserung der Quantifizierung von phosphorylierten Proteinen in B. subtilis wurde ein Protokoll entwickelt, indem das Auftrennungspotential des 2D-Gels, die Identifizierung phosphorylierter Proteine anhand des Pro-Q® Diamond-Farbstoffs und die auf die metabolische Markierung beruhende Quantifizierung miteinander kombiniert wurde. Im Ergebnis konnte anhand dieser Methode eine bessere Reproduzierbarkeit und eine höhere Sensitivität bei geringeren Veränderungen im Vergleich zu dem Pro Q® Diamond basierten Quantifizierungsansatz erzielt werden.
Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) represents the third most produced species of diadromous fish, with the total production of 0,732 million tonnes in 2009. More than one third of this production comes from Europe, where it is dominated by Norway, Italy and France. Germany is the fifth biggest producer in Europe, producing 21 thousand tonnes of rainbow trout in the value of 6,1 million Euro. However, the conditions in the intensive aquaculture often increase the disease susceptibility to many pathogens. One of the highest economic threats for a salmonids aquaculture is the causative agent of furunculosis, Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. Several strategies have been developed to protect the fish, but the traditional methods are either laborious or represent a potential risk for the environment. The selective breeding established more than 35 years ago in the brackish waters of Baltic Sea represent a attractive alternative, delivering a novel strain of rainbow trout better adapted to the brackish environment and exhibiting reduced mortality in the infection with A.salmonicida. Nevertheless, no information was available about the fundaments of this phenomenon. Thus, the aim of presented study was the identification of immune adaptations, which occurred during the 30 years of selection and favoured increased survival of “born” trout to the bacterial diseas es. In the presented work, the peritoneal cavity of rainbow trout has been used as a model for the investigation of disease resistance in fish. In the first chapter, the peritoneal cavity has been described as a unique niche of teleost immune system and the kinetic of peritoneal leukocytes induced by the stimulation has been analysed. Furthermore, a unique set of monoclonal antibodies has been used to evaluate the contribution of distinct cell populations on the inflammation and its resolution. In the second part of the study, the transcriptional changes of peritoneal leukocytes have been evaluated using the GRASP microarray. The following analysis provided unique insights into the local immune response in rainbow trout. The unprecedented combination of both data sets offers an unparalleled description of the local immune response in teleost fish and can be summarized into following facts. In general, the obtained results revealed, that the unstimulated peritoneal cavity is populated predominantly by lymphocytes with IgM+ Bcells being the major cells type. The rapid changes in the composition induced by the stimulation were underlined by the upregulation of major proinflammatory molecules such as IL1β, IL8 and TNFα within 12hpi. Although the initial phase of the reaction was dominated by myeloid cells, the cavity underwent within 72 hours two complete changes in the composition corresponding with the massive changes in the transcriptome. Eventually, the resolution of inflammation was marked by an increasing number of lymphocytes and correlated with the downregulation of pro-inflammatory genes to the initial level and upregulation of anti-inflammatory cytokines IL10 and TGFβ. Besides the general observations common to all treatments and both strains, our experiments revealed also remarkable differences between the antigenic stimulation and reaction towards pathogen. From these differences following conclusions can be drawn; the infection induces comparable reaction pattern as the stimulation, although the intensity of the reaction and number of cells is higher. These observations correlated with the higher expression of inflammatory molecules after the infection. Viable bacteria also prolong the myeloid phase of the reaction and delay the resolution of inflammation. Finally, model of peritoneal inflammation caused by A. salmonicida has been applied also to the second strain of rainbow trout, known for its higher resistance to infection. The comparison of obtained data suggested that resistant trout reacted to the antigenic stimulation and infection with a lower number of cells despite minor differences in the expression level of major pro-inflammatory molecules during early stages of the infection. Eventually, the resolution of inflammation and onset of adaptive immune response occurred in resistant trout almost 24 hours earlier and was correlating with an increased expression of anti-inflammatory cytokines IL10 and TGFβ. Notably, the increased survival of resistant strain correlates with the increased expression of antibacterial proteins such as NRAMP and hepcidin. Taken together, obtained data provided unprecedented insights into the local immune response in teleost fish and identified features conserved during the selection breeding in the brackish water of Baltic Sea. Additionally, combination of cellular and molecular data elucidates the peritoneal inflammation in fish and suggested high conservation of the immune response in the evolution.
Hantaviruses (family Bunyaviridae) are enveloped viruses with a segmented RNA genome of negative polarity. They can cause two different diseases in humans, the hemorrhagic fever with renal syndrome in Europe and Asia and the hantavirus cardiopulmonary syndrome in America. The transmission to humans is mainly indirect by inhalation of aerosolized virus-contaminated rodent excreta. In contrast to the initial assumption that hantaviruses are mainly carried by rodents, during the last years many novel hantaviruses were detected in shrews, moles and recently in bats. These findings raise important questions about the evolutionary history of hantaviruses, their host association and adaptation, the role and frequency of spillover infections and host switch events. This study aims to prove the presence, geographical distribution and host association of the rodent-borne Tula virus (TULV) and the shrew-associated Seewis virus (SWSV) in Central Europe. For this purpose, novel laboratory techniques for molecular and serological hantavirus detection were developed. Initially, a broad-spectrum molecular assay to identify small mammal species from Central Europe was developed. This novel assay is based on PCR amplification using degenerated primers targeting the cytochrome b (cyt b) gene, nucleotide sequence analysis of the amplified cyt b gene portion and followed by pairwise sequence comparison to published sequences using the BLAST function of GenBank. Different small mammal species prevalent in Central Europe could be determined by this new approach, including not only representatives of various Rodentia and Soricomorpha, but also representatives of the orders Erinaceomorpha, Lagomorpha, Carnivora and Chiroptera. For characterization of insectivore-borne hantavirus Thottapalayam virus (TPMV), specific monoclonal antibodies were generated that detect native virus in infected mammalian cells. For the detection of TPMV-specific antibodies, Asian house shrew Suncus murinus immunoglobulin G (IgG)-specific antibodies were produced in laboratory mice and rabbit. Using this anti-shrew IgG and recombinant TPMV nucleocapsid (N) protein, an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed allowing the detection of TPMV N protein-specific antibodies in immunized and experimentally TPMV infected shrews. A Pan-Hantavirus SYBR-Green RT-qPCR was developed for the search to novel hantaviruses. By this novel RT-qPCR and other conventional RT-PCR approaches, TULV infections were identified for the first time in the Eurasian water vole Arvicola amphibius from different regions in Germany and Switzerland. The phylogenetic analyses of the different partial TULV small (S)-, medium (M)- and large (L)-genome segment sequences from A. amphibius, with those of Microtus arvalis- and M. agrestis-derived TULV lineages, revealed a geographical, but host-independent clustering and may suggest multiple TULV spillover or a potential host switch from M. arvalis or M. agrestis to A. amphibius. In a further comprehensive study, different shrew species (Sorex araneus, S. minutus, S. coronatus, and S. alpinus) were collected in Germany, Czech Republic, and Slovakia and screened by another L-segment-targeting Pan-Hantavirus RT-PCR approach. This screening revealed hantavirus L-segment sequences in a large number of S. araneus and a few S. minutus indicating a broad geographical distribution of this hantavirus. For detailed analyses, S-segment sequences were obtained, from S. araneus and S. minutus. The sequences demonstrated their similarity to SWSV sequences from Hungary, Finland, Austria and Germany. A detailed phylogenetic analysis showed low intra-cluster sequence variability, but high inter-cluster divergence suggesting a long-term SWSV evolution in local shrew populations. In conclusion, the investigations demonstrated a broad geographical distribution and multiple spillover infections of rodent-borne TULV and shrew-borne SWSV in Europe. The finding of putative spillover transmissions described here and in other studies underline the current problem of the hantavirus reservoir host definition. In contrast to the hypothesis of a long-standing hantavirus–rodent (small mammal) host coevolution, the investigations support a more dynamic evolutionary history of hantavirus diversification including spillover infections and host-switch events. In future in vitro and in vivo infection studies as well as field studies has to define factors determining the host specificity of these hantaviruses.
This thesis will discuss the different fields of application of the two soft ionization techniques ESI and MALDI in microbial proteomics and their importance for a better understanding of bacteria physiology. The general development in the past 25 years coming from 2D-gel analysis and protein identification by peptide mass fingerprint analysis via MALDI-TOF to genome wide quantitative LC-ESI-MS experiments with fast and sensitive ESI instruments is exemplary shown for the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis in article I. Even though 2D-PAGE in conjunction with MALDI-MS is still an important tool in proteomic research, the more recently established global quantitative LC-ESI-MS workflows gain more and more relevance as they overcome 2D-PAGE based protein restrictions and enable the acquisition of higher accurate protein quantities. In article II such a workflow was used to analyze the physiological adaptation of Staphylococcus aureus to vancomycin treatment on a global-scale. Also post-translational modifications of proteins, that are important for regulation of their activity and allow rapid adaption to changed environmental conditions, could be analyzed by LC-ESI-MS workflows using special enrichment strategies (article III and IV). Despite the mentioned discrimination and less accurate quantification of proteins, 2D-PAGE analyses are still advantageous when analyzing large-scale time series experiments. To gain highly time resolved data but also very accurate relative quantities on a global-scale, 2D-PAGE-MALDI-MS and LC-ESI-MS techniques have been combined to investigate dynamic proteome adaptations of B. subtilis during nutrition shift as part of a global systems biology approach (article V). Also absolute quantities of proteins are of high interest for systems biology, but are still challenging to obtain on large-scale as well as with sufficient accuracy. In article VI a method that again combined 2D-PAGE-MALDI-MS and LC-ESI-MS was introduced to gain absolute protein quantities on global-scale. Utilizing the complementarity of 2D-PAGE and LC-ESI-MS this new workflow enabled fast and cost efficient data acquisition on absolute scale. In article VII we described for the first time a global quantitative LC-MALDI-MS workflow. Cross validation with an LTQ Orbitrap proofed that LC-MALDI-MS is able to process complex samples and obtain highly reliable quantities. The comparative analysis of data gained with both instrument types revealed biases for certain biochemical properties of MALDI as well as ESI instruments, resulting in a general complementarity of both ionization techniques. Article I Becher, D., Büttner, K., Moche, M., Hessling, B., Hecker, M., 2011. From the genome sequence to the protein inventory of Bacillus subtilis. Proteomics 11, 2971–2980. Article II Hessling,B., Bonn,F., Herbst,F.-A., Rappen,G.-M., Bernhardt,J., Hecker,M. and Becher,D. Global proteome analysis of vancomycin stress in Staphylococcus aureus. Submitted to Mol. Cell Proteomics. Article III Elsholz, A.K.W., Turgay, K., Michalik, S., Hessling, B., Gronau, K., Oertel, D., Mäder, U., Bernhardt, J., Becher, D., Hecker, M., Gerth, U., 2012. Global impact of protein arginine phosphorylation on the physiology of Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7451–7456. Article IV Chi, B.K., Gronau, K., Mäder, U., Hessling, B., Becher, D., Antelmann, H., 2011. S-bacillithiolation protects against hypochlorite stress in Bacillus subtilis as revealed by transcriptomics and redox proteomics. Mol. Cell Proteomics 10, M111.009506. Article V Buescher,J.M., Liebermeister,W., Jules,M., Uhr,M., Muntel,J., Botella,E., Hessling,B., Kleijn,R.J., Le Chat,L., Lecointe,F., et al. (2012) Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science, 335, 1099–1103. Article VI Maass, S., Sievers, S., Zühlke, D., Kuzinski, J., Sappa, P.K., Muntel, J., Hessling, B., Bernhardt, J., Sietmann, R., Völker, U., Hecker, M., Becher, D., 2011. Efficient, global-scale quantification of absolute protein amounts by integration of targeted mass spectrometry and two-dimensional gel-based proteomics. Anal. Chem. 83, 2677–2684. Article VII Hessling,B., Büttner,K., Hecker,M. and Becher,D. Global relative quantification with LC-MALDI – cross-validation with LTQ-Orbitrap proves reliability and reveals complementary ionization preferences. Submitted to Mol. Cell Proteomics.
Das gramnegative Bakterium Burkholderia pseudomallei ist der Erreger der Melioidose. Die Virulenz von B. pseudomallei steht in engem Zusammenhang mit dessen Fähigkeit,intrazellulär überleben zu können. B. pseudomallei verfügt über eine Vielzahl von Sekretionssystemen, von denen das Typ-III-Sekretionssytem-3 (T3SS-3) und das Typ-VI-Sekretionssystem-1 (T6SS-1) eine wichtige Rolle für den intrazellulären Überlebenszyklus und die Virulenz des Erregers im Säuger spielen. Das Gen bsaU ist im Gencluster des T3SS-3 und das Gen BPSS1504 im Cluster des T6SS-1 lokalisiert. Beide gehören nicht zu den konservierten Genen dieser Sekretionssysteme und kodieren für hypothetische Proteine mit unbekannter Funktion. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von bsaU und BPSS1504 im intrazellulären Lebenszyklus von B. pseudomallei und für die Virulenzeigenschaften dieses Erregers näher zu untersuchen, sowie Hinweise auf die Funktionen der durch bsaU und BPSS1504 kodierten Proteine zu gewinnen. Hierfür wurden markerlose Deletionsmutanten der Gene bsaU und BPSS1504 hergestellt und die Mutanten B. pseudomallei ΔBPSS1504 und B. pseudomallei ΔbsaU komplementiert. Die Mutante B. pseudomallei ΔBPSS1504 zeigte im Zellkulturmodel Defekte in der intrazellulären Replikation, eine reduzierte Zytotoxizität und war unfähig, die Bildung von vielkernigen Riesenzellen zu induzieren, während die Fähigkeit Aktinpolymerisationen zu induzieren scheinbar nicht von der BPSS1504-Deletion beeinträchtigt wurde. Die Charakterisierung von B. pseudomallei ΔBPSS1504 in vivo zeigte eine etwa 1000-fache Virulenzattenuierung nach intranasaler Infektion von BALB/c-Mäusen. Durch Komplementation von BPSS1504 konnte der Wildtyp-Phänotyp wieder hergestellt werden. Ähnliche Phänotypen wie die von B. pseudomallei ΔBPSS1504 wurden kürzlich auch von Mutanten des T6SS-1-Effektorproteins Hcp1, der T6SS-1-Strukturkomponenten TssA/B und der T6SS-1 Regulatoren VirA/G und BprC berichtet. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass B. pseudomallei ΔBPSS1504 eine normale Expression von Schlüsselgenen des T6SS-1 inklusive hcp1, vgrG, tssA und dessen Regulatoren virA/G, bprC und bsaN aufwies. Weiterhin wies eine normale Hcp1-Sekretion darauf hin, dass die Funktionalität des T6SS-1 nicht von der BPSS1504-Deletion von beeinträchtigt wurde. Diese Daten legen nahe, dass die beobachteten Phänotypen von B. pseudomallei ΔBPSS1504, im Gegensatz zu den Phänotypen bisher bekannter Mutanten des T6SS-1,unabhängig von Hcp1 sind. Des Weiteren blieb auch die Funktion des T3SS-3 von der BPSS1504-Deletion unbeeinträchtigt, da das T3SS-3-Effektorprotein BopE und das Translokatorprotein BipD von B. pseudomallei ΔBPSS1504 normal sekretiert wurden. Ähnlich wie bei B. pseudomallei ΔBPSS1504, jedoch weniger stark ausgeprägt,konnten auch bei B. pseudomallei ΔbsaU Einschränkungen in der intrazellulären Replikation, eine verringerte Zytotoxizität sowie eine verzögerte Induktion der Riesenzellbildung gefunden werden. Die reduzierte Zytotoxizität von B. pseudomallei ΔbsaU ging mit Defekten in der Aktivierung der apoptotischen Caspase-7 sowie der pyroptotischen Caspase-1 einher. B. pseudomallei ΔbsaU konnte, wie Mutanten der T3SS-3-Gene bsaZ,bsaQ und bipD nur verzögert aus dem Endolysosomen ausbrechen. Dieser Effekt konnte durch Komplementation des bsaU-Gens zumindest teilweise wieder aufgehoben werden, was zeigt, dass es sich hierbei nicht um polare Effekte auf andere Gene handelt.
Herpesviren nutzen zwei unterschiedliche Zellkompartimente für die Morphogenese. Während der Kapsid-Zusammenbau und die DNA Verpackung im Zellkern stattfinden, erfolgt die weitere Assemblierung im Zytoplasma. Um dorthin zu gelangen muss die Kernmembranbarriere überwunden werden. Hierfür knospen die Nukleokapside an der inneren Kernmembran und erhalten dort eine primäre Virushülle, die allerdings nach Fusion mit der äußeren Kernmembran wieder verloren geht. Für diesen als envelopment-deenvelopment bezeichneten Vorgang ist ein Komplex aus zwei viralen Proteinen notwendig. Er besteht aus pUL34, einem Membranprotein der Kernmembran und dessen Interaktionspartner pUL31. Beide Proteine allein reichen aus, um Membranvesikel von der inneren Kernmembran abzuschnüren. Ziel dieser Arbeit war, diesen nuclear egress weiter zu charakterisieren. Hierfür sollte zunächst geklärt werden, welche Domänen von pUL34 für dessen korrekte Lokalisierung in der Kernmembran und der Interaktion mit dem Komplexpartner pUL31 notwendig sind. Dazu wurden chimäre Proteine aus Teilen des pUL34 und zellulären Proteinen der inneren Kernmembran hergestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass die pUL34-Transmembrandomäne keine virusspezifische Funktion besitzt und durch entsprechende Bereiche zellulärer Proteine ausgetauscht werden kann. Auch die Erweiterung der Substitution auf 50 C-terminale Aminosäuren führte zu einem funktionellen Protein, während ein Konstrukt mit einem Austausch von 100 C-terminalen Aminosäuren durch entsprechende Lap2ß Sequenzen den Defekt der PrV-deltaUL34-Deletionsmutante nicht mehr komplementieren konnte. Dennoch war noch immer eine Interaktion mit dem Komplexpartner möglich. Dies zeigte, dass zwischen den C-terminalen Aminosäuren 50 und 100 ein virusspezifischer, funktionell wichtiger Bereich liegt, der in nachfolgenden Arbeiten weiter eingegrenzt werden muss. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Aminosäuren 1-162 des PrV pUL34 für die Interaktion mit pUL31 ausreichen. Für das engverwandte HSV-1 konnte dieser Bereich jedoch auf die Aminosäuren 137 und 181 eingegrenzt werden. Um dies für PrV pUL34 näher zu untersuchen wurde das Konstrukt pUL34-LapNT hergestellt, bei dem die 100 N-terminalen Aminosäuren durch Lap2ß Sequenzen ersetzt wurden. Hier zeigte sich jedoch, dass pUL34-LapNT das pUL31 nicht mehr an die innere Kernmembran rekrutieren konnte und folglich den Defekt der PrV-delta UL34-Deletionsmutante nicht mehr komplementierte. Im Gegensatz zu HSV-1 scheinen hier auch die N-terminalen 100 Aminosäuren für die Interaktion mit pUL31 notwendig zu sein. Da die Expression von pUL34 und pUL31 allein ausreicht, um die Bildung von Membranvesikeln von der inneren Kernmembran abzuschnüren, sollte im Weiteren getestet werden, ob auch Kapside in diese Vesikel aufgenommen werden. Da bei Herpesviren die Kapside autokatalytisch gebildet werden und dies bereits für einige Herpesviren über Expression in rekombinanten Baculoviren nachgestellt werden konnte, sollte versucht werden, dies auch für PrV zu etablieren. Dabei sollte die Kapsidbildung über Transduktion in Säugerzellen unabhängig von einer PrV Infektion nachgestellt werden. Hierbei sollte geklärt werden, welche weiteren viralen Proteine, neben den eigentlichen Kapsidproteinen, wie z.B. das pUL17 und pUL25, für den nuclear egress notwendig sind. Obwohl alle Kapsidkomponenten kloniert und auch in Zellen exprimiert werden konnten, konnte keine Kapsidbildung nachgewiesen werden. Die Ursachen hierfür konnten nicht geklärt werden. Auffällig war, dass das Triplexprotein pUL38 in den Baculovirus-transduzierten Zelllysaten ein etwas anderes Laufverhalten als das in Zelllysaten PrV-infizierter Zellen aufwies, dessen Ursache nicht auf der Verwendung eines downstream lokalisierten Startkodons beruhte. Mit Hilfe dieser rekombinanten Baculovirusvektoren konnte jedoch gezeigt werden, dass das Hauptkapsidprotein pUL19 mit dem Gerüstprotein (pUL26 bzw. pUL26.5) und die Triplexproteine pUL18 und pUL38 gemeinsam in den Kern transportiert werden. Die Beteiligung zellulärer Proteine am nuclear egress sollte über siRNA Experimente untersucht werden. In einer vorangegangen Arbeit war gezeigt worden, dass p97, eine zelluläre AAA+ATPase, nach Infektion vermehrt exprimiert wurde. Ziel war es, die p97 Expression über siRNA zu reduzieren und den Effekt auf die Virusinfektion zu untersuchen. Eine erfolgreiche siRNA Studie war bereits für p97 in Rattenzellen publiziert und sollte hier angewandt werden. Leider waren die zur Verfügung stehenden Rattenzelllinien nur sehr ineffizient transfizierbar und zusätzlich auch schlecht mit PrV infizierbar. Das eigene Design und die Anwendung von p97 spezifischer siRNA für Kaninchenzellen zeigte zwar die gewünschte Reduktion der p97 Expression, war jedoch nur sehr schlecht reproduzierbar und konnte daher nicht für aussagekräftige Infektionsversuche verwendet werden.
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der meist gefürchtetsten pathogenen Mikroorganismen, der verantwortlich ist für eine Vielzahl von nosokomialen Infektionen und Krankheiten. S. aureus ist in der Lage, sich an verändernde Umweltbedingungen auf Ebene der Genexpression anzupassen, was zu unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen und somit zu Veränderungen in der Metabolitenkomposition und metabolischen Aktivität führt. Außerdem stellt die Fähigkeit, Resistenzen gegen gegenwärtig genutzte Antibiotika zu entwickeln, eine Gefahr dar und macht diesen Keim in seiner Behandlung so schwierig. Für ein vollständiges Verstehen der Proteom-, Transkriptom- und Metabolomdaten ist die Untersuchung der Enzymaktivitäten ein entscheidendes Hilfsmittel. In der vorliegenden Arbeit wurden die enzymkatalytischen Eigenschaften sowie die spezifischen Enzymaktivitäten der Enzyme des Intermediär- und Fermentationsstoffwechsels untersucht. Aus Zellen der logarithmischen, transienten und stationären Wachstumsphase unter aeroben wie auch anaeroben Bedingungen wurden für die Enzyme das pH-Optimum, die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (vmax) und die Substratkonzentration der halbmaximalen Reaktionsgeschwindigkeit (Km) bestimmt. In S. aureus COL wird die Glucose unter aeroben Bedingungen hauptsächlich über die Glycolyse metabolisiert. Glucose-6-phosphat wird weiter zu Pyruvat umgesetzt, welches wiederum durch die Pyruvat-Oxidase zu Acetylphosphat oder durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex zu Acetyl-CoA verstoffwechselt wird. Durch die Phosphatacetyl-Transferase wird das Acetyl-CoA im Folgenden ebenfalls zu Acetylphosphat umgesetzt und nicht dem Citrat-Zyklus zugeführt. Die Acetat-Kinase nutzt das Acetylphosphat zur Generierung von ATP. Geringe extrazelluläre Lactat-Konzentrationen weisen auf eine geringere Bedeutung der Lactat-Dehydrogenase unter aeroben Wachstumsbedingungen hin. Gleichwohl wird ein kleiner Teil des Pyruvates zur Regeneration von NAD+ durch die Lactat-Dehydrogenase genutzt. In der transienten und stationären Wachstumsphase werden die Gene der Enzyme für Gluconeogenese und Citrat-Zyklus vermehrt exprimiert. Lactat und Acetat werden als Kohlenstoff- und Energiequelle wieder aufgenommen und dienen der Bildung unterschiedlicher Intermediate, wie beispielsweise der Bildung von NADPH über Glucose-6-phosphat im Pentose-Phosphat-Weg. Lediglich die Citrat-Synthase, Isocitrat-Dehydrogenase und Fumarat-Hydratase des Citrat-Zyklus konnten enzymologisch untersucht werden, was auf eine geringe metabolische Aktivität im Citrat-Zyklus hinweist. Möglicherweise dient der erste Teil des Citrat-Zyklus nur der Einführung von Aminosäuren als Kohlen- und Stickstoffquelle in den Metabolismus. Unter anaeroben Bedingungen wird die Glucose in der Glycolyse und der gemischten Säuregärung zu Lactat und Ethanol umgesetzt. Hohe spezifische Enzymaktivitäten der Lactat- und Alkohol-Dehydrogenase konnten nachgewiesen werden. Die Energie in Form von ATP wird auch in dieser Phase des Wachstums durch Substratkettenphosphorylierung generiert. Bacillus subtilis 168 (B. subtilis 168) ist ein grampositives apathogenes Bakterium, das durch die Zugabe von Pyruvat auch zum Wachstum unter sauerstofffreien Bedingungen befähigt ist. Es exprimiert Enzyme der 2,3-Butandiol- und Lactatfermentation. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die enzymkatalytischen Eigenschaften von Enzymen des Intermediär- und Fermentationsstoffwechsels untersucht. In der logarithmischen Wachstumsphase wird die Glucose über die Glycolyse verstoffwechselt. Wie bei S. aureus COL ist der Eintritt des Glucose-6-phosphates in den Pentose-Phosphat-Weg aufgrund einer höheren spezifischen Enzymaktivität der Glucose-6-phosphat-Isomerase limitiert. Die Energie in Form von ATP wird auch hier hauptsächlich über Substratkettenphosphorylierungsreaktionen generiert. Die Bedeutung der Lactat-Dehydrogenase-Aktivität unter aeroben Bedingungen ist noch nicht eindeutig geklärt, jedoch kann davon ausgegangen werden, dass auch hier ein Teil des Pyruvates zur Regeneration von NAD+ durch die Lactat-Dehydrogenase umgesetzt wird. Unter anaeroben Bedingungen wurden hohe Lactat-Dehydrogenasen-Aktivitäten gemessen. Außerdem wird die Glucose zur Regeneration von NAD+ zu D-2,3-Butandiol fermentiert. Zusammenfassend ist zu sagen, dass enzymologische Untersuchungen und die Erforschung der spezifischen Enzymaktivitäten unter bestimmten Bedingungen ein gutes Hilfsmittel für metabolische Studien ist und diese gut mit vorhandenen Proteom- und Metabolomdaten verglichen werden können. Enzymanalysen sind nicht einfach handhabbar, bieten aber die Möglichkeit, einen Blick in die Physiologie von Mikroorganismen zu werfen. Für ein allumfassendes Verständnis ist es wichtig, Enzymaktivitäten zu untersuchen.