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Der Transport von Substanzen innerhalb eines Organismus stellt eine wesentliche Vorausset-zung zur Aufrechterhaltung von Stoffwechselprozessen dar. Neben endogenen Stoffen unter-liegen auch die meisten exogenen Substanzen zahlreichen Transportvorgängen, darunter auch die meisten Arzneistoffe. Deren Pharmakokinetik wird oft entscheidend von ihrer Affini-tät zu bestimmten Transportproteinen beeinflusst. Von diesen präsentiert neben den ABC-Transportern die Familie der SLC-Transporter das größte Spektrum einzelner Vertreter. Auf-grund ihrer Beteiligung sowohl an physiologischen als auch pharmakokinetischen Prozessen erweisen sich darunter die OATPs als besonders interessant. Obwohl deren Bedeutung am Stofftransport durch umfassende Charakterisierung ihrer Expression und Funktion unbestrit-ten ist, erweist sich ihr zugrundeliegender Transportmechanismus noch immer als nicht voll-ständig verstanden. Jedoch bieten Untersuchungen an verwandten Transportern, wie der bak-teriellen Lactose-Permease, Erkenntnisse, die sich möglicherweise auch auf die OATPs über-tragen lassen. Für diese wurde ein Rocker-switch-Mechanismus vorausgesagt, bei dem die Bindung des Substrats zu einer Konformationsänderung führt. Hierdurch wird das Substrat entlang einer zentralen Pore durch das Transportprotein befördert. Eine Möglichkeit derartige Konformationsänderungen, die mit einer Verschiebung der Abstände innerhalb des Moleküls einhergehen, zu untersuchen, stellt der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) dar. Dieser beschreibt die strahlungslose Energieübertragung zwischen zwei Chromophoren, deren Effizi-enz mit dem Abstand der Chromophore zu- bzw. abnimmt. Erstes Ziel dieser Arbeit war es OATP2B1, als einen Vertreter der OATPs, so zu modifizieren, dass er für die Untersuchung mittels FRET zugänglich werden würde. Dies erfolgte durch die Herstellung von OATP2B1-Fusionsproteinen, bei denen der Transporter mit den FRET-geeig-neten Fluorophoren ECFP/EYFP bzw. ECFP/FlAsH ausgestattet wurde. Die Integration des ECFP erfolgte dabei jeweils am C-Terminus, während EYFP und FlAsH jeweils in die intrazellulären Schleifen des Proteins eingebracht wurden. Im Weiteren galt es, diese Fusionsproteine hin-sichtlich ihrer Funktion (Transport radioaktiv-markierter Substrate) und Lokalisation in der Zelle (Mikroskopie) zu charakterisieren. Hierbei wurde gezeigt, dass lediglich die Modifikation mit FlAsH in der dritten intrazellulären Schleife zu keiner Funktionsbeeinflussung führte und dieses Fusionsprotein auch als einziges eine membranäre Lokalisation aufwies. Der Schwerpunkt lag jedoch auf der Messung der FRET-Effizienzen der Fusionsproteine mithilfe konfoka-ler Laser-Scanning-Mikroskopie. Dabei konnte zunächst bei allen Fusionsproteinen ein FRET-Signal erfasst werden, das in Abhängigkeit der Position des FRET-Partners in der intrazellulä-ren Schleife eine unterschiedliche Effizienz aufwies. Die FRET-basierte Berechnung der Ab-stände innerhalb des Moleküls brachte Ergebnisse hervor, die vergleichbar mit denen waren, die anhand von Kristallstrukturanalysen verwandter Transporter erhoben wurden. Teilweise Übereinstimmungen ergaben sich daneben auch beim Vergleich der berechneten Abstände mit denen computergestützter Modelle. Die Ergebnisse zeigen damit das Potenzial dieser Me-thode, die Struktur des OATP2B1 aufzuklären. Außerdem stützen sie zum Teil die prognosti-zierte Strukturverwandtschaft der OATPs zu der strukturell besser charakterisierten Lactose-Permease. Letztes Ziel war es zu untersuchen, ob sich die gemessenen FRET-Effizienzen durch Zugabe des OATP2B1-Substrats E1S beeinflussen ließen. Es konnte für fast alle Fusionsproteine eine Beeinflussung festgestellt werden, wobei die FRET-Effizienzen in Abhängigkeit von der Position des FRET-Partners sowohl ab- als auch zunahmen. Daneben zeigte auch die Zugabe des OATP2B1-Inhibitors Rifampicin eine verschieden ausgeprägte Beeinflussung. Die Zugabe des Nicht-OATP2B1-Substrats 17β-Estradiol-3-glucuronid führte zu keiner Beeinflussung. Die Ergebnisse zeigen damit eine substanzspezifische Beeinflussung des Fusionsproteins. Die be-rechneten Änderungen des Abstandes waren vergleichbar mit den aus Kristallstrukturanaly-sen gewonnenen Abständen der Lactose-Permease. Es konnten hierdurch erste Hinweise ge-liefert werden, dass der dem OATP2B1 zugrundeliegende Transportmechanismus einem ähn-lichen Prinzip folgt, wie es für den Rocker-Switch beschrieben wurde. Die Bindung und der Transport des Substrats an das OATP2B1 führen zu einer Abstandsänderung innerhalb des Moleküls, die sich am ehesten über eine Konformationsänderung erklären ließe. Diese Arbeit kann insgesamt erste Grundlagen zur weiteren Charakterisierung der Struktur und des Transportmechanismus der OATPs liefern. Sie zeigt, dass die Herstellung eines funk-tionsfähigen FRET-Fusionsproteins möglich ist und dass deren Untersuchung nachvollziehbare Ergebnisse liefern kann. Außerdem bietet sie einen Ansatz, FRET-basierte Screening-Verfah-ren für Transportersubstrate zu etablieren. Inwieweit diese praktisch umzusetzen sind, muss jedoch durch aufbauende Arbeiten geklärt werden.

MRP4 (multi drug resistance protein 4) ist ein Transporter aus der ATP-binding-cassette Familie (ABCC4) und verfügt über ein sehr breites Substratspektrum. Dieses beinhaltet Xenobiotika u.a. Cephalosporine, Diuretika und Zytostatika sowie endogene Substanzen wie Gallensäuren, Steroide, Eicosanoide und auch Nukleotide, wie den second messenger zyklisches AMP (cAMP). MRP4 wird in einer Vielzahl von Geweben exprimiert u.a. in der Niere, in der Leber, im Gehirn, in Blutzellen und in vaskulären glatten Muskelzellen. Über die Regulation von MRP4 ist weniger bekannt, daher war es das Ziel dieser Arbeit die transkriptionelle Regulation von MRP4 näher zu betrachten. Zur Bearbeitung dieser Zielstellung wurde die Promoter-Region des ABCC4/MRP4-Gens in ein Luciferase-Reporter-System kloniert. Anschließend wurde in Zellversuchen mit HeLa und HepG2-Zellen der Einfluss verschiedener Substanzen auf die Transkription von MRP4 untersucht. Zusätzlich wurde mittels Western Blot und quantitativer RealTime-PCR die Expression von MRP4 auf Protein- und mRNA-Ebene betrachtet. Keine bzw. nur geringe Effekte auf die Promoteraktivität wurden in den erwähnten Zelllinien u.a. nach Behandlung mit Glucocorticoiden, Zytokinen, cGMP, Nrf2-/AhR-Aktivatoren und unter dem Einfluss verschiedener Glucose-Konzentrationen beobachtet. Dagegen zeigte sich ein signifikanter Einfluss des zellulären cAMP-Spiegels. MRP4 vermittelt physiologisch einen Auswärtstransport von cAMP. Bei Inkubation mit dem membranpermeablen cAMP-Analogon Dibutyryl-cAMP zeigte sich eine signifikante Steigerung der Promoter-Aktivität von MRP4. Auch auf mRNA- und Protein-Ebene konnte eine signifikante Steigerung der Expression nach Behandlung mit cAMP detektiert werden. Durch Ko-Inkubation mit Inhibitoren der Proteinkinase A (PKA) und der Extracellular signal-regulated kinases 1/2 (Erk1/2) konnte weiterhin gezeigt werden, dass dieser Effekt nicht über die PKA, dem häufigsten Effektor von cAMP, sondern über Erk1/2 vermittelt wird. Die Induktion von MRP4 durch cAMP, welches selbst Substrat des Transporters ist, könnte eine Art Feedback-Mechanismus darstellen und darauf hinweisen, dass MRP4 eine größere Rolle im zellulären cAMP-Stoffwechsel zukommt, als bisher angenommen. Der zelluläre Export stellt neben dem Abbau von cAMP durch Phosphodiesterasen einen alternativen Mechanismus der Signalregulation dar, der entweder nur als Ventilmechanismus bei hohen cAMP-Spiegeln oder Zelltyp- und Kompartiment-abhängig möglicherweise auch als hauptsächlicher Eliminationsweg dient. MRP4 könnte somit neben der Inhibition der Phosphodiesterasen einen weiteren Angriffspunkt zur Erhöhung zellulärer cAMP-Spiegel z.B. im Rahmen der Therapie von Erkrankungen wie der pulmonalen Hypertonie darstellen.

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Etablierung von Methoden zur absoluten und relativen Proteinquantifizierung. In darauf aufbauenden Studien sollten diese Methoden für die Untersuchung physiologisch relevanter Fragestellungen in Bakterien genutzt werden. Zum tieferen Verständnis der Bakterienphysiologie ist es unabdingbar, Mengenänderungen von Proteinen hochaufgelöst darstellen zu können. Relative Proteinquantifizierung erlaubt dabei die Untersuchung von Änderungen der Menge eines Proteins zwischen verschiedenen Proben eines Experiments. Im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit wurden 2D PAGE und gelfreie massenspektrometrische Methoden in einer Studie (Tefon et al. 2011, Artikel I) angewendet, um Oberflächen- und Immunoproteine zweier Vakzinationsstämme des humanpathogenen Bakteriums Bordetella pertussis zu charakterisieren. Die relative Proteinquantifizierung erlaubt zwar Rückschlüsse auf die Mengenänderung eines Proteins zwischen verschiedenen Bedingungen, ermöglicht aber nur bedingt Aussagen über die absolute Menge der Proteine. Gerade absolute Proteinmengen und damit Proteinkonzentrationen sind jedoch Grundvoraussetzung für ein zielorientiertes Verwenden der gewonnenen Daten nicht nur im Kontext der Systembiologie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, in der durch Kombination zweier etablierter Proteomik-Methoden die absolute Quantifizierung für einen großen Teil der cytosolischen Proteine eines Organismus ermöglicht wird. In dieser Methode werden ausgewählte Proteine, deren genaue Konzentration durch gerichtete Massenspektrometrie bestimmt wurde, für die Kalibration von hoch auflösenden 2D Gelen genutzt (Maass et al. 2011, Artikel II). Um das Potential dieses Verfahrens zu verdeutlichen, wurde es für die Analyse der Anpassung von Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus an Glukosehunger angewendet. Dabei konnten für 467 Proteine von B. subtilis in drei Zeitpunkten Proteinkonzentrationen bestimmt werden. Für die Etablierung der Methoden waren verschiedene Vorarbeiten nötig: I) Selektion geeigneter Kalibrationsproteine, II) Selektion geeigneter Standardpeptide und Optimierung der massenspektrometrischen Parameter zu deren absoluten Quantifizierung, III) Selektion eines geeigneten, proteinunspezifischen und hoch sensitiven Gelfarbstoffes, IV) Testung verschiedener Zellaufschlussmethoden und Etablierung einer Methode zur Bestimmung der Zellaufschlusseffizienz, V) Testung verschiedener Proteinbestimmungsmethoden zur genauen Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration im komplexen cytosolischen Extrakt und VI) Optimierung der vollständigen enzymatischen Spaltung aller Proteine vor der massenspektrometrischen Analyse. Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass sich die Kalibration der 2D Gele für die Ermittlung absoluter Daten zwischen Gelen übertragen lässt, was den Aufwand für große Zeitreihenexperimente deutlich reduziert. Die Genauigkeit und der dynamische Bereich 2D-gelbasierter relativer und absoluter Proteinquantifizierung kann durch eine erhöhte Reproduzierbarkeit, Auflösung und Sensitivität der Gele verbessert werden. Die Etablierung von HPE-Gelen führte zu 25 % mehr detektierbaren und damit quantifizierbaren Proteinspots und Proteinen bei deutlich erhöhter Reproduzierbarkeit (Moche et al. 2013, Artikel III). Die zusätzlich höhere Anzahl von Gelen mit quantifizierbarer Qualität verringert außerdem den Zeit- und Kostenaufwand vor allem für komplexe experimentelle Ansätze. Die neue Methode zur gelbasierten absoluten Proteinquantifizierung wurde in einer Folgestudie angewendet, um die Konzentrationen von mehr als 700 Proteinen von B. subtilis während der physiologisch relevanten Anpassung an verschiedene Stressbedingungen, nämlich Glukosehunger und Hitzestress, zu bestimmen (Maaß et al. 2014, Artikel IV). Der Vergleich der beiden Stressbedingungen ermöglicht eine Unterscheidung der generellen von der spezifischen Stressantwort, wobei die Analyse der Daten durch Berechnung der Proteinkosten und der Ressourcenverteilung auf verschiedene metabolische Pfade und regulatorische Einheiten unterstützt wurde. Da die Nutzung von 2D PAGE zur Proteinquantifizierung auf im Gel detektierbare Proteine beschränkt ist, ist es für eine höhere Proteomabdeckung sinnvoll, gelbasierte Methoden mit gelfreien Methoden zu ergänzen. Deshalb wurde eine Methode zur labelfreien MS-basierten absoluten Quantifizierung von Proteinen im großen Maßstab entwickelt und etabliert. In dieser gel- und labelfreien Quantifizierungstechnik wurde datenunabhängige, parallele Fragmentierung aller zeitgleich eluierenden Vorläufermoleküle (LC-MSE) genutzt. Auch für diese Methode der absoluten Proteinquantifizierung bildeten die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Probenaufbereitungsverfahren die Grundlage (Muntel et al. 2014, Artikel V).

In der vorliegenden Arbeit wurden Liquorproben von Patienten mit neurologischen Erkrankungen auf ihre Proteinzusammensetzung hin untersucht und die Proteine quantitativ analysiert. Es wurde versucht, Proteine zu identifizieren, die als Krankheits-Marker dienen könnten.Untersucht wurden zwei immunvermittelte neurologische Erkrankungen, die Multiple Sklerose (MS), sowie das Guillain-Barré-Synrom (GBS). Die Liquorproteine von MS- und GBS-Patienten wurden mit Hilfe der 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt und die Proteine quantitativ analysiert. Nach der Quantifizierung konnten 15 Proteine identifiziert werden, die erhöht auftraten und 11 Proteine die vermindert im MS-Liquor auftraten. Im Liquor von den GBS-Patienten konnten 4 Proteine erhöht und 7 Proteine vermindert detektiert werden. Im MS Liquor handelt es sich bei den erhöhten Proteine um Komplement Faktor B, Beta-2-Glykoprotein, Protaglandin-H2-Isomerase und Cystatin C und bei den verminderten Proteine um Antithrombin III, Protaglandin-H2-Isomerase und Transthyretin. Im GBS Liquor konnten verstärkt Haptoglobin und Coeruloplasmin identifiziert werden und vermindert Serotransferrin, Protaglandin-H2-Isomerase, Cystatin C und Transthyretin.

Das Ziel dieser Arbeit war die qualitative und quantitative Analyse der Zusammensetzung von Partikeln des Pseudorabies Virus (PrV), des Erregers der Aujeszky’schen Krankheit beim Schwein. In Partikeln des PrV-Virusstammes Kaplan wurden nach ein- oder zweidimensionaler Elektrophorese und Identifizierung durch peptide mass fingerprint 27 Strukturproteine viraler und vier Strukturproteine zellulärer Herkunft (Annexin I und -II, HSP70 und Aktin) identifiziert. Die viralen Strukturproteine pUL37, pUL48, pUL18, pUL19, pUL29 (gB) und alle Strukturproteine zellulärer Herkunft wurden nach zweidimensionaler Elektrophorese in mehreren Isoformen nachgewiesen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Zusammensetzung von Deletionsmutanten des PrV mit derjenigen von Wildtyp-Virionen verglichen. Ziel war hier die Analyse von Veränderungen in der Partikelzusammensetzung über den Verlust des deletierten Proteins hinaus, z.B. als Folge einer dadurch nicht mehr möglichen Protein-Protein-Wechselwirkung oder einer abweichenden Morphogenese. Im Vordergrund stand dabei die Untersuchung der Tegumentproteine, da diese in eine Vielzahl von Protein-Protein-Interaktionen einbezogen sind und ihnen eine entscheidende Rolle während der Virusmorphogenese zukommt. Die quantitative Analyse von Mutanten mit Deletionen der Tegumentproteine pUS3, pUL11, pUL13, pUL16, pUL21, pUL35, pUL41, pUL43, pUL47, pUL49, pUL51, sowie der Deletion eines C-terminalen Fragments des UL36-Gens und des Glykoproteins E erfolgte massenspektrometrisch mit der SILAC Strategie. Nach Untersuchung der Strukturproteinprofile von allen oben genannten Deletionsmutanten lässt sich über die genannten Details hinaus generell folgendes feststellen: (1) Kapsid- beziehungsweise kapsid-assoziierte Proteine (pUL18, pUL25, pUL35 und pUL38) werden in stöchiometrischen Mengen zum Hauptkapsidprotein MCP142 (pUL19) in die Viruspartikel eingebaut. Diese Stöchiometrie war robust gegen alle untersuchten Deletionen. (2) Größere Flexibilität beim Einbau in das reife Virion zeigten Komponenten des Teguments. Kapsidnahe Tegumentproteine wie das pUL36 wurden meist stöchiometisch eingebaut. Größere Schwankungen beim Einbau in die verschiedenen untersuchten Deletionsmutanten zeigten die Tegumentproteine pUL11, pUL16, pUL21, pUL46, pUL48, pUL49 und pUS3. Deletionen in einzelnen Tegumentproteinen führten zu vermindertem Einbau anderer Proteine, was z.B. durch den Ausfall von Protein-Protein Wechselwirkungen erklärt werden kann, oder auf einen vermehrten Einbau anderer Tegumentproteine hindeutet. (3) Virale Hüllglykoproteine zeigten die größten quantitativen Schwankungen im Einbau, was die Bewertung des Einbaus der Glykoproteine in die verschiedenen Deletionsmutanten erschwerte. Ausnahme war hier das essentielle Glykoprotein gH, dessen Einbau in die untersuchten Deletionsmutanten im Vergleich zum Wildtyp durchgängig unverändert war.