Doctoral Thesis
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Nach Schlaganfall werden infolge einer einsetzenden Immunsuppression hĂ€ufig SekundĂ€rinfektionen beobachtet. Diese beeinflussen das Outcome und die MortalitĂ€t der Patienten bedeutend. In der vorliegenden Arbeit wurden als Mechanismen der angeborenen Immunantwort die Migration, Phagozytose und NETose neutrophiler Granulozyten und Monozyten untersucht, um mögliche EinschrĂ€nkungen infolge der Immunsuppression zu erkennen. DafĂŒr wurden Leukozyten von Schlaganfallpatienten mit denen gesunder Probanden verglichen. WĂ€hrend Migration und Phagozytose nach Schlaganfall unbeeintrĂ€chtigt waren, zeigten sich fĂŒr die mittlere NET-FlĂ€che am Tag 1 nach Schlaganfall deutlich reduzierte Werte nach Stimulation mit fMLP und PMA im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Dieser Effekt verlor sich in der ersten Woche nach Schlaganfall. In der reduzierten NET-FlĂ€che kann eine mögliche Ursache fĂŒr das Auftreten von SekundĂ€rinfektionen gesehen werden.
Im Rahmen vorliegender Dissertation wurde das intrazellulĂ€re Ăberleben von S. aureus in Makrophagen charakterisiert. Dabei lag ein Schwerpunkt auf der Verwendung von primĂ€ren murinen Knochenmarkmakrophagen, deren Interaktion mit S. aureus bisher wenig beschrieben ist. Die Internalisierung und Persistenz von S. aureus in primĂ€ren Makrophagen könnte dabei als PathogenitĂ€tsmechanismus fĂŒr die therapieresistenten und persistierenden, sowie rekurrenten Infektionen relevant sein, die der Erreger neben den klassischen Manifestationen einer S. aureus-Infektion hervorruft. In diesem Zusammenhang sollte auch diskutiert werden, ob es sich bei S. aureus um ein typisches fakultativ intrazellulĂ€res Bakterium handelt. ZunĂ€chst wurde anhand eines in-vitro-Infektionsmodells gezeigt, dass verschiedene S. aureusâStĂ€mme in einer murinen Makrophagen-Zelllinie, sowie in primĂ€ren murinen Knochenmark-Makrophagen mindestens 5 Tage unter langsamer Reduktion der anfĂ€nglichen Keimzahl ĂŒberleben können. Der als Kontrollstamm eingesetzte KNS-Vertreter S. epidermidis ATCC 12228 konnte etwa 3 Tage intrazellulĂ€r nachgewiesen werden. Die gleichen S. aureus-StĂ€mme wurden bezĂŒglich ihrer Internalisierungsrate untersucht. Dabei zeigte sich, dass die S. aureus-StĂ€mme Newman und RN 6390 im Vergleich zu den S. aureus ATCC-StĂ€mmen 25923, 12600 und 29213 deutlich geringer internalisiert wurden. Sogar S. epidermidis ATCC 12228 wies ihnen gegenĂŒber eine höhere Phagozytoserate auf. Dies verdeutlicht die Begrenzbarkeit von Studien, in denen unterschiedliche S. aureus-StĂ€mme untersucht werden. Die geringen Internalisierungsraten von Newman und RN 6390 lassen sich dabei aus ihren bekannten regulatorischen bzw. funktionellen Gendefekten erklĂ€ren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde darĂŒber hinaus ein Infektionsmodell entwickelt, in dem Makrophagen von BALB/c- und C57BL/6-MĂ€usen vergleichend bezĂŒglich Phagozytose und intrazellulĂ€rem Ăberleben von S. aureus untersucht wurden. Anders als uns von in-vivo-Infektionsmodellen mit S. aureus bekannt ist, zeigten sich in-vitro keine Unterschiede in der EliminationsfĂ€higkeit von primĂ€ren Knochenmarkmakrophagen von C57BL/6- und BALB/c-MĂ€usen gegenĂŒber intrazellulĂ€rem S. aureus. Die genetisch bedingte unterschiedliche EmpfĂ€nglichkeit der verschiedenen MausstĂ€mme gegenĂŒber einer S. aureus-Infektion beruht wahrscheinlich nicht auf den unterschiedlichen bakteriziden Mechanismen der Makrophagen. Es erfolgten weiterhin Experimente mit primĂ€ren Knochenmarkmakrophagen von MĂ€usen mit Defekten im iNOS Gen bzw. der gp91 Untereinheit der NADPH-Oxidase, um die Makrophagen-spezifischen Abwehrmechanismen gegenĂŒber einer S. aureus-Infektion genauer zu charakterisieren. Dabei konnte kein Effekt von bakteriziden oxidativen, oder nitrosativen Effektormechanismen des Makrophagen auf die Phagozytose, oder das intrazellulĂ€re Ăberleben von S. aureus festgestellt werden, obwohl S. aureus die NO-Produktion in Makrophagen induzierte. Zur Untersuchung der bakteriellen Regulation in der Interaktion mit Makrophagen wurden schlieĂlich S. aureus-StĂ€mme mit Mutationen in den globalen regulatorischen Systemen agr bzw. sae eingesetzt. Agr und sae sind essentielle Regulatoren der S. aureus-PathogenitĂ€tsfaktoren. In vorliegenden Ergebnissen zeigte sich deren Einfluss vor allem bezĂŒglich der Phagozytoserate. Das intrazellulĂ€re Ăberleben hingegen wurde nur unwesentlich beeinflusst. WĂ€hrend sae sich als entscheidend fĂŒr die Internalisierung erwies, zeigte agr einen gegensĂ€tzlichen Effekt. Agr zeigte sich hingegen verantwortlich fĂŒr die initiale, kurzzeitige Proliferation von S. aureus in Makrophagen. Weiterhin stellten sich das S. aureus-OberflĂ€chenprotein FnBPA, als auch das extrazellulĂ€re Matrixprotein Fibronektin fĂŒr die Internalisierung in primĂ€re Makrophagen als essentiell heraus. Diese Ergebnisse zeigten, dass die intrazellulĂ€re Aufnahme von S. aureus in Makrophagen durch verschiedene bakterielle Komponenten stark beein flusst wird.
Aus pharmakologischer Sicht sind unter den Aufnahmetransportern Vertreter der organic anion transporting polypeptide-Familie (OATPs) von besonderem Interesse. Transporter dieser Familie besitzen nicht nur ein breites Substratspektrum endogener und exogener Substanzen, sondern sind auch in zahlreichen Geweben exprimiert. Gut untersucht ist dabei vor allem die Leber mit den vorwiegend hepatisch exprimierten Vertretern OATP1B1 und OATP1B3, wĂ€hrend zur Expression und Funktion der OATPs in weiteren pharmakologischen Zielstrukturen, wie beispielsweise den Blutzellen oder auch der Blut-Hirn-Schranke, weit weniger bekannt ist. Ziel dieser Arbeit war es daher, ausgewĂ€hlte OATP-Transporter hinsichtlich ihrer Expression, ihrem Interaktionspotential und der Funktion in der Blut-Hirn-Schranke und zwei Blutzellpopulationen zu charakterisieren. Dabei konnte zunĂ€chst die Expression des OATP2B1 und OATP1A2 in der Blut-Hirn-Schranke bestĂ€tigt und deren funktionelle Interaktion mit ausgewĂ€hlten Dopaminrezeptor-Agonisten aufgezeigt werden. Insbesondere das Ergolin-Derivat Bromocriptin wurde als potenter Inhibitor beider Transporter identifiziert, wĂ€hrend Nicht-Ergoline wie Pramipexol hier keinen Effekt hatten. FĂŒr Bromocriptin konnte zudem ein direkter OATP1A2-abhĂ€ngiger Transport nachgewiesen werden, womit dieser Transporter als zentraler Aufnahmetransporter des ZNS-aktiven Bromocriptin infrage kommt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde zunĂ€chst die Expression des OATP1A2 und OATP2B1 in Erythrozyten nachgewiesen und charakterisiert und in der Folge deren Bedeutung fĂŒr die erythrozytĂ€re Aufnahme der Antimalaria-Substanzen Chinin, Chloroquin, Mefloquin, Primaquin, Pyrimethamin, Artemisinin und Artesunat untersucht. Dabei wurden Chinin und Chloroquin als hoch potente OATP1A2-Inhibitoren identifiziert, wobei fĂŒr ersteres auch ein OATP1A2-abhĂ€ngiger Transport gezeigt werden konnte. Wie fĂŒr einige andere OATP1A2-Substrate ist dieser Transport pH-abhĂ€ngig und Naringin-sensitiv. FĂŒr eine pharmakologische Bedeutung dieser Interaktion spricht der Befund, dass eine NaringinabhĂ€ngigkeit der Chinin-Aufnahme auch in primĂ€ren Erythrozyten nachgewiesen werden konnte. Der letzte Abschnitt der Arbeit befasst sich mit der Bedeutung des OATP2B1 fĂŒr die Makrophagenfunktion. Hier konnte zunĂ€chst eine deutliche Aufregulation der OATP2B1-Expression bei der Makrophagen-Differenzierung aus primĂ€ren Monozyten und im THP-1 Zellmodell gezeigt werden. Weiterhin wurde fĂŒr den Transporter die Interaktion mit dem antiphagozytĂ€r wirksamen Polyphenol Resveratrol bestĂ€tigt und es konnte gezeigt werden, dass eine Herabregulation des OATP2B1 mittels siRNA den antiphagozytĂ€ren Effekt des Resveratrol negativ beeinflusst. Zusammengefasst konnten in dieser Arbeit mit Bromocriptin und Chinin zwei neue OATP1A2-Substrate identifiziert werden. Eine Expression des Transporters in Zielstrukturen wie der BHS oder, wie hier gezeigt, der Erythrozytenmembran, legt damit eine besondere Bedeutung des OATP1A2 bei der Verteilung dieser und anderer Wirkstoffe nahe. DemgegenĂŒber konnte mit OATP2B1 in Makrophagen aufgezeigt werden, dass zellulĂ€re Verteilungsprozesse exogener Substanzen auch in einer Modulation der Zellfunktion resultieren können.