Doctoral Thesis
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Nach Schlaganfall werden infolge einer einsetzenden Immunsuppression häufig Sekundärinfektionen beobachtet. Diese beeinflussen das Outcome und die Mortalität der Patienten bedeutend. In der vorliegenden Arbeit wurden als Mechanismen der angeborenen Immunantwort die Migration, Phagozytose und NETose neutrophiler Granulozyten und Monozyten untersucht, um mögliche Einschränkungen infolge der Immunsuppression zu erkennen. Dafür wurden Leukozyten von Schlaganfallpatienten mit denen gesunder Probanden verglichen. Während Migration und Phagozytose nach Schlaganfall unbeeinträchtigt waren, zeigten sich für die mittlere NET-Fläche am Tag 1 nach Schlaganfall deutlich reduzierte Werte nach Stimulation mit fMLP und PMA im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Dieser Effekt verlor sich in der ersten Woche nach Schlaganfall. In der reduzierten NET-Fläche kann eine mögliche Ursache für das Auftreten von Sekundärinfektionen gesehen werden.
Im Rahmen vorliegender Dissertation wurde das intrazelluläre Überleben von S. aureus in Makrophagen charakterisiert. Dabei lag ein Schwerpunkt auf der Verwendung von primären murinen Knochenmarkmakrophagen, deren Interaktion mit S. aureus bisher wenig beschrieben ist. Die Internalisierung und Persistenz von S. aureus in primären Makrophagen könnte dabei als Pathogenitätsmechanismus für die therapieresistenten und persistierenden, sowie rekurrenten Infektionen relevant sein, die der Erreger neben den klassischen Manifestationen einer S. aureus-Infektion hervorruft. In diesem Zusammenhang sollte auch diskutiert werden, ob es sich bei S. aureus um ein typisches fakultativ intrazelluläres Bakterium handelt. Zunächst wurde anhand eines in-vitro-Infektionsmodells gezeigt, dass verschiedene S. aureus–Stämme in einer murinen Makrophagen-Zelllinie, sowie in primären murinen Knochenmark-Makrophagen mindestens 5 Tage unter langsamer Reduktion der anfänglichen Keimzahl überleben können. Der als Kontrollstamm eingesetzte KNS-Vertreter S. epidermidis ATCC 12228 konnte etwa 3 Tage intrazellulär nachgewiesen werden. Die gleichen S. aureus-Stämme wurden bezüglich ihrer Internalisierungsrate untersucht. Dabei zeigte sich, dass die S. aureus-Stämme Newman und RN 6390 im Vergleich zu den S. aureus ATCC-Stämmen 25923, 12600 und 29213 deutlich geringer internalisiert wurden. Sogar S. epidermidis ATCC 12228 wies ihnen gegenüber eine höhere Phagozytoserate auf. Dies verdeutlicht die Begrenzbarkeit von Studien, in denen unterschiedliche S. aureus-Stämme untersucht werden. Die geringen Internalisierungsraten von Newman und RN 6390 lassen sich dabei aus ihren bekannten regulatorischen bzw. funktionellen Gendefekten erklären. Im Rahmen dieser Arbeit wurde darüber hinaus ein Infektionsmodell entwickelt, in dem Makrophagen von BALB/c- und C57BL/6-Mäusen vergleichend bezüglich Phagozytose und intrazellulärem Überleben von S. aureus untersucht wurden. Anders als uns von in-vivo-Infektionsmodellen mit S. aureus bekannt ist, zeigten sich in-vitro keine Unterschiede in der Eliminationsfähigkeit von primären Knochenmarkmakrophagen von C57BL/6- und BALB/c-Mäusen gegenüber intrazellulärem S. aureus. Die genetisch bedingte unterschiedliche Empfänglichkeit der verschiedenen Mausstämme gegenüber einer S. aureus-Infektion beruht wahrscheinlich nicht auf den unterschiedlichen bakteriziden Mechanismen der Makrophagen. Es erfolgten weiterhin Experimente mit primären Knochenmarkmakrophagen von Mäusen mit Defekten im iNOS Gen bzw. der gp91 Untereinheit der NADPH-Oxidase, um die Makrophagen-spezifischen Abwehrmechanismen gegenüber einer S. aureus-Infektion genauer zu charakterisieren. Dabei konnte kein Effekt von bakteriziden oxidativen, oder nitrosativen Effektormechanismen des Makrophagen auf die Phagozytose, oder das intrazelluläre Überleben von S. aureus festgestellt werden, obwohl S. aureus die NO-Produktion in Makrophagen induzierte. Zur Untersuchung der bakteriellen Regulation in der Interaktion mit Makrophagen wurden schließlich S. aureus-Stämme mit Mutationen in den globalen regulatorischen Systemen agr bzw. sae eingesetzt. Agr und sae sind essentielle Regulatoren der S. aureus-Pathogenitätsfaktoren. In vorliegenden Ergebnissen zeigte sich deren Einfluss vor allem bezüglich der Phagozytoserate. Das intrazelluläre Überleben hingegen wurde nur unwesentlich beeinflusst. Während sae sich als entscheidend für die Internalisierung erwies, zeigte agr einen gegensätzlichen Effekt. Agr zeigte sich hingegen verantwortlich für die initiale, kurzzeitige Proliferation von S. aureus in Makrophagen. Weiterhin stellten sich das S. aureus-Oberflächenprotein FnBPA, als auch das extrazelluläre Matrixprotein Fibronektin für die Internalisierung in primäre Makrophagen als essentiell heraus. Diese Ergebnisse zeigten, dass die intrazelluläre Aufnahme von S. aureus in Makrophagen durch verschiedene bakterielle Komponenten stark beein flusst wird.
Aus pharmakologischer Sicht sind unter den Aufnahmetransportern Vertreter der organic anion transporting polypeptide-Familie (OATPs) von besonderem Interesse. Transporter dieser Familie besitzen nicht nur ein breites Substratspektrum endogener und exogener Substanzen, sondern sind auch in zahlreichen Geweben exprimiert. Gut untersucht ist dabei vor allem die Leber mit den vorwiegend hepatisch exprimierten Vertretern OATP1B1 und OATP1B3, während zur Expression und Funktion der OATPs in weiteren pharmakologischen Zielstrukturen, wie beispielsweise den Blutzellen oder auch der Blut-Hirn-Schranke, weit weniger bekannt ist. Ziel dieser Arbeit war es daher, ausgewählte OATP-Transporter hinsichtlich ihrer Expression, ihrem Interaktionspotential und der Funktion in der Blut-Hirn-Schranke und zwei Blutzellpopulationen zu charakterisieren. Dabei konnte zunächst die Expression des OATP2B1 und OATP1A2 in der Blut-Hirn-Schranke bestätigt und deren funktionelle Interaktion mit ausgewählten Dopaminrezeptor-Agonisten aufgezeigt werden. Insbesondere das Ergolin-Derivat Bromocriptin wurde als potenter Inhibitor beider Transporter identifiziert, während Nicht-Ergoline wie Pramipexol hier keinen Effekt hatten. Für Bromocriptin konnte zudem ein direkter OATP1A2-abhängiger Transport nachgewiesen werden, womit dieser Transporter als zentraler Aufnahmetransporter des ZNS-aktiven Bromocriptin infrage kommt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde zunächst die Expression des OATP1A2 und OATP2B1 in Erythrozyten nachgewiesen und charakterisiert und in der Folge deren Bedeutung für die erythrozytäre Aufnahme der Antimalaria-Substanzen Chinin, Chloroquin, Mefloquin, Primaquin, Pyrimethamin, Artemisinin und Artesunat untersucht. Dabei wurden Chinin und Chloroquin als hoch potente OATP1A2-Inhibitoren identifiziert, wobei für ersteres auch ein OATP1A2-abhängiger Transport gezeigt werden konnte. Wie für einige andere OATP1A2-Substrate ist dieser Transport pH-abhängig und Naringin-sensitiv. Für eine pharmakologische Bedeutung dieser Interaktion spricht der Befund, dass eine Naringinabhängigkeit der Chinin-Aufnahme auch in primären Erythrozyten nachgewiesen werden konnte. Der letzte Abschnitt der Arbeit befasst sich mit der Bedeutung des OATP2B1 für die Makrophagenfunktion. Hier konnte zunächst eine deutliche Aufregulation der OATP2B1-Expression bei der Makrophagen-Differenzierung aus primären Monozyten und im THP-1 Zellmodell gezeigt werden. Weiterhin wurde für den Transporter die Interaktion mit dem antiphagozytär wirksamen Polyphenol Resveratrol bestätigt und es konnte gezeigt werden, dass eine Herabregulation des OATP2B1 mittels siRNA den antiphagozytären Effekt des Resveratrol negativ beeinflusst. Zusammengefasst konnten in dieser Arbeit mit Bromocriptin und Chinin zwei neue OATP1A2-Substrate identifiziert werden. Eine Expression des Transporters in Zielstrukturen wie der BHS oder, wie hier gezeigt, der Erythrozytenmembran, legt damit eine besondere Bedeutung des OATP1A2 bei der Verteilung dieser und anderer Wirkstoffe nahe. Demgegenüber konnte mit OATP2B1 in Makrophagen aufgezeigt werden, dass zelluläre Verteilungsprozesse exogener Substanzen auch in einer Modulation der Zellfunktion resultieren können.
