Doctoral Thesis
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TRPC3 und TRPC6 sind Mitglieder der nicht selektiven Kationenkanäle aus der Superfamilie der „Transient Receptor Potential“-Kanäle (TRP-Kanäle). In der Erforschung der patho-physiologischen Abläufe der Duchenne Muskeldystrophie und des damit einhergehenden gestörten intrazellulären Kalziumhaushalts rückten besagte Kanäle als mögliche verursachende Kandidaten in den Fokus der Aufmerksamkeit. TRP-Kanäle weisen eine große Zahl unterschiedlichster Aktivierungsmechanismen auf, einer davon ist die Translokation. Diesen Mechanismus hat man für TRPC3 und TRPC6 bereits an verschiedenen Zellkulturen und Zelllinien feststellen können. Den Nachweis einer Translokation in ausdifferenzierten Skelettmuskelzellen gab es bisher nicht und war Gegenstand dieser Arbeit. An Skelettmuskelzellen von mdx-Mäusen sowie an solchen von Kontroll-Mäusen wurden geeignete Experimente zur Translokation der Kanäle durchgeführt. Dazu wurden die Zellen mit schon bekannten Stimulantien wie Gadolinium, EGF und Thapsigargin inkubiert. Immunfluoreszenzfärbungen der Kanalproteine ergaben interessante Neuigkeiten zur zellulären Lokalisation und Translokation von TRPC3 und TRPC6 in normalen und Dystrophin-defizienten (mdx) Muskelfasern.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Gewebeexpression und Lokalisation dreier TRP Kanäle der Gruppe 1 (TRPC3, TRPC6 und TRPV5) in verschiedenen Geweben der Maus beschrieben. Die Kanäle TRPC3, TRPC6 und TRPV5 transportieren vor allem Kalzium in das Innere der Zelle. Für die Bestimmung der Genexpression wurde die real-time RT-PCR genutzt. Zusätzlich wurde die mRNA-Menge mittels densiometrischer Auswertung der nicht-radioaktiven in-situ-Hybridisierung ermittelt. Die in-situ Hybridisierung wurde außerdem für die Lokalisation der mRNA im Gewebe genutzt. Für die Lokalisation des Proteins in den verschiedenen Maus-Organen standen Antikörper für die indirekte Immunhistochemie zur Verfügung. In den Ergebnissen zeigte sich, dass TRPC3 in allen untersuchten Geweben nachweisbar war, jedoch mit deutlicher Konzentration im zentralen Nervensystem und der Lunge. Auch in Herz und Skelettmuskel konnte TRPC3 deutlich mittels PCR und Antikörpernachweis gefunden werden. Funktionell ist der Zusammenhang von Kalziumhomöostase und Signaltransduktion sowie Muskelkontraktion entscheidend. Die höchsten Expressionslevel von TRPC6 zeigten sich ebenfalls in Gehirn und Lunge; ein positiver Nachweis gelang aber ebenfalls in den Zellen des Dünndarmes, der Leber, des distalen Tubulus der Niere und in Zellen des exokrinen Pankreas. In Zellen der Skelettmuskulatur scheint TRPC6 keine entscheidende Rolle zu spielen. Es gelang zusätzlich der Nachweis im Herzmuskel. TPRV5 wird besonders in der Niere, dort in Zellen des distalen Tubulus exprimiert, was der wichtigen Funktion in der Kalziumrückresorption entspricht. In geringerem Maße, aber deutlich auf Protein und RNA Ebene bestätigt, ist der Kanal auch in Lunge, Milz und Gehirn nachweisbar. Die drei untersuchten Kanäle sind in fast allen untersuchten Geweben nachzuweisen; jedoch lässt die genauere Lokalisation in bestimmte Zellen der untersuchten Organe bessere Rückschlüsse auf die Funktion zu. Insbesondere konnten in dieser Arbeit neue Ergebnisse über bisher nicht ausreichend untersuchte Organe wie Gehirn, Skelettmuskel, Herz und Reproduktionsorgane erhoben werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden eine Grundlage für die weitere Erforschung der Familie der TRP Kanäle am Mausmodel.
Der TRPC6 Kanal ist Teil einer Familie nicht selektiver Kationenkanäle, den Transient-Receptor-Potential-Canonical Kanälen. Der TRPC6 Kanal ist durch Diacylglycerol (DAG), ein Spaltprodukt der Phospholipase C, aktivierbar. Durch den Kinaseinhibitor ML-9 kann er inaktiviert werden. In der Skelettmuskulatur von Wildtyp-Mäusen und Dystrophin-defizienten mdx-Mäusen wird der TRPC6 Kanal stark exprimiert. Eine Beteiligung des TRPC6-Kanals am Store-Operated-Calcium-Entry (SOCE) wurde ebenso diskutiert wie ein Vorliegen als Rezeptor-gesteuerter Ionenkanal (ROC). In dieser Arbeit wurde der Kalziumeinstrom des Sarkolemms mit Hilfe der Mangan-Quench-Technik an Mäuseskelettmuskelzellen untersucht. Der TRPC6 Kanal wurde mittels ML-9 inhibiert mit dem Ziel einen möglichen Einfluss auf den Kalziumeinstrom in die Skelettmuskelzellen der Mäuse zu untersuchen. Dies geschah sowohl in Ruhe als auch nach Entleerung der intrazellulären Kalziumspeicher. Es konnte nachgewiesen werden, dass der TRPC6 Kanal nicht zum Ruhekalziumeinstrom in der Skelettmuskulatur beiträgt. Er ist dort zwar hoch exprimiert, jedoch unter Ruhebedingungen nicht aktiv. Da der Kanal durch DAG und auch Hyperforin aktivierbar ist, spricht dies für ein Vorliegen als Rezeptor-gesteuerter Kanal in Skelettmuskelzellen. Durch die Anwendung des SERCA-Inhibitors Thapsigargin konnte der SOCE sowohl in Wildtyp- als auch mdx-Skelettmuskelzellen dargestellt werden. Nach Vorinkubation mit Thapsigargin zeigte sich jeweils ca. eine Verdoppelung der Quenchraten im Vergleich zu den Ruhebedingungen. Auch nach Entleerung der Kalziumspeicher blieb der TRPC6 Kanal inaktiv. Der TRPC6-Kanal ist am SOCE-Mechanismus, zumindest in Mäuseskelettmuskelzellen, nicht beteiligt. Eine Beteiligung anderer Mitglieder der TRPC-Familie bleibt jedoch denkbar. Für eine mögliche Beteiligung des Kanals am pathologisch erhöhten Kalziumeinstrom des Sarkolemms, wie sie im Rahmen der Pathogenese der Duchenne-Muskeldystrophie diskutiert wird, konnten in dieser Arbeit keine Hinweise gefunden werden. Hinsichtlich der getesteten Parameter unterschieden sich die Muskelfasern von Wildtyp-Mäusen nicht von den Zellen Dystrophin-defizienter mdx-Mäuse.
