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Untersuchungen zum Aufbau eines Assays zur in vitro Selektion eines Cytidindesaminase-Ribozyms
(2009)
In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Funktionalisierung von RNAs im Hinblick auf die Selektion eines Ribozyms, das die Desaminierung von Cytidin zu Uridin katalysieren kann, durchgeführt. Die Desaminierung von Cytidin verläuft proteinkatalysiert. Cytidindesaminasen (CDAs) sind im Nukleotidmetabolismus aller Lebewesen zu finden. In höheren Eukaryoten spielen CDAs beim RNA editing eine Rolle. In Säugetieren sind sie bedeutsam für die Immunabwehr. Ein Cytidindesaminase-Ribozym wäre in der Lage die gezielte Veränderung einer RNA-Sequenz zu katalysieren. Diese Eigenschaft wäre ein weiteres Indiz für eine präbiotische RNA-Welt und könnte auch in der Gentherapie nützlich sein. Bei der in vitro Selektion ist die Funktionalisierung der RNA-Bibliothek ein zentraler Punkt. 5’-Transkriptionspriming ist dafür besonders gut geeignet, da es kotranskriptionell, während der Transkription der RNA, stattfindet. Während der Transkription kann die T7 RNA Polymerase ein 5’-modifiziertes Guanosinmonophosphat am 5’-Ende, also am Anfang einer RNA-Sequenz, einbauen. Cytidin, das zu prozessierende Substrat der Selektion, wurde mit einem Guanosinmonophosphat verbunden. Solche modifizierten Guanosinmonophosphat-Verbindungen werden Initiatormoleküle genannt, da sie nur zu Beginn einer RNA-Transkription am 5’-Ende einer RNA eingebaut werden können. Um eine Selektion zu ermöglichen, wurde das Cytidin mit einer Markierung versehen. Es wurden zwei verschiedene Initiatormoleküle synthetisiert. Der eine Initiator bestand aus einer Guanosinmonophosphateinheit und einer Cytidineinheit, die eine Biotinmarkierung trug. Die Biotinmarkierung ermöglicht eine Selektion an der festen Phase durch die starke Wechselwirkung von Biotin und Streptavidin. Bei erfolgreicher Reaktion der RNA wird diese von der Festphase getrennt und kann durch Waschen der Festphase isoliert werden. Der andere Initiator trug statt der Biotinmarkierung eine Fluoreszeinmarkierung. Die Selektion mit diesem Initiator würde in Lösung stattfinden. Fluoreszein-markierte RNAs besitzen eine andere gelektrophoretische Mobilität als unmarkierte RNAs. Bei der Selektion spalten aktive RNAs die Fluoreszeinmarkierung ab. Durch Gelaufreinigung der Selektionsansätze könnten sie so auf Grund ihrer veränderten gelelektrophoretischen Mobilität isoliert werden. Zur Synthese der Moleküle wurden zwei unterschiedliche Synthesestrategien entwickelt und angewandt. Die erste Synthesestrategie bediente sich der Phosphoramiditchemie an der festen Phase und lieferte den Biotin-markierten Initiator in nanomolaren Mengen. Die zweite Strategie führt zur Synthese des Fluoreszein-markierten Initiators und beinhaltete eine 18-stufige Synthese in Lösung, die eine Ausbeute des Initiators im µ-molaren Bereich ermöglichte. Die Funktionalisierung von RNA mit dem Biotin-markierten Initiator wurde qualitativ nachgewiesen mit Hilfe einer auf Northern Blotting und Chemilumineszenzdetektion aufbauenden Methode. Dabei wurden die Transkriptionsprodukte auf einer Nylonmembran immobilisiert und mit einem Fusionsprotein aus Alkalischer Phosphatase und Streptavidin zur spezifischen Bindungen an die Biotinmarkierung inkubiert. Durch Zugabe eines Substrats der Alkalischen Phosphatase wird ein Chemiluminszenzsignal induziert, welches mit einem empfindlichen Photosystem detektiert und dokumentiert werden kann. Der erfolgreiche Einbau der Fluoreszein-markierten Initiatormoleküle wurde qualitativ mit Hilfe denaturierender Gelelektrophorese und Fluoreszenzanregung bei einer Wellenlänge von 365 nm nachgewiesen. Zur quantitativen Bestimmung des Einbaus wurde eine auf fluoreszenzspektroskopischen Anwendungen basierende Methode etabliert und erfolgreich angewendet. Dazu wurde eine zu 100% 5’-Fluoreszein-markierte RNA mit Hilfe des Phosphoramiditverfahrens synthetisiert. Zur Erstellung einer Eichgerade mit dieser Referenz-RNA wurden Proben mit bekannten Konzentrationen mit Hilfe eines Fluoreszenzspektrophotometers vermessen. Die jeweiligen gemessenen Fluoreszenzintensitäten der Fluoreszenzemissionsmaxima der Proben wurden in einem Diagramm über der dazugehörigen Konzentration aufgetragen. Die so erstellte Eichgerade ermöglichte es anhand der gemessenen Fluoreszenzintensität einer Probe markierter RNAs die Konzentration der Probe zu ermitteln. Zur Bestimmung und Optimierung der Einbaueffizienz des Fluoreszein-markierten Initiators wurden Transkriptionspriming-reaktionen unter Variation der Transkriptionsbedingungen durchgeführt. Nach Optimierung der Reaktionsbedingungen wurde so eine Einbaurate von 18% erreicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit dokumentieren, dass grundsätzlich beide Inititatormoleküle zur Funktionalisierung einer RNA-Bibliothek und den damit verbundenen Selektionsstrategien, Festphase oder Selektion in Lösung, angewendet werden können. Die Fluoreszein-basierende Selektionsstrategie hätte den Vorteil einer direkteren Identifizierung und spezifischeren Quantifizierung der funktionalisierten RNA-Bibliothek.