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The present work consists of four parts, containing experimental data obtained from analysis of 'Bacillus subtilis' specific and general defense strategies against reactive oxygen species. In the first part, the peroxide and superoxide stress stimulons ob 'B. subtilis' were analyzed by means of transcriptomics and proteomics. Oxidative stress responsive genes were classified into two groups: the gene expression pattern was either similar after both stresses or the genes primarily responded to one stimulus. The high induction observed for members of the PerR-regulon after both stimuli supported the assumption that activation of the peroxide specific PerR-regulon represented the primary stress response after superoxide and peroxide stress. The second part focuses on protein carbonylation in 'B. subtilis' wild-type and 'sigB' mutant cells. The introduction of carbonyl groups into amino acid side chains of proteins represents one possible form of protein modification after attack by reactive oxygen species. Carbonyl groups are readily detectable and the observed amounts can thus serve as an indicator for the severity of protein damage. The resultsdemonstrate clearly that 'B. subtilis' proteins are susceptible to hydrogen peroxide (H2O2) mediated carbonylation damage. The application of low concentrations of H2O2 prior to the exposure to otherwise lethal levels of peroxide reduced markedly the degree of protein carbonylation, which also held true for glucose starved cells. Artificial preloading with general stress proteins resulted in a lower level of protein carbonylation when cells were subjected to oxidative stress, but no differences were detected between wild-type and 'sigB' mutant cells. In the third part, strains with mutations in genes encoding general stress proteins were screenedfor decreased resistance after H2O2 challenge. It was demonstrated that resistance to H2O2 challenge. It was demonstrated that resistance to H2O2 after transient heat treatment, likewise to conditions of glucose starvation, was at least partly mediated by the sB-dependent general stress response. The screening of mutants in sB-controlled genes revealed an important role for the deoxyribonucleic acid (DNA)-binding protein Dps in the context of sB-mediated resistance to oxidative stress underlining previous reports. Therefore, the experimental strategy opens a global view on the importance of DNA integrity in 'B. subtilis' under conditions of oxidative stress. The fourth part includes analysis of a 'B. subtilis' thioredoxin conditional mutant. The thiol-disulfide oxidoreductase TrxA is an essential protein in 'B. subtilis' that is suggested to be involved in maintaining the cytoplasmic thiol-disulfide state even under conditions of oxidative stress. To investigate the physiological role of TrxA, growth experiments and two-dimensional gel electrophoresis were carried out with exponentially growing cells that were depleted of TrxA. The observations indicate that TrxA essentially involved in the re-reduction of phosphoadenosyl phosphosulfate reductase CysH within the sulfate assimilation pathway of 'B. subtilis'.
Teil 1: Pathogeninaktivierung: Es wurde ein neues Verfahren zur Pathogeninaktivierung mittels Proteomanalysen untersucht. Bei diesem wurden Proben von Kaninchenthrombozyten mit Riboflavin bzw. Psoralen inkubiert und mit UV-A Licht bestrahlt. Dadurch werden die in Pathogenen enthaltenen Nukleinsäuren unbrauchbar gemacht, wohingegen gezeigt werden konnte, dass die Plättchen kaum in ihrem Proteom und damit vermutlich in ihrer Funktionalität beeinflusst wurden. Teil 2: Thrombozytenalterung: Durch Apherese wurde an drei auf einander folgenden Tagen die in einem humanen Spender zirkulierenden Plättchen auf 80000/µl depletiert und anschließend Plättchen aus dem Vollblut mittels differentieller Zentrifugation gewonnen. Während der einsetzenden Nachbildung von Thrombozyten wurde das Proteom der Zellen mit den Ausgangswerten verglichen und so versucht, Alterungsmarker im Thrombozytenproteom zu finden.
Staphylococcus aureus is a commensal colonizing 20-30% of the population as well as a pathogen causing diverse diseases ranging from skin infections via toxin mediated diseases to life threatening conditions. In its interplay with the human host, this microorganism resorts to an extensive repertoire of both membrane-bound and secreted virulence factors facilitating adhesion to, invasion of, and spreading into various host tissues. Among the numerous virulence factors produced by S. aureus are the staphylococcal superantigens (SAgs). They directly cross-link conserved regions of the T cell-receptor with MHC class II molecules (outside the peptide-binding cleft) on antigen presenting cells. This results in a strong stimulation of up to 20% of all T cells which respond with proliferation and massive cytokine release. Recently, the enterotoxin gene cluster (egc) located on a pathogenicity island was described. The egc-genes are the most prevalent SAg genes in commensal and invasive S. aureus isolates. However, they appear to cause toxic shock only very rarely and their presence is negatively correlated with severity of S. aureus sepsis. Therefore it was suggested that SAgs might differ in their pro-inflammatory potential. In addition to their superantigenicity, SAgs also act as conventional antigens and induce a specific antibody response. In contrast to non-egc SAgs, despite the high prevalence of egc SAgs, neutralizing antibodies against egc SAgs are very rare, even among carriers of egc-positive S. aureus strains. In order to find an explanation for this “egc-gap”, we have tested two non-exclusive hypotheses: (i) egc and non-egc SAgs have unique intrinsic properties and drive the immune response into different directions and (ii) egc and non-egc SAgs are released by S. aureus under different conditions, which shape the immune response to them. To test these hypotheses, we compared the effects of egc and non-egc SAgs on human blood cells. Their T cell-mitogenic potencies, the elicited cytokine profiles as well as their impact on gene expression were highly similar. Both egc and non-egc SAgs induced a very strong pro-inflammatory response. In contrast, the regulation of SAg release by S. aureus differed markedly between egc and non-egc SAgs. Egc-encoded proteins were secreted by S. aureus during exponential growth, while non-egc SAgs were released in the stationary phase. We conclude that the distinct biological behavior of egc and non-egc SAgs is not due to their intrinsic properties, which are very similar, but is caused by their differential release by S. aureus. Traditionally, S. aureus has not been considered as an intracellular pathogen but strong evidence emerged indicating that staphylococci can invade and persist in various cell types. Internalization might constitute a bacterial strategy to evade the host’s defense reactions and the action of antibiotics. The intracellular niche might thus constitute a reservoir for chronic or relapsing infections. Contrary to their potential importance, genome-wide functional genomics analyses of the adaptation reactions of S. aureus to the host cell environment are rare and so far confined to gene expression profiling. Investigations addressing the proteome of internalized S. aureus are still lacking due to the challenge of obtaining a sufficient number of infecting bacteria. The proteome of other pathogens such as Francisella tularensis has been characterized by classical 2-DE approaches. However, the number of bacteria required for such a 2-DE based approach is often exceeding the numbers available from in vivo infection models. Furthermore, this approach does not allow monitoring of time-dependent quantitative changes in protein levels. Here, a workflow allowing time-resolved analysis of internalized S. aureus by combining pulse-chase stable isotope labeling by amino acids in cell culture with high capacity cell sorting, on-membrane digestion, and high-sensitivity mass spectrometry is presented. This workflow permits detection and quantitative monitoring of several hundred staphylococcal proteins from as little as a few million internalized S. aureus cells. This approach has been used to reveal time-resolved changes in levels of proteins in S. aureus RN1HG upon internalization by human bronchial epithelial cells. Proteins involved in stress adaptation as well as protein folding and some components of the phosphotransferase system were upregulated in internalized staphylococci, whereas proteins of the purine biosynthesis pathway and tRNA aminoacylation were downregulated. Furthermore, regulatory adaptive responses of internalized S. aureus to the intracellular milieu were shown as global regulators displayed increased protein abundance levels compared to non-internalized bacteria. Taken together, we observed changes in levels of proteins with functions in protection against oxidative damage and adaptation of cell wall synthesis in internalized S. aureus.
Thiol or sulfhydryl groups are highly reactive functional groups in cellular systems. Molecules carrying thiol groups are mostly derivatives of the amino acid cysteine and are grouped as low molecular weight (LMW)-thiols: coenzyme A (CoA), glutathione (GSH) or bacillithiol (BSH). LMW-thiols can help in the maintenance of the reduced cellular environment as so called redox-buffers. Additionally, they act as co-factors in enzyme reactions or help in the detoxification of reactive oxygen or nitrogen species, electrophilic compounds or thiophilic metalloids (arsenite, tellurite). In proteins from different organisms cysteine is underrepresented compared to other amino acids, but still overtakes diverse roles. It is an important determinant in the tertiary and quaternary structure of proteins. The nucleophilic character of the thiol or thiolate group, respectively, makes cysteine the catalytically active amino acids of different enzymes. As a precursor cysteine participates in the formation of Fe-S clusters and coordinates different co-factors like heme, iron or zinc. The main goal of this study was the investigation of the different cellular thiol pools, now defined as the thiolome. The thiolome is the entity of the cellular thiol pools, i.e. LMW-thiols and protein thiols, and the dynamics between these pools. In Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus mixed disulfides between protein thiols and free LMW-thiols, so called S-thiolations, were identified in different proteins in response to the thiol specific reagent diamide. Some of these S-thiolations were located at catalytically active cysteine residues. Subsequent analysis of metabolites supports this: the S-thiolation of the cobalamine-independent methionine-synthase MetE led to a decrease of the cellular methionine content. Additionally, the conversion of threonine to different branched-chain amino acids (BCAAs) was disrupted by the S-thiolation of the branched-chain amino acid aminotransferase YwaA, thereby probably inducing the synthesis of ppGpp, the alarmon of the stringent response. In addition to the identification of S-thiolations a technique was established which allowed the discrimination between intra- and intermolecular disulfides. The non-reducing/ reducing diagonal gel electrophoresis was applied to B. subtilis and S. aureus and confirmed known existing disulfide bonds, e.g. in alkyl hydroperoxide reductase AhpC or the thiol peroxidase Tpx. In response to diamide an increase of specific disulfide bonds in different proteins was observed. The analysis of the LMW-thiol content by an HPLC-approach allowed the observation of the dynamics of the thiolome. In response to diamide the reduced LMW-thiol content decreased by 75%, reduced protein thiols by 60%. Collaborations with other working groups allowed the identification of BSH in this approach. Additionally, an unknown thiol was found that is likely a derivative of BSH. Screening of the LMW-thiol content of different S. aureus-strains under various growth conditions revealed that strains 8325-4 and SH1000 lack BSH. The lack of BSH was attributed to an 8 bp-duplication in the bshC-gene that encodes the last enzyme of the BSH-synthesis. BSH-production was restored by transducing plasmid-borne functional BshC from strain Newman into strains 8325-4 and SH1000. The reconstitution of the BSH-synthesis aided in the resistance to the antibiotic fosfomycin but did not increase the resistance to different oxidants (diamide, sodium hypochlorite, hydrogen peroxide). The production of BSH had also positive effects on the survival of S. aureus inside human bronchial epithelial cells and murine macrophages in phagocytosis assays. Additionally, a GSH-uptake was observed into S. aureus which has before been known as a GSH-free bacterium. Taken together, this thesis provides the first insights into both, the LMW-thiol- and protein thiol pool of low GC, Gram-positive bacteria under different conditions. A plethora of different methodologies was used to describe the thiolome. The bacterial thiolome is a sophisticated system which is tightly regulated, but also flexible enough to not rely on determined molecules like BSH. The influences of the thiolome are not restricted to its own system and regulation, but also affect different branches of cellular physiology like the metabolism of BCAAs.
Die chronische arterielle Hypertonie erhöht das Risiko für kardiovaskuläre Komplikationen wie Schlaganfall und Myokardinfarkt. In der Pathophysiologie dieser Komplikationen spielen Thrombozyten eine wesentliche Rolle. Hierbei gehen die meisten Experten derzeit davon aus, dass Thrombozyten mit den durch die Hypertonie geschädigten Gefäßwänden reagieren. Ziel unserer Untersuchungen war es, zu untersuchen, ob durch die Hypertonie auch Veränderungen in Thrombozyten entstehen. Thrombozyten zirkulieren im Kreislauf in engem Kontakt mit der Gefäßwand und reagieren sensibel auf hohe Scherkräfte und aktivierte Endothelzellen. Jede Aktivierung, auch in reversiblen Frühstadien führt dabei zu Veränderungen in der Proteinzusammensetzung der Thrombozyten, dem Proteom. Da sie keinen Kern haben, ist die Proteinneosynthese in Thrombozyten stark limitiert. So „speichern“ Thrombozyten Informationen über ihre Aktivierungshistorie während ihrer zehntägigen Überlebenszeit, da die veränderten Proteine nicht, oder nur sehr eingeschränkt durch neu synthetisierte Proteine ersetzt werden. Proteomics bietet einen Ansatz, über tausend Proteine gleichzeitig zu untersuchen. Mittels zweidimensionaler, differentieller in Gel Elektrophorese (2D-DIGE) kann dabei ein sensibler quantitativer Vergleich zweier Proben erfolgen. Die komplexe Methodik erfordert jedoch eine hochgradige Standardisierung der Versuchsgruppen. In diesem Projekt wurde daher ein Tiermodell verwendet, um die ca. 1000, mittels 2D-PAGE dargestellten Proteinspots des Thrombozytenzytosols auf hypertoniebedingte Veränderungen zu untersuchen. Dabei wurden zwei unterschiedliche Rattenmodelle der Hypertonie eingesetzt um die Aussagekraft zu erhöhen. Nach 14tägiger Hypertoniephase wurden 45 Proteinspots detektiert, deren Intensität in beiden Rattenmodellen signifikant verändert war. Die Identifikation dieser Spots mittels Massenspektrometrie zeigte neben spezifischen Thrombozytenproteinen v.a. Zytoskelett- und Zytoskelett -assoziierte Proteine. Wurde an die 14tägige Hypertoniephase eine 10tägige Erholungsphase angeschlossen, waren diese Veränderungen nicht mehr nachweisbar. Überraschenderweise waren die beobachteten Veränderungen unterdrückbar durch mehrmalige Blutentnahme vor- und während der Hypertoniephase. Dabei wurden 8 Tage vor-, sowie zweimal während der Hypertoniephase (Tage 3 und 10) 3 ml Blut entnommen. Die daraufhin durchgeführte Untersuchung auf Veränderungen des Thrombozytenproteoms durch Blutentnahmen an normotensiven Tieren zeigte ein Muster an Veränderungen, dass dem unter Hypertonie beobachteten entgegengesetzt war. Eine denkbare Ursache für diese Beobachtung ist, dass die Thrombozytopoese durch die mehrmaligen Blutverluste gesteigert wurde. Die so vermehrt ausgeschütteten „jungen“ Thrombozyten zeigen ein inverses Proteommuster, gegenüber den durch Hypertonie gestressten Thrombozyten. Um dieser Hypothese nachzugehen wurden Ratten mit dem Thrombopoetinrezeptoragonisten Romiplostim behandelt. Das Thrombozytenproteom von Ratten nach Stimulation der Thrombozytopoese ähnelt dem von Ratten nach mehrmaligen Blutentnahmen. Dies unterstützt unsere Hypothese, dass die durch Blutentnahmen bedingten Proteomveränderungen auf eine gesteigerte Thormobzytopoese zurückzuführen sind und damit auf das gesteigerte Vorkommen junger Thrombozyten im Blutkreislauf. Veränderungen des Thrombozytenproteoms, die in beiden Tiermodellen unter Hypertonie auftraten, können mit großer Sicherheit auf die Hypertonie zurückgeführt werden. Zu beachten ist allerdings, dass beide Modelle auf einer Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron Systems (RAAS) basieren. Es kann also nicht differenziert werden, ob die Veränderungen durch die Hypertonie selbst oder durch das aktivierte RAAS verursacht wurden. Die Tiermodelle spiegeln somit nur eine Subgruppe der Hypertoniepatienten wider. Wir haben mit diesen Experimenten Thrombozyten-Proteine identifiziert, die sich durch einen erhöhten Blutdruck verändern. Diese Proteine sind daher potentielle Kandidaten für Biomarker, die eine Aussage über den Blutdruckverlauf der zurückliegenden Tage ermöglichen. Solch ein Marker, ähnlich dem HbA1c beim Diabetes mellitus, könnte die Hypertoniediagnostik erheblich erleichtern. Für die in dieser tierexperimentellen Studie identifizierten Proteine finden sich analoge Proteine in menschlichen Thrombozyten. Deren Veränderung durch Bluthochdruck sollte in Fall/Kontroll-Studien am Menschen untersucht werden. In Ergänzung zum im Journal of Hypertension veröffentlichten Artikel wird in der vorliegenden deutschen Zusammenfassung detaillierter auf die Methoden eingegangen. Darüber hinaus werden zusätzliche Aspekte in der Diskussion angesprochen.
Rich knowledge about global nutrient cycles and functional interactions can be gained from the perspective of complex microbial proteomes. In this thesis, the application of environmental proteomics allowed for a direct in situ analysis of habitat-specific proteomes expressed by respective microbial communities from two different marine ecosystems. In the first part of this thesis, unculturable symbiont populations from tubeworms that colonize hydrothermal vents of the Pacific deep sea became accessible by use of community proteomics. This branch of environmental proteomics is generally employed to ascertain simple microbial assemblages derived from in situ samples. The proteome study was aimed at analyzing adaptations of seemingly monospecific symbionts to different hosts, the tubeworms Tevnia jerichonana und Riftia pachyptila. A comparison of the newly sequenced genomes of symbiont populations from both hosts confirmed that both symbioses involve the same bacterial species. Also the proteome analysis by 2D-PAGE showed a high physiological homogeneity for symbionts from both worm species, although the hosts are exposed to different geochemical conditions. Thus, the hosts provide their symbionts with a relatively stable internal environment by attenuation of external influences. Only minor variations in the symbionts proteomes reflected the differential environmental conditions outside the worms. Hence, the symbionts were able to fine-tune major metabolic pathways and oxidative stress in response to only minor chemical changes within their hosts. Moreover, new components of important physiological processes of the bacterial symbionts, like the sulfide oxidation and carbon fixation, were identified by in-depth proteomics of the Riftia symbiosis model system. The in situ protein samples showed as well that, in contrast to an earlier hypothesis, nitrate is used as an alternative electron acceptor. In the second part of this thesis, another branch of environmental proteomics called metaproteomics was applied to investigate the response of a bacterioplankton community to a spring phytoplankton bloom in the North Sea. Recurrent plankton blooms are a common phenomen of coastal areas, which however has only been investigated with limited resolution in biodiversity. Based on large-scale proteomic data sets it was found that specialized populations of Bacteroidetes, Gammaproteobacteria and Alphaproteobacteria exhibited differential protein expression patterns. These involved oligomer transporters, glycoside hydrolases and phosphate acquisition proteins. A successive utilization of algal organic matter by microbes indicated a series of ecological niches occupied by the heterotrophic picoplankton. Key proteins, identified by metaproteomics, were further investigated by studying a model bacterium to define their specificities regarding the utilization of algal glycans. By isotope labeling of proteins, quantitative proteomics of the North Sea isolate Gramella forsetii KT0803, a Bacteroidetes representative could be conducted. The adaptation to the algal polysaccharides alginate and laminarin in comparison with glucose was analyzed. G. forsetii proved to be a specialist for the chosen algal polymers, in particular for glucans like laminarin. Primarily comprehensive clusters, the so-called polysaccharide utilization loci (PULs) were activated. The results of this model study complemented the basic concepts obtained by the metaproteomic approach about carbon cycling in coastal systems. The accessibility of numerous unculturable marine microbes by environmental proteomics allows to improve our understanding of interactions that drive symbioses or complex communities. Adaptations to environmental parameters, such as the abundance of substrates, can be analyzed and associated with respective populations. Thus statements can be made for functional groups of microorganisms, their ability for the creation of niches and their flexibility to respond to varying environmental impacts. The increasing number of marine model bacteria enables targeted analysis of specificities and adaptations and hence to support the environmental proteomics approach.
In der vorliegenden Forschungsarbeit wurde untersucht, zu welchen Veränderungen es im Proteom der pankreatischen β-Zelle durch Erzeugung von Hyperglykämie und/oder Hyperlipidämie kommt, die z.B. im Rahmen des Metabolischen Syndroms auftreten können.
Für die Experimente wurde die Zelllinie BRIN BD11 verwendet. Eine Behandlung erfolgte vergleichend mit Glucose (25 mM) und/oder Docosahexaensäure (DHA 0,1 mM) für 24 Stunden.
Das Proteom der BRIN-BD11 Zellen wurde mit Hilfe von 2D Differenzial-Fluoreszenz-Gelelektrophorese (DIGE) analysiert und die Proteine unter Verwendung der Massenspektrometrie identifiziert. Es konnten insgesamt 1101 Proteine in 1487 detektierten Spots bestimmt werden. Darunter stellten sich 90 Spots unter den oben genannten Stimulationen als signifikant reguliert dar. Aus diesen wurden 63 regulierte Proteine identifiziert, die sich verschiedenen Bereichen des Stoffwechsels zuordnen lassen, u.a. dem Glucosestoffwechsel, der Atmungskette, katabolen Prozessen oder den Reparatur- und Schutzmechanismen.
Eine Ingenuity Pathway Analyse anhand der regulierten Proteine ergab Zuordnungen zu 3 Netzwerken:
1 Nukleinsäuremetabolismus, Lipidmetabolismus und Biochemie kleiner Moleküle,
2 DNA -Replikation, -Rekombination und -Reparatur, Nukleinsäuremetabolismus und Biochemie kleiner Moleküle,
3 Kohlenhydratmetabolismus, molekularer Transport und Biochemie kleiner Moleküle.
Weiterhin konnte eine funktionelle Einteilung sowie die Verteilung der Proteine nach Zellkompartimenten dargestellt werden.
Eine Verifizierung der Ergebnisse mittels RT-qPCR erfolgte für Cathepsin D, Endoplasmic reticulum lipid raft-associated protein 2, Melanocyte proliferating gene 1, Glutamat-Cystein-Ligase sowie für die Thioredoxin-Reduktase und das Dihydropyrimidinase-related protein 2. Desweiteren wurden Western Blot Analysen zu Thioredoxin-Reduktase und das Dihydropyrimidinase-related protein 2 durchgeführt.
Die Ergebnisse weisen auf eine Regulation im Sinne einer Kompensation der Stressoren hin, die durch gesteigerte Expression/Aktivität antioxidativer Systeme wie Glutathion und Thioredoxin erklärbar wären. Zudem konnte ein Proteommuster der BRIN BD11 Zellen erstellt werden und bildet mit der massenspekrometrischen Identifizierung der Proteine eine Grundlage für weitere Untersuchungen an der Zelllinie.
Proteom- und Transkriptom-Analysen zur Bestimmung der Immuntoxizität ausgewählter Naturstoffe
(2017)
Der Einsatz von Tierversuchen in Forschung und Entwicklung nimmt trotz fortschreitender Optimierung von Testmethoden und –verfahren weiter zu. Zeitgleich werden fortwährend neue Substanzen isoliert oder synthetisiert, deren Wirkungen auf den humanen Organismus und speziell das Immunsystem nicht bekannt sind. In vitro Methoden stellen deshalb sowohl eine günstige und schnelle als auch eine ethisch unbedenkliche Alternative zu Tierversuchen dar. In der vorliegenden Arbeit sollten proteom- und transkriptombasierte Methoden dazu dienen, immuntoxische Eigenschaften von Naturstoffen zu identifizieren und diese Verfahren als Alternative zu Tierversuchen zu etablieren. Dazu wurden zwei humane Immunzelllinien mit Naturstoffen behandelt und das intrazelluläre Proteom sowie das Transkriptom spezifischer Biomarker-Gene analysiert. Zusätzlich dienten weitere Methoden wie Metaboliten-, Zellzyklus- und Apoptoseanalysen sowie die Identifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies dazu, Ergebnisse zu verifizieren oder zusätzliche Informationen zu erhalten. Wie zu erwarten war, zeigten die Proteomanalysen, dass sowohl immuntoxische als auch nicht-immuntoxische Substanzen eine breite Wirkung auf das intrazelluläre Proteom haben. Vor allem Proteine, die in den allgemeinen Metabolismus, zelluläre Prozesse und Prozesse der Informationsverarbeitung involviert sind, wurden durch die Behandlung mit den Substanzen in ihrer relativen Menge auf den 2D-Gelen verändert. Allein durch die Zuordnung von Proteinen zu Stoffwechselwegen war eine Abgrenzung immuntoxischer und nicht immuntoxischer Substanzen nicht möglich. Dennoch gibt die Methode einen Einblick in die Wirkungsweise der Substanzen, wodurch Wirkmechanismen entschlüsselt und Reaktionen auf das Immunsystem abgeleitet werden können. Dies wird vor allem nach der Behandlung der Zellen mit Tulipalin A und Helenalin deutlich, da auch allgemeine Stoffwechselwege wie die Purinsynthese und die anaerobe Glykolyse einen Einfluss auf das Immunsystem haben. Zusätzlich zu den allgemeinen Stoffwechselwegen wurden einzelne Proteine in ihrer Abundanz verändert, die in Reaktionen des Immunsystems wie der Zytokinbildung oder der Bildung von MHC-Molekülen involviert sind. Außerdem konnten Biomarker für Immuntoxizität auf Proteomebene entwickelt werden. Mit Hilfe dieser Daten war eine Klassifizierung der Substanzen nach ihrer Immuntoxizität möglich. Anhand dieser Analysen wurden die Testsubstanzen Tulipalin A, Helenalin, Vincristin und Cannabidiol als immuntoxisch klassifiziert. Die Klassifizierung der Substanzen als immuntoxisch aufgrund der Biomarker-Proteine und Stoffwechselwege konnte durch die Anwendung von Transkriptom-Biomarkern bestätigt werden. Neben den über 2D-Gelelektrophorese-basierten Proteomanalysen getesteten Substanzen wurden auch Bisphenol A und Ergosterolperoxid aufgrund der Transkriptombiomarker als immuntoxisch klassifiziert. Agaritin und p-Tolylhydrazin sowie der Bisphenol A bis(2,3-dihydroxypropyl) ether haben keine immuntoxische Wirkung. Neben den Proteom-basierten Methoden dient der entwickelte Entscheidungsbaum basierend auf verschiedenen Methoden als Grundlage für die Immuntoxiztätsklassifizierung. Mit dem erstellten Entscheidungsbaum konnten beispielsweise Cyclosporin A, Helenalin und Tulipalin A durch die Anwendung gezielter Tests als immuntoxisch eingestuft werden, während Mannitol als nicht-immuntoxisch bestätigt wurde. Zusammenfassend war es mittels in vitro Methoden möglich, die Immuntoxizität verschiedener Naturstoffe zu identifizieren. Neben Proteom-basierten Methoden wurden auch Transkriptom- sowie funktionelle und Metabolomanalysen genutzt. Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren bekannten immuntoxischen und nicht-immuntoxischen Substanzen würde eine Anwendung als Alternative zu Tierversuchen für eine erstes Screening Testung neuer Substanzen ermöglichen und so sowohl Zeit und Kosten sparen als auch ethische Bedenken minimieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal in der aktuellen Literatur das Proteom von einer humanen und einer bakteriellen Zellreihe nach Behandlung mit sogenanntem tissue-tolerable Plasma hypothesenfrei analysiert. Mit diesem neuartigen Ansatz konnten die vorliegenden aktuellen Literaturdaten größtenteils bestätigt und erheblich erweitert werden. So konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit TTP dosisabhängig zu einer signifikant vermehrten Proliferation der humanen respiratorischen S9-Zellen führt. Als therapeutisch vielversprechendste Dosis wurde dabei, wie auch schon in der Literatur vermutet, die 120s-Behandlung identifiziert, wobei auch kleinere Dosen eine vorteilhafte Tendenz aufzeigten. Nichtsdestotrotz sind weitere Studien dringend erforderlich, um insbesondere die Langzeit- und Nebenwirkungen von TTP aufzuzeigen. Dass die Behandlung auch Risiken bergen könnte, zeigen die auf Proteinebene erhaltenen Ergebnisse, wo mit steigenden TTP-Dosen auch die Veränderungen der Expression von Proteinen der Funktionskomplexe DNA-Schäden und Apoptosefaktoren zunehmen. Unklar ist bislang, wie sich der Verlauf über den 120h-Zeitraum hinaus darstellt und mit welcher Häufig- und Regelmäßigkeit die Behandlung in der Klinik erfolgen müsste, um einen nachhaltigen, therapeutisch relevanten Effekt zu erzielen. Zum Nachweis der Praxistauglichkeit der Plasmatherapie sind weitere Studien erforderlich, um eben diese Fragen zu beantworten und auszuschließen, dass die negativen Auswirkungen bedingt bspw. durch verstärkte Apoptoseinduktion eventuell zu einem späteren Zeitpunkt die positiven Effekte der TTP-Behandlung überlagern oder antagonisieren. Notwendig sind auch klinische Studien in der Hals-Nasen-Ohrenkunde, die das Wachstumsverhalten der Zellen im Allgemeinen, aber auch im Speziellen der respiratorischen Zellen in vivo zeigen. Die in vitro gefundenen Resultate geben maximal einen kleinen Fingerzeig auf das, was in einem komplexen, wechselwirkenden Organismus zu erwarten ist. Bislang sind in diesem Bereich noch keine größeren Studien erfolgt.
Gezeigt werden konnte in der Arbeit auch, dass die Staphylokokken deutlich anfälliger für TTP sind als die humanen Zellen. Hier konnte das in vitro Wachstum eingeschränkt werden, was den Ergebnissen der aktuellen Literatur entspricht. Allerdings gilt hier ebenfalls, das in vitro erzielte Ergebnisse nicht ohne Weiteres auf die Klinik übertragen werden können. Auch wenn es bereits einige klinische Studien zur antimikrobiellen Wirkung von Plasma gibt, steht die Forschung noch am An-fang. Gezeigt werden muss im Verlauf noch, dass TTP auch im Biosystem Mensch die in-vitro gezeigten Effekte auslöst. Bekannt ist außerdem wie oben beschrieben, dass Staphylokokkus aureus ohnehin zu den sensibleren Keimen gehört. Eine Analyse des Verhaltens von möglicherweise resistenteren Bakterien ist nötig. Auch zu klären bleibt, wie sich Pilze unter der Behandlung verhalten und ob nicht nach Ausschalten der bakteriellen Flora möglicherweise ein Selektionsvorteil entsteht, der zu vermehrten Pilzwundinfektionen führt.
Die Ergebnisse der Arbeit konnten die Entstehung von oxidativen Stress als wichtigsten Mediator der TTP-Wirkung aufzeigen. Diese Erkenntnis deckt sich mit der aktuellen Studienlage und konnte aufgrund der umfassenden Proteomanalyse beider Zellreihen gewonnen werden. Nichtsdestotrotz müssen weitere genaue Auswertungen erfolgen. Aufgrund der sehr großen Datenmenge erfolgte im Verlauf der Analyse eine ausgiebige Ordnungs- und Filterarbeit. Trotz großer Sorgfalt ist es kaum möglich gewesen, alle Informationen zu berücksichtigen und in einer übersichtlichen Form zu erhalten. Daher sind die in der Arbeit dargestellten Ergebnissen lediglich ein kleiner Ausschnitt der offensichtlichsten Erkenntnisse. Es ist außerdem zu bedenken, dass aufgrund der technischen Limitation lediglich 1220 Proteine identifiziert werden konnten, bei aktuell 30.057 bekannten menschli-chen Proteinen [99]. Betrachtet wurden letztlich also lediglich 4% des Proteoms. Weitere globale Analysen sind im Verlauf sinnvoll und nötig, um die gewonnenen Resultate zu stärken oder zu hinterfragen .
Insgesamt präsentiert sich TTP als ambitionierte Therapiealternative, die große Möglichkeiten in der Medizin der Zukunft verspricht. Insbesondere in der HNO birgt es vielversprechende Möglichkeiten bei bislang problematischen Erkrankungen. Die Forschung ist allerdings gefordert, weitere umfassende Studien durchzuführen um die Sicherheit und Praktikabilität zu gewährleisten.
Staphylococcus aureus ist ein Gram-positives pathogenes Bakterium, welches bei ca. 30 % der gesunden Bevölkerung zur kommensalen Flora der Nasenschleimhaut gehört. Jedoch zählt S. aureus auch zu den häufigsten Erregern bakterieller Infektionen beim Menschen. Aus diesem Grund wurden S. aureus-Stämme in zahlreichen Studien untersucht, um die Pathophysiologie und Virulenz der Bakterien sowie die zugrundeliegenden Regulationsmechanismen zu verstehen. Die Expression von Virulenzfaktoren wird direkt oder indirekt durch verschiedene Regulatoren beeinflusst. Zu diesen zählen beispielsweise das Quorum-Sensing-System Agr, der alternative Sigma-Faktor SigB und das Zweikomponentensystem SaeRS. Bei der Regulation der Genexpression spielt neben Mechanismen, die die Transkriptionsinitiation beeinflussen, auch die Transkriptions-termination eine Rolle. Bei Bakterien unterscheidet man zwischen der Rho-unabhängigen und der Rho-abhängigen Transkriptionstermination. In bisherigen Studien wurde die Rolle des Transkriptionsterminationsfaktors Rho in Escherichia coli, Bacillus subtilis und Mycobacterium tuberculosis untersucht. Hierzu zählt unter anderem das Silencing von horizontal erworbenen Genen, die Verhinderung von DNA-Doppelstrangbrüchen und die Unterdrückung der persistierenden Antisense-Transkripten. Besonders die erhöhte Antisense-Transkription konnte auch in einer Tiling Array-Studie des S. aureus Wildtypstammes HG001 und einer isogenen Δrho-Mutante ST1258 festgestellt werden. In dieser Transkriptom-Analyse wurden die S. aureus-Stämme in RPMI- und TSB-Medium in der exponentiellen und stationären Wachstumsphase untersucht. Es konnten insgesamt 416 chromosomale Regionen identifiziert werden, deren Transkriptmenge in einer der vier Bedingungen in der Δrho-Mutante im Vergleich zum Wildtyp wenigstens 4-fach erhöht waren. Von diesen Regionen ließen sich nur 11 % annotierten Genen zuordnen, während eine massive Erhöhung der Menge solcher Transkripte festgestellt wurde, die vom Gegenstrang kodierender Gene stammen.
Ausgehend von diesen Befunden wurde in dieser Studie das zelluläre und extrazelluläre Proteom des S. aureus Wildtyps HG001 und der Δrho-Mutante ST1258 verglichen, um die Auswirkungen der Abwesenheit von Rho auf das Proteom zu untersuchen. Dabei lag die Mehrheit der relativ quantifizierten Proteine in erhöhten Mengen in der Δrho-Mutante im Vergleich zum Wildtyp vor. Viele dieser Proteine konnten dem SaeRS-Zweikomponentensystem von S. aureus zugeordnet werden. In der Proteomanalyse konnten 34 von 39 Proteinen, die durch SaeR reguliert werden, quantifiziert werden. Von diesen wiesen 29 erhöhte Proteinmengen in der Δrho-Mutante auf. Durch das Sae-System werden Gene reguliert, von denen die meisten für Virulenzfaktoren, wie Adhäsine, Toxine und immune evasion-Proteine, kodieren. Die Daten der Proteomanalyse zeigen, dass in S. aureus-Zellen, denen die Aktivität von Rho fehlt, das Sae-System aktiviert wird und dadurch die Induktion des SaeR-Regulons zu beobachten ist.
Die Relevanz dieser Ergebnisse wurde durch ein in vivo-Infektionsexperiment untersucht. In einem Bakteriämie-Modell führte die Inaktivierung von Rho zu einer signifikant erhöhten Virulenz von S. aureus, welche sich in einer signifikant reduzierten Überlebensrate der Mäuse äußerte. Zwischen dem Wildtyp und dem Komplementationsstamm konnte kein signifikanter Unterschied in der Überlebensrate der infizierten Mäuse gezeigt werden.
Es ist bekannt, dass SaeRS-abhängige Virulenzfaktoren auch für die Invasion in Epithel- und Endothelzellen entscheidend sind. Anhand der Zahl der internalisierten S. aureus-Bakterien nach Infektion von humanen Lungenepithelzellen konnten in dieser Arbeit keine Unterschiede zwischen dem Wildtyp HG001 und ∆rho-Mutante ST1258 im zeitlichen Verlauf festgestellt werden. Dabei konnten weder Unterschiede im Überleben in 16HBE14o- Zellen noch in der Internalisierungsrate in A549-Zellen zwischen den beiden Stämmen gezeigt werden.
Das Antibiotikum Bicyclomycin ist ein spezifischer Inhibitor des Transkriptionsterminationsfaktors Rho und wird in Studien zur Rho-abhängigen Transkriptionstermination in Gram-negativen Bakterien eingesetzt, da in diesen Rho ein essentielles Protein ist. In Transkriptom- und Proteomanalysen konnten vergleichbare Effekte durch die Behandlung des Wildtyps mit Bicyclomycin wie in der ∆rho-Mutante hervorgerufen werden. Die Antisense-Transkription und die Expression SaeRS-abhängigen Gene waren im Wildtyp nach Gabe von Bicyclomycin deutlich erhöht. Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des Sae-Systems unter Rho-defizienten Bedingungen direkt mit der Transkriptionsterminationsaktivität von Rho verbunden ist und eine neue Verbindung zwischen antibiotischer Wirkung und schädlicher Virulenzgenexpression in S. aureus herstellt werden konnte. In anderen Studien konnten Effekte von Antibiotika auf die Expression von Virulenzfaktoren in S. aureus gezeigt werden, jedoch wurden in diesen Studien die Effekte von Anti-Staphylokokken-Wirkstoffen untersucht. Im Gegensatz dazu ist im Fall von Bicyclomycin ein Antibiotikum verwendet worden, das gegen Gram-negative Bakterien wirksam ist und dennoch die Expression von Virulenzfaktoren in S. aureus beeinflusst. Diese Untersuchungen haben damit auch klinische Relevanz, nicht nur für Patienten, die an gemischten Infektionen mit verschiedenen Bakterienarten leiden, sondern auch für Patienten mit einer Gram-negativen bakteriellen Infektion, die jedoch Träger von S. aureus sind.