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Die in dieser Arbeit durchgeführten Kristallstrukturanalysen der ersten bakteriellen Chalconisomerase (CHI) bilden die Grundlage für das strukturelle Verständnis der Flavonoiddegradation von Eubacterium ramulus. Das Enzym zeigt eine offene und eine geschlossene Lid-Konformation, die das aktive Zentrum vollständig vom Solvens abgrenzt. Durch SAXS-Messungen konnte gezeigt werden, dass sich diese beiden Konformationen im Solvens in einem dynamischen Gleichgewicht befinden und nur eine geringe Energiebarriere zur Schließung überwunden werden muss. Die Lokalisation des aktiven Zentrums konnte durch Cokristallisation mit dem Substrat (2S)-Naringenin bewiesen werden. Der Reaktionsmechanismus konnte durch Mutagenese-Studien und spezifischen 1H/2H-Austausch durch NMR bewiesen werden. Trotz jeglicher fehlender funktionaler Verwandtschaft zeigt die Tertiärstruktur der bakteriellen CHI große Ähnlichkeiten zu der ferredoxin-like Faltung der Chloritdismutase aus Dechloromonas aromatica und dem mit Stress verbundenen Protein SP1 aus Populus tremula. Ein Vergleich der bakteriellen CHI mit der pflanzlichen CHI von Medicago sativa zeigt, dass deren 3D-Struktur in keinem verwandtschaftlichen Verhältnis steht. Dies suggeriert eine konvergente Evolution der beiden Chalconisomerasen ausgehend von unterschiedlichen Vorläuferproteinen. Anhand von Strukturaufklärungen der (R)-selektiven Amin-Transaminase aus Aspergillus fumigatus konnten erste Informationen über die strukturellen Voraussetzungen zur (R)-Selektivität dieser neuen Enzymklasse gewonnen werden. Die in silico Experimente zeigen, dass ähnlich zu den BCATs und D-ATAs das aktive Zentrum der (R)-ATA in eine große und eine kleine Bindetasche unterteilt ist. Dies konnte strukturell über den Inhibitorkomplex verifiziert werden. Die De-/Protonierung des Substrates durch das katalytische aktive Lys179 kann ausschließlich von der si-Seite erfolgen, sodass es zur Bildung des (R)-Enantiomers kommt. Der Mechanismus zur Bindung polarer Substrate (dual substrate recognition) wurde durch einen kovalenten Inhibitorkomplex und Mutagenese-Studien belegt und ist auf ein konserviertes Arginin im active site loop zurückzuführen.
Es wurden theoretische Untersuchungem zu sieben verschiedenen Isoenzymen der Schweineleberesterase vorgenommen. Vorhersagen zur Struktur wurden moleküldynamisch mit Hilfe eines Kraftfeldprogramms (AMBER-Paket) durchgeführt. Der Reaktionsmechanismus wurde quantenchemisch (CPMD), sowie mit einer Hybridmethode (QM/MM) nachvollzogen. Da keine Kristallstruktur vorhanden ist, wurde auf ein Homologiemodell aus eigenen Vorarbeiten zurückgegriffen. Mit Kraftfeldberechnungen wurden die einzelnen Monomere für etwa 10 bis 14 ns simuliert. Dabei zeigte sich eine Relaxation der Enzyme nach 8 bis 10 ns. In jedem Fall wurden stabile Endstrukturen der Monomere (um die 8000 Atome plus etwa 40000 Wassermoleküle) gefunden. Am Beispiel der PLE3 wurde sogar eine partielle Entfaltung der Eingangshelix beobachtet, die in einer Rückmutation nicht wiederherstellbar war. Andererseits wurde bei der PLE1 die spontane Ausbildung einer 3-10-Helix in der Nähe der Eingangshelix gefunden. Es wurden auch stabile Endstrukturen der Trimere (um die 24000 Atome plus etwa 50000 Wassermoleküle) gefunden. Interaktionen zwischen den Monomeren wurden beobachtet, die nach 14 bis 18 ns stabil zusammenlagen. Es konnten über RMSD-Auswertungen starre und flexible Bereiche innerhalb der Isoenzyme als auch zwischen den einzelnen identifiziert werden. Die starren Bereiche stimmen sehr gut mit dem Faltungsmotiv der a/b-Hydrolasen überein. Spezifische Abstände des aktiven Zentrums wurden während der klassisch simulierten Moleküldynamiken überprüft. Dabei war es nicht möglich, mit dem in der Literatur propagierten katalytischem Glutamat Abstände in der Größenordnung einer Wasserstoff-brücke zu erhalten. Vielmehr wurde eine günstige und stabile Lage eines anderen Glutamats gefunden, wodurch sich aber nichts am allgemeinen Reaktionsmechanismus ändert. Die Zugangswege wurden durch gezwungenes Ziehen der Moleküle aus der Lösung ins aktive Zentrum beobachtet und über Kraft-Weg-Kurven ausgewertet. In Simulationen im Nanosekundenbereich konnte auch freiwilliges Eindringen der Substratmoleküle ins Enzym beobachtet werden, wobei dieser Vorgang von der Größe des Moleküls abhängt. Die bei den unterschiedlichen Simulationen gefundenen Taschen sind für jedes Substrat verschieden, obwohl die beteiligten Aminosäuren die jeweiligen Substratmoleküle fest umschließen. Dieses Anpassen der Taschen an das jeweilige Substrat passt zu dem induced-fit-Modell. Während das spontane Eindringen der Substratmoleküle innerhalb weniger Nanosekunden erfolgte, konnte erst nach einer Simulationszeit von 25 ns ein Verlassen von Methanol aus dem Enzym beobachtet werden. Mit quantenchemischen Berechnungen im Picosekundenbereich, unter Berücksichtigung der neuen Zuordnung des katalytischen Glutamats, konnte der gesamte Reaktionsmechanismus dargestellt werden. Am Beispiel des Methylbutyrats wurden die Bildung des ersten tetraedrischen Intermediats, sowie die anschließenden Abspaltungen des Alkohols und der Säure, mit Hilfe von Constraints dargestellt. Die durch die Mutationen hervorgerufenen strukturellen Veränderungen der Isoenzyme insbesondere der Eingangshelix können für die unterschiedlichen Enantioselektivitätswerte verantwortlich sein. Eine Verantwortlichkeit von Taschen für die verschiedenen Enantioselektivitäten ist aufgrund der gefundenen weichen Struktur um die Substrate mit jeweils unterschiedlich beteiligten Aminosäuren nicht erkennbar.
Zunächst sollte Aktivität der Phenylalanin-Ammonium-Lyase aus Petroselinum crispum (pcPAL) zur nicht-oxidativen Desaminierung des korrespondierenden Alkohols von Phenylalanin, Phenylalaninol generiert werden. Dazu wurden hochdurchsatzfähige Methoden zur Selektion, wie auch zur Durchmusterung von Mutantenbibliotheken etabliert. Es wurde fokussierte, gerichtete Evolution durchgeführt und zwei Mutantenbibliotheken mit Mutationen im Bereich der Bindungsstelle des Substrates erfolglos auf Aktivität durchsucht. Computersimulationen führten zur Annahme, dass Phenylalaninol wahrscheinlich nicht ausreichend im aktiven Zentrum gebunden werden konnte. Aus diesem Grund wurde eine zusätzliche Wasserstoffbrücke durch Verwendung von Tyrosinol als Substrat und der pcPAL-Phe-137-His Mutante eingeführt, welche nach Computersimulationen in der Lage war das Substrat ausreichend zu stabilisieren. Tatsächlich konnte durch die Einführung einer zweiten Wasserstoffbrücke durch rationales Proteindesign erstmals Aktivität gegenüber einem Aminoalkohol generiert werden. Durch Verwendung der Tyrosin-Ammonium-Lyase aus Rhodobacter sphaeroides (rsTAL), dessen Wildtyp bereits ein Histidin an der korrespondierenden Position 137 (His-89 der rsTAL) besitzt, konnte vergleichbare Aktivität gegenüber Tyrosinol erreicht werden. Durch die Analyse der Substratbindung im aktiven Zentrum wurde ein neues Konzept für den Reaktionsmechanismus der aromatischen Aminosäure-Ammonium-Lyasen, basierend auf der Aminosäureposition 484 (pcPAL) entwickelt. Sequenz- und Strukturvergleiche zeigten eine substratabhängige Konservierung der Position 484 (pcPAL). Enzyme mit einer Präferenz für Phenylalanin besaßen stets ein Glutamat, Tyrosin umsetzende Enzyme stets ein Asparagin an der entsprechenden Position. In silico Mutagenesen und Computersimulationen zeigten, dass ein Glutamat an der Position 484 (pcPAL) die Aminogruppe des Substrates bindet, wodurch die prosthetische, elektrophile MIO-Gruppe nur den aromatischen Ring in einer Friedel-Crafts ähnlichen Reaktion angreifen kann. Befand sich ein Asparagin an Position 484 (pcPAL) konnte die MIO Gruppe die Aminogruppe des Substrates erreichen und die nicht-oxidative Desaminierung über den E1cB Mechanismus mit einem MIO-Amino-Addukt durchführen. Somit wurde postuliert, dass die Ammonium-Lyasen und -Mutasen aromatischer Aminosäuren in Abhängigkeit der Aminosäure an Position 484 (pcPAL) entweder den Friedel-Crafts-Mechanismus (mit Glu-484) oder den E1cB Mechanismus (mit Asn-484) katalysieren können. Durch die Verwendung von m-Tyrosin als „Mechanismusindikator“ und Verwendung der Glu-484-Asn-Mutante der pcPAL konnten experimentelle Hinweise erbracht werden, die die Annahmen aus der Computersimulationen unterstützten. Als Grund für die unkonventionelle, bisher einzigartige „mechanistische Promiskuität“ wurde ein unterschiedliches Konzept der Substratstabilisierung in PAL und TAL vermutet. Tyrosin wird durch Wasserstoffbrücken der p-Hydroxylgruppe und der Carboxylgruppe im aktiven Zentrum gebunden, während Phenylalanin keine Möglichkeit bietet, den Phenylring eindeutig zu orientieren. Daher ist ein Glutamat an der Position 484 zur Substratbindung notwendig. Neben der pcPAL wurde die rsTAL zur Desaminierung von Tyrosinol getestet und zeigte ebenfalls pcPAL-ähnliche Aktivitäten. Versuche, durch fokussierte, gerichtete Evolution und rationales Proteindesign aller Aminosäuren der Carboxyl- und Aminobindetasche, eine aktivere Mutante zur Umsetzung von Tyrosinol zu identifizieren, scheiterten. Computersimulationen wiesen auf ein Wasserstoffbrückennetzwerk hin, dessen Störung sich stets durch verminderte oder zerstörte Aktivität äußerte. Somit musste festgestellt werden, dass in der Carboxyl- und Aminobindetasche keine Mutationen erlaubt sind, die Tyrosinol besser im aktiven Zentrum binden könnten. Daher wurden alternative Substrate untersucht. Tyrosinamid konnte ebenfalls langsam durch die pcPAL-Phe-137-His Mutante und die rsTAL desaminiert werden. Die biotechnologisch bedeutenderen Aminierungsreaktionen wurde gegenüber verschiedenen para-substituierten Zimtsäureanaloga untersucht und mit der korrespondierenden Desaminierungsreaktion verglichen. Die pcPAL setzte Phenylalanin in der natürlichen Desaminierungsreaktion 10-fach schneller um als Zimtsäure aminiert werden konnte. p Nitro-Zimtsäure stellte sich aufgrund der elektronischen Effekte des Substituenten als besonders geeignetes Substrat für die Aminierungsreaktion heraus, welches 9-fach schneller durch die pcPAL aminiert wurde als Zimtsäure. Durch fokussierte, gerichtete Evolution konnten drei Mutanten identifiziert werden, die aufgrund geringerer, sterischer Hinderungen bis zu 1,7-fach gesteigerte Aktivität gegenüber p-Nitro-Zimtsäure zeigten. Verglichen mit der natürlichen Desaminierungsreaktion der pcPAL gegenüber Phenlyalanin, konnte die Phe-137-Val Mutante p Nitro Zimtsäure sogar 1,5-fach schneller aminieren. Somit konnte die Aktivität der Aminierungsreaktion, ausgehend vom pcPAL-Wildtyp gegenüber Zimtsäure, um das 15-fache erhöht werden. Die pcPAL-Phe-137-Val Mutante wies geringere Substratinhibierung sowie höhere Aktivitäten gegenüber einigen Substraten auf. In präparativen Biokatalysen wurde die hohe Aktivität und Enantioselektivität (eep ≥ 97%) der Mutante, besonders in der asymmetrischen Aminierung von p-Nitro-Zimtsäure zu p-Nitro-L-Phenylalanin, erfolgreich auf einen größeren Maßstab übertragen.