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Untersuchung von Virulenzdeterminanten des Newcastle Disease Virus mit Hilfe von Virusrekombinanten
(2020)
Die Newcastle Krankheit (Newcastle Disease, ND) wird durch das aviäre Paramyxovirus-1 (APMV-1) verursacht und zählt zu den bedeutendsten Viruserkrankungen des Geflügels, wobei die Ausprägung der Krankheitssymptome sehr stark variiert. Das APMV-1 der Taube (pigeontype paramyxovirus, PPMV-1) infiziert größtenteils Brief-, Rasse-, Stadt- und Wildtauben, jedoch ist auch Wirtschaftsgeflügel für diesen Erreger empfänglich. Die Krankheit ist weltweit verbreitet und besonders die schweren Verlaufsformen, ausgelöst durch den mesogenen und den velogenen Pathogenitätstyp, führen bis heute zu hohen wirtschaftlichen Verlusten. Durch die Entwicklung des reversen genetischen Systems für das NDV ist es möglich, verschiedene Bereiche des viralen Genoms unterschiedlich pathogener NDV-Isolate auszutauschen und rekombinante Viren zu generieren, um mögliche Virulenzdeterminanten zu identifizieren. Lange Zeit galt die Aminosäuresequenz an der proteolytischen Spaltstelle des Fusionsproteins als die Virulenzdeterminante des NDV. Studien der letzten Jahre belegen aber zunehmend, dass es weitere Sequenzabschnitte im Genom gibt, die Einfluss auf die Pathogenität haben. Besonders bei den Taubenisolaten zeigte sich, dass diese trotz einer polybasischen Aminosäuresequenz an der proteolytischen Spaltstelle des F-Proteins, die typisch für meso- und velogene APMV-1 ist, mit einem ermittelten intrazerebralen Pathogenitätsindex (ICPI) < 0,7 als lentogen (niedrig virulent) einzuordnen sind.
Die Bestimmung der Gesamtsequenz des vorliegenden PPMV-1 Isolates R75/98 und die Herstellung des entsprechenden rekombinanten Virus rR75/98 waren Ziel dieser Arbeit. Nach der in vitro-Charakterisierung, die keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Wildtyp und der Rekombinante zeigte, verdeutlichte die ICPI-Bestimmung, dass sich R75/98 und rR75/98 in ihrer Pathogenität unterschieden. Während R75/98 mit einem ICPI von 1,1 als mesogen eingestuft wurde, entsprach das rekombinante Virus rR75/98 mit einem ICPI von 0,28 dem lentogenen Pathotyp. Durch einmalige Passage der Rekombinante im Tier entstand das Reisolat RrR75/98, welches sich in seinen in vitro-Eigenschaften nicht von den beiden anderen Isolaten unterschied, aber in seiner Pathogenität (ICPI 0,93) wieder dem mesogenen Ausgansvirus R75/98 entsprach. Unter Nutzung des Next Generation Sequencing war es möglich, die Grundlagen für diese Pathogenitätsunterschiede aufzuzeigen. Während es zwischen R75/98 und rR75/98 insgesamt acht Aminosäuresubstitutionen gab (drei im F-Protein, zwei im HN-Protein und drei im L-Protein), die zu einer Verminderung der Pathogenität führten, wurden nur zwei Aminosäuremodifikationen (jeweils eine im F- und L-Protein) nachgewiesen, um die Pathogenitätssteigerung vom lentogenen rR75/98 hin zum mesogenen RrR75/98 hervorzurufen. Beide Aminosäureaustausche haben einen Effekt auf die vorhergesagte Proteinstruktur und beeinflussen vermutlich die Proteinfaltung, was wiederum eine nicht unwesentliche Auswirkung auf die biologische Aktivität des Virus haben kann. Besonders die Modifikation im F-Protein an Aminosäureposition 472 verdeutlicht, dass neben der Aminosäuresequenz an der proteolytischen Spaltstelle andere Bereiche dieses Proteins Einfluss auf die NDV-Virulenz haben.
Zur Untersuchung des Einflusses einzelner Abschnitte des F-Proteins auf die Pathogenität wurden im ursprünglich lentogenen NDV Clone 30 einzelne Sequenzbereiche durch die des mesogenen PPMV-1 R75/98 substituiert, die entsprechenden rekombinanten Viren generiert und charakterisiert. Es zeigte sich, dass sowohl die Expression als auch die Inkorporation der chimären Fusionsproteine mittels Western-Blot nachgewiesen werden konnte. Die Rekombinanten unterschieden sich weder in Größe noch in Form (Elektronenmikroskopie) und die chimären Fusionsproteine konnten an der Plasmamembran der Wirtszellen detektiert werden. Alle Rekombinanten waren in der Lage, Synzytien auszubilden und in verschiedenen Zelllinien (Wachtelmuskelzelle, Hühnerembryofibroblasten) bzw. in embryonierten Hühnereiern zu replizieren. Bei der Bestimmung des ICPIs zeigten sich jedoch Unterschiede. Zwei der sechs Rekombinanten wurden als lentogen eingestuft, die anderen vier wurden dem mesogenen Pathogenitätstyp zugeordnet. Es konnte gezeigt werden, dass neben der Interaktion der homologen F1- und F2-Untereinheit, die zytoplasmatische Domäne des Fusionsproteins einen bedeutenden Einfluss auf die Pathogenität von NDV hat. Auch für andere Vertreter der Paramyxoviren ist bekannt, dass die zytoplasmatische Domäne der beiden Oberflächenproteine F und HN mit dem M-Protein interagiert und diese Interaktion wichtig für den Zusammenbau der Viruspartikel, den Knospungsvorgang und die Freisetzung der Viren ist.
Neben dem Fusionsprotein existieren zusätzlich Virulenzdeterminanten in den weiteren NDV-Proteinen. Während es bereits Untersuchungen zum Einfluss auf die Pathogenität für die Proteine NP, P, V, M, F, HN und L gibt, war es noch nicht möglich, eine Aussage zum W-Protein zu treffen, da der Nachweis dieses Proteins bis dato nicht erfolgte. Zunächst wurde für unterschiedlich pathogene NDV der Bereich der P-Gen-Editierungsstelle amplifiziert, gefolgt von einer Tiefensequenzierung, um zusätzlich zur P- und V-mRNA auch die W-mRNA nachzuweisen und deren mengenmäßigen Anteil zu bestimmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden außerdem Plasmide hergestellt, die für weiterführende Arbeiten genutzt werden konnten, in denen erstmals der Nachweis des W-Proteins für NDV gelang.
Wie andere Vertreter der Paramyxoviridae vergrößert das NDV durch Editierung von Transkripten seine Kodierungskapazität. Durch co-transkriptionelle mRNA-Editierung kodiert das P-Gen beim NDV sowohl für das P-, das V-, als auch das W-Protein. Die drei Proteine gleichen sich N-terminal, wohingegen die C-Termini in Länge und AS-Zusammensetzung variieren. Während sowohl Expression als auch Inkorporation des P- und V-Proteins in das NDV-Partikel nachgewiesen wurde, gab es bisher keinen Beweis für die Existenz des W-Proteins.
Für den Nachweis der Expression des NDV W-Proteins wurden W-spezifische Seren auf Grundlage von Peptiden generiert, welche im spezifischen C-Terminus lokalisiert waren und vorhersagbare antigene Regionen beinhalteten. Je eines der Kaninchenseren ermöglichte die Detektion von Plasmid-exprimiertem NDV W-Protein, sowie W-Protein in infizierten Zellen mittels indirekter IF und WB-Analyse.
Eine Inkorporation des W-Proteins in NDV-Virionen deuteten WB- und massen-spektrometrische Analysen an, während die Abwesenheit des Proteins für rekombinante NDV deren W-Protein Expression durch unterschiedliche Mutations-ansätze unterbunden wurde, in infizierten Zellen und Viruspartikeln bestätigt werden konnte.
Untersuchungen infizierter Zellen mit Hilfe konfokaler Mikroskopie zeigten eine Akkumulation des W-Proteins im Zellkern. Diese Lokalisation wurde auf eine zweigliedrige NLS im spezifischen C-Terminus zurückgeführt und die Funktionalität der NLS anhand der zytoplasmatischen Verteilung des Proteins in transfizierten bzw. infizierten Zellen nach Mutation der zwei basischen Cluster bestätigt.
Vergleichende Untersuchungen rekombinanter und WT-NDV zeigten keinen Einfluss der NLS bzw. der Expression des W-Proteins auf die Virusreplikation in vitro.
Bei der Analyse wirtsspezifischer, IFN-antagonistischer Funktionen des NDV W-Proteins in der späten Phase der Typ-I-IFN-Antwort mit Hilfe eines Hühnerzell-basierten IFN signaling Assays konnte sowohl für das W-Protein eines lentogenen (NDV Cl30), als auch eines velogenen NDV-Stammes (NDV Herts_I) kein inhibierender Effekt auf den untersuchten Signalweg gezeigt werden. Stattdessen deutete sich für das NDV Cl30 W-Protein ein aktivierender Effekt an.
Sequenzanalysen zur Vorhersagbarkeit von W-Proteinen bzw. C-terminal kodierten NLS in NDV-Stämme unterschiedlicher Virulenz und Genotypen ließen keinen Rückschluss auf einen Einfluss des W-Proteins auf die Pathogenität von NDV zu.
Im Gegensatz zum W-Protein war die Expression des NDV V-Proteins essentiell für die Replikation von NDV in vitro und in ovo.
Für die Analyse des Einflusses von V-Proteinen unterschiedlicher Herkunft auf die Replikation eines lentogenen NDV in vitro wurden diese in verschiedenen rekombinanten Viren von einem zusätzlich inserierten ORF exprimiert und die Expression der homo- und heterologen V-Proteine durch stammspezifische Seren überprüft, wofür im Vorfeld ein NDV R75/95 V-spezifisches Peptidserum generiert wurde. Keines dieser rekombinanten Viren zeigte Replikationsvorteile in vitro im Vergleich zum parentalen Virus.
Ein Hinweis auf einen Einfluss der Herkunft des V-Proteins konnte mit Hilfe des Hühnerzell-IFN signaling Assays erhalten werden. Während das V-Protein eines lentogenen NDV (NDV Cl30) keinen inhibierenden Effekt zeigte, deutete sich ein leicht inhibierender Effekt für das velogene NDV Herts_I V-Protein in einer Zelllinie an.
Pilotstudien zur potenziellen IFN-antagonistischen Funktion des V-Proteins wurden nach vorheriger Transfektion und Überexpression von V-Proteinen unterschiedlicher Pathotypen bzw. nach Vorbehandlung von Zellen mit Hühner-IFN-α vor Infektion durchgeführt. Die Replikation des korrespondierenden WT-Viruses bzw. rekombinanten Virus mit homo- oder heterologer V-Proteinexpression war in vitro in beiden Fällen nicht verändert.
Die McsB Argininkinase spielt in grampositiven Bakterien wie Bazillen, Staphylokokken und Listerien durch die Phosphorylierung von Guanidinogruppen eine gesonderte Rolle innerhalb der Familie der Kinasen. Insbesondere während der bakteriellen Stressadaptation scheint diese Art der posttranslationalen Proteinmodifikation von großer Bedeutung zu sein. Um die Funktionsweise der McsB Kinasefunktion in Verbindung mit dessen McsA Modulatorprotein besser verstehen zu können, wurden konservierte Arginine gegen Lysin substituiert. Auf diese Weise konnten entscheidende intramolekulare Positionen identifiziert werden, die für die Ausbildung der Autokinase- bzw. Phospho-Transferase Aktivität von Bedeutung sind. Diese konnten darüber hinaus in Einklang mit der McsB Struktur (Suskiewicz et al., 2019) gebracht werden.
Eines der Zielproteine für die McsB vermittelte Argininphosphorylierung (Arg-P) ist dabei der CtsR Regulator, welcher die Genexpression der Clp-Maschinerie in Bacillus subtilis reprimiert. Mit Hilfe globaler Transkriptomanalysen war es möglich, neben den bereits etablierten Zielgenen auch eine Art fine-tuning Regulation des MhqR Regulons aufzuzeigen.
Zwei weitere Proteine, die durch McsB vermittelte Arg-Ps beeinflusst werden, sind der Modulator der generellen Stressantwort, MgsR, und die intrinsisch inaktive Glutamat-Dehydrogenase GudB. Insbesondere GudB fällt durch die Identifikation von 15 Phospho-sites auf, wohingegen lediglich zwei Arg-P Bindungsstellen für MgsR nachgewiesen werden konnten (Elsholz et al., 2012; Schmidt et al., 2014; Trentini et al., 2016). Dennoch ist die GudB Stabilität nur geringfügig durch die McsB Kinasefunktion beeinflusst, wohingegen die MgsR Degradation entscheidend durch Arg-Ps beeinflusst scheint. Durch die Substitution der Arginine von MgsR gegen Glutamat wurde eine Art Phospho-Mimikry integriert. So konnten die Auswirkungen auf Regulatoraktivität und Stabilität von MgsR durch mögliche Arg-Ps im Detail untersucht werden.
In diesem Zusammenhang wurden durch detaillierte Untersuchungen der MgsR Degradation zusätzliche Informationen zur Funktionsweise von McsB als Adapterprotein gesammelt. Dieses legten die Vermutung nahe, dass McsB nicht nur als ClpC-Adapterprotein fungiert, sondern darüber hinaus auch die ClpX-abhängige Proteindegradation unterstützt.
Vergleichende Untersuchungen zu rekombinanten Toxoplasma-gondii-Isolaten natürlichen Ursprungs
(2020)
Toxoplasma gondii ist ein weltweit vorkommender einzelliger Parasit mit hohem zoonotischen Potential. In Nordamerika und Europa haben sich drei klonale Toxoplasma-Linien durchgesetzt, Typ I, Typ II und Typ III. Sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Virulenz in Labormäusen: Toxoplasma gondii vom Typ I gilt im Allgemeinen als hochvirulent, wohingegen Typ II und III wenig virulent in Labormäusen sind. In Deutschland dominieren T. gondii vom Typ II. Trotz selten vorkommender natürlicher sexueller Rekombinationen von T. gondii in Deutschland konnten in einer vorausgegangenen Studie rekombinante T. gondii-Typ II-III-Oozysten aus dem Kot einer natürlich infizierten Katze in Deutschland isoliert werden. Mittels klonaler Vereinzelung wurden in einer weiteren vorausgegangenen Studie aus diesen Oozysten die fünf Tachyzoiten-Klone B6-H6, 2-C10, 2-H8, C12 und A7 generiert, die sich in der Verteilung ihrer Typ II- und III-Allele voneinander unterschieden. Ziel dieser Arbeit war es, die fünf Klone vergleichend zu untersuchen hinsichtlich ihrer Geno- und Phänotypen. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf die bekannten polymorphen Virulenzfaktoren ROP18, ROP5, ROP16 und GRA15 gelegt, die maßgeblich für Unterschiede in der Labormausvirulenz zwischen den klonalen Linien sorgen können. ROP18 und ROP5 sind an der Inhibition der IRG-vermittelten Zerstörung der parasitophoren Vakuole, dem Hauptabwehrmechanismus in Mäusen, beteiligt. Während alle fünf Klone das virulente Allel von ROP5 besaßen, hatten nur zwei der fünf Klone, B6-H6 und 2-C10, das virulente Allel von ROP18, dessen virulenter Genotyp in einer hohen Expression resultiert. Diese beiden Klone lösten auch eine 100 %-ige Mortalität in den infizierten BALB/c-Mäusen aus. Hier stimmte der virulente ROP18-Genotyp mit der hohen Mausvirulenz überein. Die anderen drei Klone, 2-H8, C12 und A7, besaßen das nicht virulente Allel von ROP18. Von letzteren drei Klonen lösten jedoch lediglich nur C12 und A7 eine geringere, 30 %-ige Mortalität in infizierten BALB/c-Mäusen aus. Hier würde der nicht-virulente ROP18-Genotyp die niedrigere Virulenz erklären. Der Klon 2-H8, der ebenso ein nicht-virulentes ROP18-Allel besaß, löste dagegen eine 100 %-ige Mortalität aus. Demnach ließe sich die Virulenz der infizierten BALB/c-Mäuse in dieser Studie nur in vier von fünf Klonen mit dem ROP18-Genotypen erklären. Neben ROP5 und ROP18 wurden auch die Virulenzfaktoren ROP16 und GRA15 untersucht. Diese regulieren das Zytokinprofil in infizierten Makrophagen und können dadurch Einfluss auf den klinischen Verlauf der Infektion nehmen. Von ROP16 und GRA15 besaßen jeweils alle fünf Klone das virulente Allel. Daher kann auch der Genotyp dieser Virulenzfaktoren hier nicht alleine die Unterschiede in der BALB/c-Mausvirulenz erklären. Auch das Expressionsprofil der Virulenzfaktoren in in-vitro inokulierten J-774A.1-Makrophagen mit geringen, wahrscheinlich nicht biologisch relevanten Abweichungen, ließ keine eindeutigen Rückschlüsse für die Ursache der unterschiedlichen Mausvirulenzen zu. Die in-vitro-Inokulation von J-774A.1-Makrophagen mit den Klonen ergab weiterhin, dass der mittelvirulente Klon C12 in der Lage war, die Makrophagen deutlich früher zu infizieren und eine höhere IL-12-Expression hervorzurufen. In überlebenden BALB/c-Mäusen verursachte er einen geringeren Gewichtsverlust gegenüber den anderen Klonen. Es kann für diese Studie festgehalten werden, dass sich die Virulenz der Klone in Labormäusen nicht allein durch das Vorhandensein virulenz-vermittelnder ROP18- oder anderer Virulenzgene erklären ließ. Durch die sexuelle Rekombination zwischen T. gondii des Typs II und III waren offenbar Allelkombinationen entstanden, welche auf ein komplexes multifaktorielles Netzwerk schließen lässt, das ursächlich für die Unterschiede in der Mausvirulenz und der Makrophagenfunktionalität zu sein schien.
Rekombinante Vektorvakzinen, basierend auf Viren der Newcastle-Krankheit (NDV) haben sich als kostengünstig, schnell herstellbar und sicher für die Applikation bei Geflügel und Säugetieren erwiesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei rekombinante Vakzineviren, die das lentogene NDV Clone 30 als Vektor nutzen, für die Prävention der hochpathogenen aviären Influenza (HPAI) bei Hühnerküken, die maternale aviäre Influenzavirus-spezifische Antikörper (AIV-MDA) aufweisen, und die Pest der kleinen Wiederkäuer (PPR) bei Ziegen evaluiert.
Während bekannt ist, dass rekombinante NDV/AIV-H5-Vakzineviren in spezifisch pathogenfreien Eintagsküken eine protektive Immunantwort induzieren, ist diese bei Küken in HPAI-Endemiegebieten meist durch vorhandene AIV-MDA negativ beeinflusst. Durch die Generierung einer NDV-Rekombinanten (rNDVsolH5_H5), die das HA des HPAIV H5N1 von zwei individuellen Fremdgenen exprimiert, konnte eine Überexpression des H5 und in Folge der okulonasalen Immunisierung von zwei- und drei-Wochen-alten AIV-MDA+-Küken die Überwindung der AIV-MDA und die Bildung von wirtseigenen AIV-H5-spezifischen Antikörpern erreicht werden. Die in Folge einer HPAIV H5N1-Belastungsinfektion vermittelten Protektionsraten beliefen sich auf 85 % bei zwei-Wochen-alten und auf 100 % bei drei-Wochen-alten Hühnern, deren Ausscheidung des virulenten Wildtypvirus im Vergleich zu Kontrolltieren signifikant reduziert war. Auch wenn das rekombinante Impfvirus in ein-Wochen-alten AIV-MDA+-Küken replizieren konnte, weist die Schutzrate von 40 % darauf hin, dass die Immunisierung sehr junger AIV-MDA+-Küken nicht zu empfehlen ist.
Die subkutane Immunisierung von Ziegen mit dem rekombinanten Vektorvirus rNDV_HKur, das das Hämagglutinin des Morbillivirus der kleinen Wiederkäuer (small ruminant morbillivirus, PPRV) exprimiert, schützte diese vor einer virulenten Wildtypvirus-Infektion. Nach zweimaliger Applikation wurden, wie nach der Impfung mit einer atttenuierten PPRV-Lebendvakzine, weder Erkrankungszeichen beobachtet noch eine hämatogene Streuung und nur geringgradige Replikation bzw. Ausscheidung des PPR-Wildtypvirus nachgewiesen, was auf die Bildung PPRV-neutralisierender Antikörper nach der Immunisierung zurückzuführen ist. Somit konnte gezeigt werden, dass sich das rekombinante NDV/PPRV-H für die Prävention der PPR bei Ziegen eignet. Mit NDV als Vektorvirus konnten nachweislich die Anforderungen sowohl bezüglich der DIVA-Applikation als auch einer hohen Thermostabilität erreicht werden.
Um NDV als Vektorvirus gezielt zu verändern bzw. für dessen unterschiedliche Anwendungen zu verbessern, ist es von Vorteil die Funktion der einzelnen viralen Proteine zu kennen. Mit dem erstmaligen Nachweis der Expression des W-Proteins können nun mit Hilfe des generierten W-spezifischen Peptidantiserums weitere in-vitro- und in-vivo-Analysen erfolgen, um dessen Funktion im viralen Replikationszyklus näher zu untersuchen.
Der Kernexport neusynthetisierter Kapside stellt einen Schlüsselprozess in der Herpesvirus-Replikation dar. Die zugrundeliegenden Mechanismen dieser Vesikel-vermittelten Translokation sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Der nuclear egress wird dabei maßgeblich von zwei viralen Proteinen dirigiert, die in PrV und HSV-1/-2 als pUL31 und pUL34 bezeichnet werden und in allen Herpesviren konserviert sind. Beide Proteine interagieren an der inneren Kernmembran, wo sie den sogenannten nuclear egress complex (NEC) bilden. Während pUL34 ein membranständiges Protein in der Kernmembran ist, gelangt das lösliche pUL31 über einen aktiven Transport in den Kern. Obwohl der erste Schritt der Freisetzung aus dem Kern, die Vesikelbildung und Abschnürung an der inneren Kernmembran, schon gut untersucht ist und auch die Kristallstrukturen des NEC für verschiedene Herpesviren ermittelt werden konnte, sind noch viele Fragen offen. So war zu Beginn dieser Arbeit noch unklar wie die Kapside in diese Hüllen rekrutiert werden und welche Rolle die nicht konservierte und offensichtlich flexible N-terminale Domäne von pUL31, die nicht in den Kristallstrukturen dargestellt werden konnte, für die Regulierung dieses Prozesses spielt. So konzentrierte sich diese Arbeit auf die Fragen, wie die Kapside mit dem NEC interagieren (Paper I und II) und wie der pUL31-N-Terminus diesen ungewöhnlichen Transportweg beeinflusst (Paper III).
Paper I und II: Untersuchungen zur Nukleokapsid/NEC Interaktion
Unklar ist, wie der NEC mit seiner Fracht, den Nukleokapsiden, interagiert. Auf Grundlage der vorhandenen Kristallstrukturen des Komplexes unterschiedlicher Herpesviren wurde eine Interaktionsdomäne in pUL31 postuliert und angenommen, dass dies mittels elektrostatischer Wechselwirkungen erfolgt. Um dies näher zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit geladene Aminosäuren, die als mögliche Interaktionspartner in Frage kommen, zu Alanin mutiert. Die so generierten pUL31 Mutanten wurden, nach Transfektion entsprechender Expressionsplasmide in Kaninchennierenzellen (RK13), auf ihre Lokalisation und nach Koexpression mit pUL34 auf Interaktion getestet. Die Funktionalität der mutierten Proteine während der Virusreplikation wurde mit Hilfe stabiler Zelllinien nach Infektion mit PrV-∆UL31 untersucht. Über elektronenmikroskopische Analysen wurde der Einfluss auf den Kernexport im Detail betrachtet. Hierbei konnte einem konservierten Lysin an Position 242 in PrV pUL31 im Prozess der Kapsidumhüllung eine Schlüsselrolle zugeordnet werden. Dieses Lysin befindet sich im membrandistalen Bereich des NECs, in der Alphahelix H10 von PrV pUL31. Die Substitution des K242 zu Alanin führte zu einem Abschnüren und einer Akkumulation leerer, Virushüllen-ähnlicher Vesikel im PNS, obwohl reife Kapside im Kern und in unmittelbarer Nähe zu den Akkumulationen vorhanden waren. Dies führte zu der Hypothese, dass die Ladung des Lysins direkt an der Interaktion mit dem Kapsid beteiligt ist (Paper I).
Obwohl das Lysin 242 in der Struktur des Dimers oberflächenexponiert erschien, zeigten Modellierungen im NEC Oligomer, dass diese Aminosäure vermutlich zu tief in der Struktur verborgen ist um als direkter Interaktionspartner in Frage zu kommen. Um die im vorherigen Paper aufgestellte Hypothese zu verifizieren oder auch zu widerlegen, wurde das Lysin nicht nur durch Alanin, sondern auch durch andere nicht geladene, sowohl positiv als auch negativ geladene oder in ihrer Größe variierende Aminosäuren substituiert (Paper II).
Die neu generierten Substitutionsmutanten wurden nach Transfektion der Expressionsplasmide auf ihre Lokalisation und nach Kotransfektion mit pUL34, auf ihre Interaktion untersucht. Die Funktionalität der mutierten Proteine wurde ebenfalls mit Hilfe stabil exprimierender Zelllinien analysiert. Die vorliegenden Phänotypen wurden weiter mittels elektronenmikroskopischer Analysen bestimmt. Es stellte sich heraus, dass unabhängig von der vorhandenen Ladung der Aminosäure an Position 242 der Kernexport signifikant beeinträchtigt wurde. In Strukturanalysen der einzelnen Mutanten zeigte sich, dass vielmehr die Ausrichtung und Größe der Seitenkette der ersetzten Aminosäure entscheidend war. So störte beispielsweise die Substitution zu Serin und Tyrosin, die die Lage der Seitenketten des ursprünglich vorliegenden Lysins imitierten, die Funktion des pUL31 am wenigsten und die Titer erreichten fast Wildtypwerte. Dagegen führten Substitutionen zu deutlich längeren Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Arginin, zu massiven Beeinträchtigungen des nuclear egress. Allerdings führte keine der Substitutionen zu einem unkontrollierten Abschnüren von Vesikeln ohne Aufnahme eines Kapsids an der inneren Kernmembran.
Die hier gezeigten Ergebnisse entkräfteten die Annahme einer elektrostatischen Interaktion über pUL31 K242 mit den Nukleokapsiden in PrV. Vielmehr deuteten sie auf eine strukturell basierte Störung der Kapsidaufnahme in die Vesikel hin (Paper II).
Mittels serieller Passagen von Virusmutanten die das UL31 mit der K242A Substitution exprimierten, wurde nach möglichen kompensatorischen (second-site) Mutationen gesucht, die den Defekt ausgleichen und darüber hinaus Aufschluss auf die molekularen Ursachen ziehen lassen.
Die generierten Virusrekombinanten erreichten bereits nach ca. 10 Passagen Wildtpy-ähnliche Titer. Aus den Passagen wurden verschiedene Isolate charakterisiert. Es zeigte sich zwar keine Reversion zum Lysin 242, vielmehr waren jedoch entweder weitere Mutationen in pUL31 oder in pUL34 zu finden. Während die detektierten pUL34 Mutationen zu einem späteren Zeitpunkt charakterisiert werden müssen, wurden die second-site mutierten pUL31 Proteine auf Lokalisation, Kolokalisation und Kompensation des K242A Defektes getestet. Die Ergebnisse bestärkten die Annahme eines Strukturdefektes durch K242A. Darüber hinaus konnten durch Rückmutation des K242A Defektes in den second-site mutierten pUL31 zwei Helices bestätigt werden (H5 und H11), die ähnlich der H10 einen starken Einfluss auf den Kernexport besitzen.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die Aminosäure an Position 242 nicht direkt mit den Nukleokapsiden interagiert, dass eingeführte Mutationen jedoch die Umorganisation des NEC-Oligomers, welche offensichtlich notwendig für die effiziente Kapsidumhüllung an der inneren Kernmembran ist, stört und so den nuclear egress inhibiert (Paper II).
Es zeigte sich, dass sich die Struktur-Funktions-Beziehungen in den NECs komplexer darstellen als vermutet. Die Ergebnisse dieser Arbeit können zwar nicht den Mechanismus des Kapsidexports bzw. der Kapsidbindung und -inkorporation aufklären doch zeigen sie, dass die Interaktionen der NECs miteinander sehr viel komplexer aber auch wesentlich flexibler sind als zunächst angenommen.
Paper III: Untersuchung der N-terminalen Domäne von PrV pUL31
Neben einem Kernlokalisationssignal (NLS) beherbergt der N-terminus verschiedener pUL31 Homologer auch zahlreiche vorhergesagte Phosphorylierungsstellen, die an der Regulation des Kernexportes beteiligt sind bzw. sein könnten. Dieser flexible N-terminale Bereich hat in PrV pUL31 eine Länge von 25 Aminosäuren, wobei auffallend viele basische Aminosäuren in Clustern und verschiedene mögliche Phosphorylierungsstellen enthalten sind. Computer-unterstütze Analysen (NLStradamus) erkennen in der Aminosäuresequenz ein bipartites NLS (AS 5-20). Um die Rolle des N-terminalen Bereiches in PrV pUL31 näher zu untersuchen, wurde dieser schrittweise verkürzt und die basischen Aminosäuren, sowie die möglichen Phosphorylierungsstellen, durch gerichtete Mutagenese durch Alanin ersetzt. Getestet wurden diese Mutanten nach Transfektion der entsprechenden Expressionsplasmide in RK13 Zellen auf ihre Lokalisation und, nach Koexpression von pUL34, auf Interaktion und der Umorganisation der Kernmembran. Über stabil-exprimierende Zelllinien und nach Infektion mit der UL31 negativen Virusmutante (PrV-∆UL31) wurde die Funktionalität in eplikationsassays und auch ultrastrukturell charakterisiert. Erstaunlicherweise zeigte sich, dass weder das bipartite NLS noch die vorhergesagten Phosphorylierungsstellen eine entscheidende Rolle spielen. Vielmehr konnte der größte Teil des N-Terminus ohne sichtbaren Funktionsverlust deletiert werden, sofern mindestens ein Cluster basischer Aminosäuren in dieser Region erhalten blieb. Die Ergebnisse zeigten, dass der basische Charakter dieser Region entscheidend für die korrekte Lokalisation, sowie für die Bildung und Funktionalität des NEC ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung im N-Terminus von PrV pUL31, wie auch die roteinkinase pUS3, zwar nicht essenziell für die Freisetzung der Nukleokapside aus dem perinukleären Spalt sind, jedoch diesen Prozess unterstützen (Paper III).