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Die Zellen des menschlichen Körpers sind von einer Membran umgeben, durch die das Cytoplasma vom Umgebungsmilieu abgegrenzt wird. Für die Aufrechterhaltung ihrer Stoffwechselfunktionen sind sie jedoch auf eine ständige Aufnahme und Abgabe verschiedenster Moleküle angewiesen. Für immer mehr Substanzen kann inzwischen gezeigt werden, dass deren Membranpassage durch spezifische Transportproteine vermittelt wird. Auch das Herzgewebe ist Ziel- und Wirkort einer Reihe endogener und exogener Moleküle wie beispielsweise Hormone oder Arzneistoffe, die für den Eintritt in die Zelle Transportproteine, sogenannte Carrier, benötigen. Die vorliegende Arbeit sollte daher dazu beitragen, die Expression des Anionentransporters "Organic Anion Transporting Polypeptide B" (OATP-B/OATP2B1), eines Mitglieds der Transporterfamilie OATP (SCL21), im humanen Herzen aufzuklären. Dazu wurde zunächst ein sequenzspezifischer Antikörper gegen das OATP-B hergestellt und an Plazentagewebe charakterisiert. Mit diesem Antiserum wurde anschließend im Westernblot und immunhistologisch die Expression und die zelluläre Lokalisation des OATP-B Proteins in humanen Herzgewebeproben untersucht. Weiterhin wurde die mRNA Expression des OATP-B in 46 Vorhof- und 15 Ventrikelproben überwiegend herzkranker Patienten mittels Real time PCR bestimmt und Unterschiede in der Expression im Hinblick auf anamnestische und klinische Daten statistisch analysiert. In allen untersuchten Proben wurde OATP-B nachgewiesen. Dabei zeigte sich eine starke Expression im Bereich des Endothels kleiner Gefäße, Kardiomyozyten wiesen eine deutlich schwächere OATP-B Expression auf. Zwischen Vorhof- und Ventrikelproben zeigte sich kein signifikanter Unterschied, ebenso hatten kardiale Erkrankungen oder allgemeine Merkmale wie das Körpergewicht, Alter oder Geschlecht, keinenn Einfluss auf die OATP-B Expression. Es fand sich jedoch bei Patienten, die CSE-Hemmer und hierbei insbesondere Atorvastatin einnahmen, eine signifikant geringere Expression der OATP-B mRNA als bei Patienten ohne CSE-Hemmer Medikation (p < 0,05). Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das OATP-B regelmäßig im humanen Herzen exprimiert ist, so dass eine Beteiligung des OATP-B an der kardialen Aufnahme seiner Substrate wie beispielsweise Steroid-Sulfate und CSE-Hemmer wahrscheinlich ist. Außerdem deuten die statistischen Ergebnisse auf mögliche Regulationsprozesse durch CSE-Hemmer bei der Expression des OATP-B hin.
Das Prostatakarzinom ist in den westlichen Ländern der häufigste Krebs des Mannes und verantwortlich für einen beträchtlichen Teil der von Krebs verursachten Todesfälle. Es ist in fortgeschrittenen Stadien einer Zytostatikatherapie nur schwer zugänglich, neue Therapieansätze sind deshalb notwendig. In dieser Hinsicht ist „tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand“ (TRAIL) ein aussichtsreicher Kandidat, da er selektiv toxisch auf Tumorzellen wirkt. Allerdings entfaltet TRAIL allein in vielen Tumorzellen keine ausreichende Wirkung. Die Beeinflussung intrazellulärer Resistenzfaktoren zur Sensibilisierung der Tumorzellen ist hier ein vielversprechender Ansatzpunkt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die spezifische Herabregulation der Proteinkinase C(eta); in PC3-Prostatakarzinomzellen durch chimäre Zweitgenerations-Antisense-Oligonukleotide die zytotoxischen Effekte von TRAIL signifikant verstärkt. Nach „Knock-down“ der PKC(eta); zeigt sich ein deutlicher Anstieg der TRAIL-induzierten Apoptose-typischen Veränderungen, wie Caspase 3-Aktivierung und nukleosomale DNA-Fragmentierung. Außerdem kommt es zur Verstärkung der TRAIL-induzierten Störung des mitochondrialen Membranpotentials und einer erhöhten Cytochrom c-Freisetzung, was dafür spricht, dass die PKC(eta); innerhalb des Apoptosesignalweges oberhalb der Mitochondrien wirksam ist. Die PKC(eta); kann in Bezug auf TRAIL somit als ein bedeutender Resistenzfaktor in Prostatakarzinomzellen angesehen werden und ist damit ein vielversprechender Angriffspunkt zur Verstärkung der antineoplastischen Effekte von TRAIL. Im weiteren werden in dieser Arbeit mit Bcl-2 und Bcl-xL zwei bekannte antiapoptotische Proteine mit der Fragestellung untersucht, ob sie als Resistenzfaktoren in der TRAIL-induzierten Apoptose von PC3-Prostatakarzinomzellen eine wichtige Funktion besitzen. Gegen die Erwartungen hat der „Knock-down“ von Bcl-2 jedoch keinerlei Auswirkungen auf den TRAIL-induzierten Zelltod. Anders Bcl-xL: dessen Herabregulation führt zu einer signifikanten Verstärkung der Störung der Mitochondrienfunktion, der Caspase 9- und 3-Aktivitäten und des apoptotischen Zelltodes nach TRAIL-Behandlung. Die beiden Proteine scheinen in Prostatakarzinomzellen also unterschiedliche Funktionen in Bezug auf den TRAIL-aktivierten Apoptoseweg zu haben, wobei Bcl-xL als vielversprechendes Zielmolekül zur Potenzierung der zytotoxischen Effekte von TRAIL genannt werden kann. Zusammengenommen legen diese Befunde nahe, dass PKC(eta); und Bcl-xL erfolgversprechende Zielmoleküle zur Verbesserung der Therapie des Prostatakarzinoms, vor allem im Hinblick auf eine mögliche therapeutische Anwendung von TRAIL, darstellen.
Das P-Glykoprotein stellt ein wichtiges membranäres Transportprotein zum Schutz des Organismus vor Xenobiotika sowie toxischen endogenen Metaboliten dar und ist an der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion von Blut-Gewebe-Schranken beteiligt. Außerdem beeinflussen Pgp-vermittelte Transportvorgänge die Pharmakokinetik einiger Arzneimittel. Eine Modulation der Pgp-Funktion ist in vielerlei Hinsicht von Bedeutung. Daher war es Ziel dieser Arbeit, die Interaktionen zweier unterschiedlicher Substanzen, des mit der AD assoziierten Beta-Amyloids und des Arzneistoffes Heparin, mit dem Pgp zu untersuchen und die modulatorischen Fähigkeiten auf die Aktivität des Effluxtransporters in einem Zellsystem zu bewerten. Dafür stand eine polar wachsende, mit humanem MDR1-transfizierte Zelllinie zur Verfügung, die sich zur Untersuchung des transepithelialen Transportes eignete. Bei der Durchführung der funktionellen in-vitro-Assays ließen sich eine signifikant verstärkte Akkumulation, ein signifikant inhibierter apikaler Efflux von Rh123 und die signifikant verminderte ATP-abhängige Rh123-Aufnahme in Membranvesikel in Gegenwart von UFH sowie LMWH im Pgp-überexprimierenden Epithelzellmodell nachweisen. Ein direkter Transport markierter Heparine konnte ebenso gezeigt werden. Als Kontrolle dienten zum Einen parentale LLC-PK1, zum Anderen zeigten vergleichende Betrachtungen bekannter Pgp-Modulatoren wie Verapamil oder CsA in diesen Transportversuchen ähnliche Ergebnisse. Neben inhibitorischen Effekten der Aβ-Peptide auf die Pgp-Funktion konnte ein direkter aktiver Pgp-vermittelter Transport von synthetischem Aβ1-40 und Aβ1-42 gezeigt werden. Sowohl in polarisierten Zellmonolayern aus MDR1-transfizierten LLC-Zellen, die als in-vitro-Modell für das vaskuläre Endothel der Blut-Hirn-Schranke dienen, als auch in aus den Zellen isolierten Membranvesikeln konnte ein vektorieller bzw. ATP-abhängiger Transport der fluoreszenzmarkierten Peptide nachgewiesen werden. Eine Beteiligung des Pgp wurde anhand der Minderung des Transportes durch den spezifischen Inhibitor CsA verifiziert. Damit stellen sowohl die Heparine als auch die Beta-Amyloide nicht nur Inhibitoren des Pgp-vermittelten Transportes dar, sondern können selbst zum breiten Spektrum der affinen Pgp-Substrate gezählt werden. Sie bewirken eine nachgewiesene pharma-kologische Modulation der Pgp-Aktivität und bieten Anhaltspunkte für weitere Untersuchungen der komplexen Funktionen des Transportproteins.
About 30 % of epileptic patients are non-responsive to multidrug antiepileptic therapy. One of non-responsiveness in epilepsy hypothesis claims that non-responsiveness occurs because of reduced access of antiepileptic drugs to their targets, as a result of increased efflux of antiepileptic drugs away from these targets. Transporters believed to be involved in non-responsiveness in epilepsy are mainly but not exclusively the members of the ABC superfamily including P-gp (MDR1, ABCB1), MRP1 (ABCC1), MRP2 (ABCC2) and others. These proteins are normally found in the blood-brain barrier and the blood-cerebrospinal fluid barrier where they function as protectors. There is emerging evidence that P-gp, MRP1 and MRP2 are up-regulated in epileptogenic brain tissue. The risk of non-responsiveness could be related also to the MDR1 or MRP2 gene polymorphisms. We hypothesised that changes in expression and function of multidrug transporters involved in non-responsiveness of epilepsy might be detectable not only in the brain but also in other tissues such as lymphocytes. Therefore we evaluated the expression of MDR1, MRP1 and MRP2 and function of P-gp in lymphocytes in patients with epilepsy and healthy subjects. Three groups of epileptic patients and 15 healthy subjects as a control group were included in the study. The patients’ group was defined as follows: Monotherapy – patients treated with carbamazepine monotherapy, without seizures - corresponded to group responders. Combined therapy – patients after monotherapy (two different medicines have been tried) and combined therapy (two trials of combined therapy), not free of seizures. Monotherapy and combined therapy groups each embraced 15 patients. Neurosurgery – patients who had undergone neurosurgery, afterwards were or were not additionally treated with carbamazepine, with or without seizures. This group comprised 24 patients. Combined therapy and neurosurgery groups composed the group of non-responders. The mRNA expression of MRP1, MRP2 and MDR1 by means of quantitative real-time PCR as well as MRP2 and P-gp protein content by Western blot in lymphocytes was measured. For P-gp functional analysis rhodamine efflux from lymphocytes and natural killer (NK) cells was performed. The influence of the polymorphisms C3435T, G2677T/A in the MDR1 gene and C24T, G1249A, C3972T in the MRP2 gene for the transporters expression, function and their association with non-responsive epilepsy phenotype was investigated. Our results showed that MRP1 expression in lymphocytes was significantly lower in epileptics than in healthy subjects. Non-responders had lower MRP1 mRNA content in lymphocytes than responders. We did not find any difference in MRP2 expression between epileptics and healthy volunteers. MRP2 mRNA levels in lymphocytes were higher in non-responders than in responders. However, at protein level epileptic patients had significantly lower MRP2 content in lymphocytes than controls. MRP2 protein content did not differ in responders and non-responders. There was no reliable correlation between MRP2 mRNA expression and MRP2 protein content in lymphocytes. Epileptics had significantly lower MDR1 expression in lymphocytes than healthy individuals. MDR1 expression was decreasing according to the consumption of antiepileptic drugs and seizures frequency: patients after neurosurgery had significantly lower MDR1 expression than patients after combined therapy and monotherapy. MDR1 expression was significantly lower in non-responders than in responders. At protein level epileptics had lower P-gp content than controls. Detected P-gp amount in lymphocytes did not differ between responders and non-responders. Rhodamine efflux from lymphocytes and NK cells did not differ significantly between epileptics and healthy subjects, but it was higher in patients after neurosurgery than in patients after monotherapy. Rhodamine efflux from NK cells, which are known to express the highest levels of P-gp, was significantly higher in non-responders than in responders. In this study, we showed that MRP1 mRNA expression in lymphocytes was significantly correlated to its expression in the brain. We detected also a significant co-correlation between MRP1 expression in the hippocampus and MDR1 expression in lymphocytes. We found no evidence regarding the impact of the MDR1 polymorphisms on mRNA expression, P-gp content and rhodamine efflux from lymphocytes. Our data showed lack of evidence regarding the impact of the MRP2 polymorphisms on mRNA expression and protein content. We did not detect any association between MDR1 or MRP2 polymorphisms and non-responsiveness in epilepsy or epilepsy in the main. In conclusion, our results suggest that lymphocytes are an appropriate surrogate for studies on changes of multidrug transporters expression in epilepsy. Lymphocytes as an easily accessible tissue might serve as a marker for responsiveness to antiepileptic drug therapy in epilepsy studies.
Bei der Aufnahme von Arzneimitteln in Zellen spielen Transportprozesse eine große Rolle. Das ATP-abhängige Transportprotein P-Glykoprotein vermittelt häufig Resistenzen gegenüber Arzneimitteln. Zunächst wurde dieser Effekt in P-Glykoprotein-überexprimierenden Tumoren entdeckt. Auch viele gesunde Gewebe enthalten P-Glykoprotein. Einige der Substanzen, die von P-Glykoprotein transportiert werden, sind vielverwendete Medikamente bei der Therapie von Herzerkrankungen. Die individuelle Expressionhöhe von P-Glykoprotein im Herzen könnte für das unterschiedliche Ansprechen von Patienten auf von P-Glykoprotein transportierte Medikamente verantwortlich sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression von P-Glykoprotein an 15 humanen Herzgewebeproben untersucht. Verwendet wurde die Methode der RT-PCR und die immunhistochemische Darstellung des Proteins. Die Expression von P-Glykoprotein in humanem Herzmuskelgewebe konnte an allen Proben gezeigt werden. Immunhistochemisch ist P-Glykoprotein in den Endothelzellen der Arteriolen und Kapillaren lokalisiert worden. Hinsichtlich der Expression bei verschiedenen Krankheiten konnte bei Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie eine signifikante Verminderung (p = 0,05) beobachtet werden. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen eine Beteiligung des Herzens an Transportprozessen. Intrakardiale Konzentrationen vieler Substanzen können abhängig von der individuellen P-Glykoprotein-Expression beeinflusst werden
ATP-abhängige Transporter spielen eine wichtige Rolle beim Transport von endogenen und exogenen Stoffen durch Zellmembranen. Die ATP-Transporter ABCG2 und MRP5 wurden in Medikamenten-resistenten Tumorzelllinien entdeckt. Später konnten sie auch in gesundem Gewebe nachgewiesen werden. Sie transportieren ganz unterschiedliche Stoffe, die keiner einheitlichen Gruppe angehören. ABCG2 transportiert unter anderem Medikamente, die in der Therapie maligner Erkrankungen eingesetzt werden und eine ausgesprochene Kardiotoxizität besitzen. MRP5 transportiert als Substrat zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP), welches bei der Relaxation glatter Muskelzellen kardialer Gefäße eine große Rolle spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von ABCG2 und MRP5 an 15 Proben humanen Ventrikelmyokards und 52 Proben humanen Vorhofgewebes von Patienten mit koronarer Herzkrankheit untersucht. Von den 15 Proben humanen Ventrikelmyokards waren fünf von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie (DCM), fünf von Patienten mit ischämischer Kardiomyopathie (ICM) und fünf von herzgesunden Patienten. Mittels realtime- RT-PCR wurde ABCG2- bzw. MRP5-mRNA in allen Proben nachgewiesen. Zum einen wurde mittels ausgewählter Primer eine ABCG2- bzw. MRP5-cDNA-Sequenz auf dem TaqMan® von Applied Biosystems vervielfältigt und anschließend statistisch ausgewertet. Zum anderen wurde ABCG2 bzw. MRP5 mit den monoklonalen Antikörpern BXP-21 bzw. AFM immunhistochemisch dargestellt. ABCG2 wurde außerdem mittels Immunfluoreszenz dargestellt. Die Expression von ABCG2 und MRP5 konnte in allen Proben humanen Herzgewebes mittels real-time PCR und Immunhistochemie / Immunfluoreszenz gezeigt werden. Hinsichtlich der Expression konnte für die mRNA von ABCG2 eine signifikante Erhöhung (p = 0,05) bei DCM und ICM gegenüber gesundem Gewebe gezeigt werden. Die im Rahmen dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse weisen auf eine mögliche Beteiligung der ATP-Transporter ABCG2 und MRP5 an Transportprozessen am Herzen hin. Die Interaktionen von Pharmaka und die individuell unterschiedlichen Wirkungen am Herzen bei der Pharmakotherapie können durch diese Arbeit besser verstanden werden.
Die Variabilität von Arzneimitteln wird nicht nur durch die Spezifität der Substanzen für die Zielstrukturen bestimmt, sondern auch durch die interindividuelIe Variabilität von eliminierenden Prozessen. Im Hinblick auf die demographische Entwicklung mit zunehmendem Alter Schwangerer scheint auch die Notwendigkeit einer therapeutischen Intervention der Schwangerschaft wahrscheinlicher. Effekte von maternal gegebenen Arzneimitteln auf das sich entwickelnden Kind sind die Hauptrisiken einer schwangerschafts-assoziierten Therapie. Die Plazenta bildet die Schnittstelle zwischen Mutter und Kind und ist sowohl an der Versorgung, als auch an der Protektion des Kindes beteiligt. Es konnte bereits in vorhergehenden Studien gezeigt werden, dass Transportproteine welche auch die Mitglieder der ABC (ATP-binding cassette) Transporter Familie einschließen, an der Schutzfunktion beteiligt sind. Aus diesem Grund wurde die Expression Lokalisation und Funktion von Mitgliedern der ABC-Transporter in der Plazenta untersucht. Näher betrachtet wurden P-Glykoprotein (ABCB1), Breast Cancer Restance Protein (ABCG2), Multidrug Resistance Protein 2 (MRP2) und MRP5. Quantitative Real-Time Reaktion ergab tue Expression der Transport in allen untersuchten 60 Proben von Früh- und Termingeburten. Nachgewiesen werden konnte eine mit den Gestationsalter abnehmende Expression von MRP5, während die MRP2 und P-Glykoprotein mRNA mit dem Gestationsalter anstieg. Western Blot Analysen von Membranpräparation zeigte ähnliche Ergebnisse. Mittels Immunfluoreszenz Mikroskopie konnte MRP5 hauptsächlich in der basalen Membran des Synzytiotrophoblasten und in der Umgebung voll fetalen Gefäßen nachgewiesen werden, während die anderen 'Transporter hauptsächlich in der apikalen Syzytiotrophohlasten- Mernbran lokalisiert waren. Darüber hinaus wurde die Veränderung der Expression der Transporter in isolierten Zytotrophoblasten untersucht. Diese Vorläuferzellen des Synzytiotrophoblasten differenzieren in vitro und bilden ein multinukleäres Synzytium. Es zeigte sich, dass mit zunehmender Differenzierung die Expression der Transporter mit der hCG-Sekretion - einem biochemischem Marker der Differenzierung- ansteigt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Expression der hier untersuchten Transporter vorn Gestationsalter abhängig ist und sich mit der Differenzierung der Cytotrophoblasten verändert.
Als Folge eines akuten Myokardinfarktes kommt es zu einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration assoziiert mit einer Aktivierung der kardialen Cysteinproteasen Calpain I und II. Diese scheinen in der Pathogenese von Gewebeschäden und Nekrose nach Myokardinfarkt eine wesentliche Rolle zu spielen. Darüber hinaus gibt es Hinweise auf eine Beteiligung von Calpain I bei kardialen Umbauprozessen nach Infarkt. Calpaininhibitoren könnten daher in der Therapie des Myokardinfarkts erfolgreich eingesetzt werden. Unter den Bedingungen einer kardialen Ischämie konnte bei einigen dieser Substanzen eine kardioprotektive Wirkung demonstriert werden. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde ein Aktivitätsprofil der beiden Calpainformen im infarzierten und nicht-infarzierten Myokard erstellt und die Auswirkungen des Calpaininhibitors CAL 9961 in vitro und in vivo untersucht. Hierzu wurde an Ratten durch permanente Ligation der linken Koronararterie ein akuter Myokardinfarkt induziert. Ein, 3, 7 und 14 Tage nach Infarkt wurden Calpain I und II aus Gewebehomogenaten von interventrikulärem Septum (IS) und linker, freier Ventrikelwand (LVFW) mittels Chromatographie auf DEAE-Sepharose getrennt. Die Aktivität wurde in scheinoperierten und Infarkt-induzierten Tieren mit chronischer Placebo- oder CAL 9961-Therapie mithilfe eines Enzymassays mit synthetischem Substrat gemessen. Die Therapie wurde 3 Tage vor Infarktinduktion begonnen. Calpain I-Aktivität erreichte 14 Tage nach Infarkt höchste Werte im nicht-infarzierten Myokard (IS), während die maximale Calpain II-Aktivität 3 Tage nach Infarktereignis im infarzierten Herzgewebe (LVFW) gemessen wurde. In Experimenten in vitro hemmte CAL 9961 beide Calpainformen vollständig. In vivo verhinderte eine chronische Therapie mit CAL 9961 bei Tieren mit Myokardinfarkt teilweise den Anstieg der Calpain I-Aktivität im nicht-infarzierten Gewebe (IS) und reduzierte die Calpain II-Aktivität im infarzierten Myokard (LVFW) auf das Level scheinoperierter Tiere. Die in dieser Dissertation erbrachten Ergebnisse zeigen, dass die kardialen Calpaine I und II nach einem akuten Myokardinfarkt aktiviert werden, sich ihre Aktivierung jedoch innerhalb des Myokards zeitlich und regional unterscheidet. Die chronische Inhibition dieser Enzyme könnte die Calpain-vermittelten Gewebeschäden limitieren und zur Erhaltung der strukturellen Integrität des Myokards nach Infarkt beitragen.
Die unterschiedlichen gesetzlichen Bestimmungen hinsichtlich der Durchführung von Obduktionen in den beiden gewählten Untersuchungsabschnitten wirkten sich erheblich sowohl auf die Obduktionshäufigkeit als auch auf die Zusammensetzung des Obduktionsmaterials aus. Das Verhältnis von natürlichen zu nichtnatürlichen Todesfallen hatte sich im zweiten gegenüber dem ersten Untersuchungsabschnitt eindeutig zugunsten der natürlichen Todesfälle verschoben. Die gleichfalls festgestellte prozentuale Zunahme der Fälle mit alkoholinduzierten Organbefunden von 10,5% im ersten auf' 26,4% im zweiten Zeitraum dürfte auf den vorher genannten Umständen nur zum Teil zurück -zuführen sein. Ansonsten dokumentiert sich dadurch eine tatsächliche Zunahme alkoholbedingter Organschäden. Als Indiz für einen zunehmenden Alkoholmissbrauch ist nicht allein nur die Zunahme der alkoholbedingten Organveränderungen im zweiten Untersuchungsabschnitt anzusehen, sondern auch die im gleichen Zeitraum registrierte höhere Anteile der alkoholassoziierten Todesfälle, der Anstieg der durchschnittlichen Blutalkoholkonzentration bei Todeseintritt sowie auch das geringere Durchschnittsalter der Obduzierten mit alkoholbedingten Organveränderungen.