Doctoral Thesis
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FĂŒr eine intakte Filtration des Blutes sind hochspezialisierte Epithelzellen in den Glomeruli der Nieren, die Podozyten, essentiell. Der Verlust oder die SchĂ€digung dieser postmitotischen Epithelzellen bzw. morphologische VerĂ€nderungen der komplex geformten FortsĂ€tze dieser Zellen sind die hĂ€ufigsten Ursachen fĂŒr den Verlust der FiltrationsfĂ€higkeit der Nieren. Diese besondere 3D-Morphologie der Podozyten hĂ€ngt entscheidend vom Aktinzytoskelett und von Aktin-bindenden Proteinen ab. Aus der Literatur weiĂ man, dass das Aktin-bindende Protein Palladin einen entscheidenden Einfluss auf die Nukleation bzw. Polymerisation von Aktinfilamenten ausĂŒbt und dass Palladin sowohl die Morphologie als auch die Dynamik von Zellen bestimmt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von Palladin hinsichtlich der Podozytenmorphologie und -funktion in vitro und in vivo erstmals untersucht.
Mittels in vitro Experimenten an kultivierten Podozyten der Maus konnte gezeigt werden, dass ein Knockdown von Palladin zu einer deutlichen Abnahme der Aktinfilamente und kleineren Fokalkontakte fĂŒhrt. Interessanterweise hatte dies aber keinen Einfluss auf die AdhĂ€sionfĂ€higkeit der Podozyten, sogar unter mechanischer BeanÂŹspruchung. Ferner konnte gezeigt werden, dass Palladin einen entscheidenden Einfluss auf die Expression anderer essentieller Aktin-assoziierter Proteine, wie Synaptopodin und α-Aktinin-4, aufweist.
Dass Palladin eine wichtige Rolle bei der Bildung und StabilitÀt von Aktinfilamenten spielt, konnte durch die Inkubation von kultivierten Palladin Knockdown-Podozyten mit verschiedenen Inhibitoren der Aktin-Polymerisation gezeigt werden. Die quantitative Auswertung mit Hilfe der Software F_Seg zeigte, dass Palladin Knockdown-Podozyten nach der Inkubation deutlich weniger Aktinfilamente und mehr Aktin-Cluster im Vergleich zu den Kontrollen aufweisen. Der Einsatz eines Migrations-Assays zeigte zudem, dass kultivierte Palladin Knockdown-Podozyten schneller migrieren und vermehrt dynamische Strukturen wie Lamellipodien und sogenannte Ring-Like-Structures (RiLiS) ausbilden.
Um den Einfluss von Palladin auf Podozyten in vivo zu untersuchen, wurden MĂ€use generiert, bei denen Palladin spezifisch in den Podozyten ausgeknockt ist. Analysen der Glomeruli-Morphologie dieser Tiere mit Hilfe der Immunfluoreszenz-, Superresolution- und Elektronenmikroskopie (Raster- und Transmissionsmikros-kopie) zeigten eindeutig, dass die glomerulĂ€ren Kapillaren stark erweitert waren und sich ein stark vergröĂerter sub-podozytĂ€rer Raum ausgebildet hatte. Ferner waren die fĂŒr die Filtration des Blutes maĂgeblichen FortsĂ€tze der Podozyten stark verbreitert und die Expression des essentiellen Schlitzmembranproteins Nephrin nach dem Knockout von Palladin signifikant reduziert.
Durch den Einsatz eines nephrotoxischen Serums wurde eine Glomerulonephritis induziert, die bei Podozyten-spezifischen Palladin-Knockout MĂ€usen zu einer stĂ€rkeren SchĂ€digung der Glomeruli im Vergleich zu den Kontrolltieren fĂŒhrte. Dies deutet auf eine essentielle Rolle von Palladin fĂŒr die Morphologie und Funktion der Filtrationsbarriere hin.
Des Weiteren konnte anhand von Nierenbiopsien nachgewiesen werden, dass die Palladin-Expression bei Patienten, die an einer fokal segmentalen Glomerulosklerose bzw. an der diabetischen Nephropathie erkrankt waren, im Vergleich zu den Kontrollnieren deutlich verringert ist.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass Palladin sowohl in vitro als auch in vivo einen entscheidenden Einfluss auf das Aktin-zytoskelett der Podozyten und somit auf die Funktion dieser hochspezialisierten Epithelzelle hat.
Die Podozyten bilden mit ihren Aktin-reichen, interdigitierenden FuĂfortsĂ€tzen und mit Schlitzmembran die entscheidende Einheit der glomerulĂ€ren Filtrationsbarriere. Verschiedene Störungen der Podozytenfunktion bewirken chronische Nierenerkrankungen, darunter die fokal segmentale Glomerulosklerose. MĂ€use, die keine Expression des 80 kDa-Proteins CD2AP in den Podozyten aufweisen, entwickeln auf noch ungeklĂ€rte Weise eine progrediente und in nur sechs Wochen post partum letal endende Niereninsuffizienz mit Proteinurie. Histopathomorphologisch lĂ€sst sich ein Verlust der Podozyten-FuĂfortsĂ€tze sowie eine Glomerulosklerose nachweisen. Auch beim Menschen sind Mutationen von CD2AP mit einer Glomerulosklerose assoziiert. CD2AP ist ein Docking-Protein der CMS/CIN85-Familie. Mit seinen drei SH3-DomĂ€nen, seiner Prolin-reichen Region und weiteren Bindungsstellen ist CD2AP in der Lage, mit einer Vielzahl von Proteinen zu interagieren. Eine Gruppe der Interaktionspartner von CD2AP bilden F-Aktin und Aktin-assoziierte Proteine. Da wir in vorangehenden Arbeiten zeigen konnten, dass CD2AP in kultivierten Podozyten an hochdynamischen F-Aktin-Spots lokalisiert ist (Welsch et al. 2001; Welsch et al. 2005), war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, zu klĂ€ren, ob CD2AP an der Regulation der Aktin-Dynamik in den Podozyten beteiligt ist. Zu diesem Zweck wurde das Aktin-Zytoskelett von kultivierten Podozyten aus CD2AP-Knockout-MĂ€usen im Vergleich zu kultivierten Wildtyp-Podozyten untersucht. Es zeigte sich, dass CD2AP-/--Podozyten deutliche phenotypische VerĂ€nderungen im F-Aktin-Zytoskelett gegenĂŒber Wildtyp-Podozyten aufweisen. So besitzen CD2AP-/--Podozyten eine polygonale Zellmorphologie aufgrund fast fehlender Lamellipodia sowie vermehrt F-Aktin-Spots, F-Aktin-Stress-Fasern und damit auch gröĂere FokaladhĂ€sionen. Neben den zunĂ€chst beobachteten strukturellen VerĂ€nderungen des Aktin-Zytoskeletts fanden sich auch deutliche VerĂ€nderungen in der Aktin-Dynamik. So erfolgt der Abbau des Aktin-Zytoskeletts in CD2AP-/--Podozyten nach der Inhibierung der Plus-Enden der Aktin-Filamente mit Cytochalasin D verlangsamt und inkomplett. Ein morphologisch nicht unterscheidbarer inkompletter Abbau des Aktin-Zytoskeletts konnte durch Inhibierung der Aktomyosin-ATPase-AktivitĂ€t mittels Blebbistatin in den Wildtyp-Zellen erzeugt werden, was auf eine mögliche Interaktion zwischen CD2AP und Myosin II hinweist. Unter Verwendung der FRAP-Technik konnte in GFP-Aktin-transfizierten CD2AP-/-- und Wildtyp-Podozyten der Umsatz von Aktin bestimmt werden. Hierbei zeigte sich, dass CD2AP-/-- und Wildtyp-Podozyten keine unterschiedlichen Aktin-Umsatzgeschwindigkeiten besitzen. Durch Stimulation mit Epidermal Growth Factor können in den Podozyten ringförmige hochdynamische Aktin-Strukturen, sogenannte RiLiS (Ring-Like Structures), hervorgerufen werden. In CD2AP-/--Podozyten war die Bildung und die MotilitĂ€t von RiLiS erheblich vermindert. Durch Transfektion der CD2AP-/--Podozyten mit GFP-CD2AP konnte die Bildung und MotilitĂ€t der RiLiS wiederhergestellt werden. Die Hemmung der Aktomyosin-ATPase mit Blebbistatin sowie die Hemmung der PI3-Kinase mit Wortmannin oder LY294002 blockierten die Bildung von RiLiS, wobei nur die Hemmung der PI3-Kinase mit einer MotilitĂ€tsverminderung einherging. Messungen der Phosphorylierung von AKT und ERK nach Stimulation mit EGF zeigten jedoch eine unverminderte Aktivierung der beiden Signalwege in CD2AP-/--Podozyten. Auch eine verminderte Bildung von PIP3 in den RiLiS konnte durch FluoreszenzintensitĂ€tsmessungen mit PIP3-bindenden GFP-PH-Fusionsproteinen ausgeschlossen werden. Die C-terminale HĂ€lfte von CD2AP enthĂ€lt eine putative F-Aktin-Bindungsstelle und Bindungsstellen fĂŒr Aktin-assoziierte Proteine. Die Expression eines GFP-Fusionsproteins der C-terminalen HĂ€lfte von CD2AP (GFP-?N-CD2AP, AS 325-637) war ausreichend, um eine Lokalisation des Konstrukts in den RiLiS zu erreichen, wĂ€hrend ein GFP-Fusionsprotein der N-terminalen HĂ€lfte von CD2AP keine Anreicherung in den RiLiS zeigte. GFP-DN-CD2AP war ebenfalls in der Lage die Bildung und MotilitĂ€t von RiLiS in den CD2AP-/--Podozyten wiederherzustellen. Die schrittweise VerkĂŒrzung des GFP-DN-CD2AP-Konstrukts am C-terminalen-Ende zeigte, dass die Prolin-reiche Region von CD2AP (AS 325-424) zusammen mit dem Bereich zwischen den AminosĂ€uren 424-505 fĂŒr die Bildung und MotilitĂ€t der RiLiS essenziell ist. Das Konstrukt, das nur noch die Prolin-reiche Region von CD2AP enthielt, verminderte die Bildung und MotilitĂ€t der RiLiS im Sinne eines dominant-negativen Effektes. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit erstmals, dass CD2AP in den Podozyten bei der Regulation der Aktin-Dynamik eine nicht-redundante Funktion besitzt. Der Bereich von CD2AP, der die Bindungsstellen fĂŒr F-Aktin und Aktin-assoziierte Proteine enthĂ€lt, spielt fĂŒr die AusĂŒbung dieser Funktion eine entscheidende Rolle
