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Die postoperative Immundysfunktion ist ein bis heute noch nicht verstandenes Phänomen. Das Mausmodell der postoperativen Immundysfunktion (SID-Modell) leistet hierbei einen Beitrag zur Klärung der zugrunde liegenden Mechanismen. Diese Arbeit charakterisiert das SID-Modell und kombiniert es mit dem klinischen Modell des orthotopen Pankreaskarzinoms. Klinisch sichtbare und immunologisch nachweisbare Prozesse der postoperativen Immundysfunktion, wie sie am Menschen regelhaft beobachtet werden, sind auch im SID-Modell nachweisbar. Die Operation nach dem Modell der SID erzeugt einen postoperativen paralytischen Ileus, der bis zu einer Woche anhält. Begleitend zu dem paralytischen Ileus treten die charakteristischen Darmwandödeme und dilatierten Darmschlingen auf. Weiterhin kommt es zu einer Migration von neutrophilen Granulozyten in die Darmwand. Auch vom Aspekt des Traumas entspricht das Modell der SID einem großen chirurgischen Eingriff, was durch den Nachweis der erhöhten systemischen und lokalen HMGB1-Konzentrationen gezeigt wird. Die komplexen immunologischen Vorgänge im SID-Modell lassen sich anhand ausgewählter Zytokine und Stresshormone nachvollziehen und sind den immunologischen Prozessen nach großen chirurgischen Interventionen am Menschen sehr ähnlich. So führt das Modell der SID an mehreren Stellen zu einem ausgeprägten Eingriff in den Regelkreis der hypothalamo-hypophysär-adrenalen Achse und des Immunsystems. Der perioperative Stress aktiviert die hypothalamo-hypophysär-adrenale Achse, die wiederum durch Glukokortikoide die Konzentration pro-inflammatorischer Zytokine minimiert. Diese begünstigen ihrerseits die Freisetzung von Glukokortikoiden. Dem entgegen fördert das durch ein operatives Trauma freigesetzte HMGB1 die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine aus Immunzellen. Es steht somit nun ein Modell zur Verfügung, das das Phänomen der postoperativen Immundysfunktion der Grundlagenforschung zugänglich macht.
Zusätzlich zur erfolgreichen Charakterisierung zeigt sich ein interessanter klinischer Bezug zum orthotopen Pankreaskarzinom-Modell. Dabei löst das SID-Modell einen erheblichen negativen Einfluss auf das Überleben von Mäusen mit einem Pankreaskarziom aus. Das SID-Modell könnte eine häufig existierende Situation am Menschen, bei denen sich ein Karzinom oder Metastase chirurgisch nicht vollständig resezieren ließ, abbilden und der Entwicklung neuer Strategien, wie etwa einer perioperativen Immunmodulation, dienen.
ZUSAMMENFASSUNG
Fragestellung:
Die intraoperative Gallengangsverletzung bei laparoskopischer Cholecystektomie ist eine folgenschwere Komplikation, welche einen erheblichen Einfluss auf Lebensqualität und Lebenserwartung des betroffenen Patienten hat. Als eine der Hauptursachen wird die ungenügende Darstellung bzw. Fehlinterpretation der extrahepatischen Gallenwegsanatomie angesehen. Ein allgemein akzeptiertes Verfahren zur routinemäßigen intraoperativen Gallengangsdarstellung konnte sich bisher nicht etablieren. Der protektive Effekt einer routinemäßigen IOC wird kontrovers diskutiert und deren Einsatz wegen zahlreicher methodischer Nachteile in weiten Teilen Deutschlands nicht praktiziert. Mit der NIR-FC steht seit 2008 eine neue Untersuchungsmethode zur Verfügung, welche in ersten Studien vielversprechende Ergebnisse erzielen konnte. Bisher existieren noch wenige Daten zum Einsatz dieser Methode in der klinischen Routineversorgung, insbesondere hinsichtlich der Frage einer Vergleichbarkeit zur IOC. Ziel dieser Studie war es daher zu prüfen, wie praktikabel sich die NIR-FC im Rahmen der laparoskopischen Cholecystektomie anwenden lässt, welche Faktoren die Methode beeinflussen und welche Ergebnisse sich im direkten Vergleich zur IOC erzielen lassen.
Patienten und Methoden:
In einer prospektiven, nicht randomisierten, monozentrischen Studie wurde an 184 Patienten während der LC die Cholangiografie per NIR-FC und IOC durchgeführt. Die Darstellung intra- und extrahepatischer Gallenwege, anatomischer Normvarianten, vorhandener Gallengangskonkremente und Gallengangsleckagen wurde per Studienprotokoll erfasst und anschließend unter Berücksichtigung möglicher Einflussfaktoren wie Alter, Geschlecht, Adipositas, Zeitintervall der ICG-Applikation und Indikation zur Cholecystektomie ausgewertet.
Ergebnisse:
Die Durchführung der NIR-FC war in allen Fällen komplikationslos und benötigte signifikant weniger Zeit als die IOC. Die IOC führte in einem Fall zu einer versorgungsplichtigen Gallengangsläsion. Sonstige Leckagen an den Gallengängen oder im Gallenblasenbett waren mit beiden Methoden nicht nachweisbar. Die Darstellung der intrahepatischen Gallengänge gelang nur in Ausnahmefällen per NIR-FC, dagegen zuverlässig in der IOC. Der DC war nach Präparation des Calot-Dreiecks mit beiden Methoden gleich zuverlässig nachweisbar, bei den übrigen Strukturen DHC und DC-DHC-Konfluenz war die IOC überlegen. Beim Zeitintervall zwischen ICG-Applikation und NIR-FC zeigte sich ein Vorteil zugunsten der Gabe am OP-Tag gegenüber der Gabe am Vorabend. Die besten Ergebnisse ließen sich bei Gabe am OP-Tag nach einem Intervall von 30 Minuten erzielen. Der Faktor „Entzündung“ in der Anamnese ging mit schlechteren Ergebnissen der NIR-FC einher. Bei Patienten mit höhergradiger Adipositas (BMI ≥ 40) ließen sich vor Dissektion des Calot-Dreiecks DC und DHC signifikant schlechter nachweisen als bei nicht übergewichtigen Patienten (BMI < 30). Ein weiterer Einflußfaktor war das Geschlecht. Bei den weiblichen Patienten war der DHC vor der Dissektion signifikant häufiger darstellbar als bei den männlichen Patienten. Eine entsprechende Tendenz zeigt sich ebenso für den DC und den DC-DHC-Konfluenz. Anatomische Normvarianten waren ebenso wie Kontrastmittelaussparungen häufiger per IOC nachzuweisen.
Schlussfolgerung:
Die Methode der NIR-FC lässt sich intraoperativ einfach und sicher ohne relevanten Zeitverlust anwenden. Sie ist beliebig oft wiederholbar, ermöglicht die Gallengangsdarstellung ohne Zeitverzögerung und aus verschiedenen Blickwinkeln. Das verwendete Kontrastmedium ist praktisch nebenwirkungsfrei und pharmakologisch inaktiv. Die Identifizierung des DC nach Dissektion des Calot-Dreiecks gelingt mit gleicher Zuverlässigkeit wie bei der IOC, jedoch ohne deren invasive Risiken. Die Limitationen der Technik liegen in der begrenzten Eindringtiefe des NIR-Lichtes, was die Ergebnisse bei ausgeprägter visceraler Adipositas und Entzündungsvorgängen einschränkt. Hinsichtlich der Beurteilung der intrahepatischen Gallengänge, anatomischer Normvarianten und einer Choledocholithiasis ist die Methode technisch bedingt der IOC unterlegen. Die NIR-FC erweist sich jedoch als hilfreiches Instrument zur Identifikation der Gallengänge, insbesondere des DC, noch während der Präparation auch bei anspruchsvollem Situs. Dadurch kann mit größerer Sicherheit der critical view of safety erreicht werden. Die NIR-FC hat somit das Potenzial, bei vergleichsweise geringem Aufwand und Risiko, die Gefahr von Gallengangsverletzungen zu reduzieren. Ein routinemäßiger Einsatz im Rahmen der laparoskopischen Cholecystektomie kann daher empfohlen werden.
Das primäre Ziel dieser Studie war der wissenschaftliche Qualitätsnachweis von Gefäßverschlüssen mit einem 5mm-Klammernahtgerät mit neuartigen D-Form-Klammern.
Die Messung des Berstungsdrücke stellt eine wissenschaftlich etablierte Methode zum Qualitätsnachweis von chirurgischen Verschlüssen und Anastomosen unabhängig von der Methode (Ligatur, Hochenergie-Versiegelung, Clip-Ligatur oder Klammernaht) dar. Hierzu findet sich in der medizinischen Literatur eine Vielzahl an experimentellen Versuchsaufbauten, denen allen ein ausgeprägter Untersucher-abhängiger Bias inhärent ist, da der Druck von einem Untersucher visuell erfasst wurde. Neben diesem Bias wurde bis anhin der Berstungsdruck als komplettes Aufreißen der Verschlußstelle definiert wurde, was nicht auf die chirurgische Praxis anwendbar ist.
Aus diesem Grund haben wir einen experimentellen Aufbau entwickelt, der es erlaubt, den Berstungsdruck vollautomatisch und Untersucher-unabhängig zu erfassen. Zudem wurde der Berstungsdruck nicht als komplettes Bersten der Klammernaht sondern als erstes Auftreten einer interventionspflichtigen Leckage definiert. Die so gemessenen Berstungsdrücke sind somit auf die chirurgische Praxis anwendbar.
Mit diesem in dieser Studie validierten Versuchsaufbau wurde in der Phase 2 die Berstungsdrücke von konventionelle 12mm Klammernahtgeräten mit denen von neu entwickelten 5mm Klammernahtgeräten an bovinen und porcinen Karotiden sowie an porcinen Jugularisvenen verglichen.
In Phase 1 wurden der Versuchsaufbau und die vollautomatische Erfassung des Berstungsdruckes validiert. Nach Durchtrennung von 15 Gefäßsegmenten mit insgesamt 30 Messpunkten wurde der Berstungsdruck sowohl automatisch durch das System wie auch durch 2 unabhängige Versucher visuell ermittelt. Die Analyse statistisch relevante Korrelation zwischen den automatisch ermittelten und den Untersucher-ermittelten Berstungsdrücken.
Da dieses System vollständig Computer-basiert ist, lässt sich ein individueller Untersucher-abhängiger Bias vollständig ausschließen.
In Phase 2 erfolgte die vergleichende Berstungsdruckmessung zwischen einem 5 mm-Klammernahtgerät mit neuartigen D-Form-Klammern und einem herkömmlichen 12mm messendem Klammernahtgerät mit bekannten D-Form-Klammern. Die Messung wurde an je 15 porcinen Karotiden, 15 bovinen Karotiden sowie an 15 porcinen Jugularvenen durchgeführt. Dies ergab insgesamt 90-Messpunkte pro Klammernahtgerät.
Der Vergleich der Ergebnisse der Berstungsdruckmessungen zeigt, dass kein statistisch signifikanter Unterschied der Berstungsdrücke zwischen D-Form- und B-Form-Klammernahtgeräten besteht.
Schließlich konnte in Phase 3 gezeigt werden, dass weder der bestehende intravaskuläre Druck noch eine zusätzliche Spannung einen Einfluss auf die Ergebnisse der Berstungsdruckmessungen haben.
Basierend auf diesen Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass die neuartigen, 5mm D-Form-Klammernahtgeräte eine sichere und effektive Methode zur Gefäßdurchtrennung bieten.
Dadurch tun sich hier große Möglichkeiten zur weiteren Miniaturisierung der Zugänge in der endoskopischen Chirurgie auf.
Insbesondere in minimal-invasiven Thoraxchirurgie, bei der die Operationszugänge in den Intercostalräumen angelegt werden, kann diese Miniaturisierung zu einer weiteren Verminderung des operativen Traumas und der postoperativen Schmerzen führen.
Das Pankreaskarzinom ist die vierthäufigste Krebstodesursache in der Bundesrepublik Deutschland. Bisher stehen zur Therapie eines fortgeschrittenen Tumors nur wenige Optionen zur Verfügung, gleichzeitig gestaltet sich die Früherkennung des Pankreaskarzinoms als schwierig. Aufgrund der geringen 5-Jahres-Überlebensrate von 8 % sind neue Forschungsansätze zur Untersuchung von Ursachen, Präventions- und Therapieoptionen von großem Interesse. Die Forschung in der Zellkultur spiegelt die Abläufe im menschlichen Organismus nur unzureichend wider. Somit ist eine Durchführung von Tierversuchen häufig unvermeidlich. Trotzdem sollte es aus ethischen sowie auch kostentechnischen und bürokratischen Gründen angestrebt werden, die Anzahl der Tierversuche auf ein Minimum zu reduzieren. Als Bindeglied zwischen in vitro und in vivo Forschung kann das Chorioallantoismembran-Modell im bebrüteten Hühnerei als Möglichkeit zum Ersatz von Tierversuchen dienen. Die Chorioallantoismembran ist ein nicht innerviertes Gefäßsystem, welches analog der menschlichen Plazenta der Versorgung des avianen Embryos dient. Der aviane Embryo selbst fällt in der gesamten Bebrütungszeit nicht unter das Tierschutzgesetz.
Im Rahmen der Methodenetablierung erfolgte die Untersuchung verschiedener Trägersubstanzen und Hilfsmittel zur Kultivierung von Pankreaskarzinomzelllinien auf der Chorioallantoismembran. Zudem erfolgte die Untersuchung der Auswirkungen des Stresshormons Isoproteronol auf das Tumorwachstum der Pankreaskarzinomzelllinie Colo357 in Bezug auf Fläche, zentraler Tumorfläche, Volumen und Gefäßwachstum im Sinne einer Neoangiogenese nach einem Scoresystem. Die Auswertung erfolgte mittels Hämatoxylin-Eosin- und immunhistochemischer Färbungen sowie den Programmen Image J, GraphPad Prism und Excel.
Es konnte ein Wachstum der Zelllinien Colo357, BxPC-3, 6606PDA, Panc02 und PANC-1 erzielt werden. In den Versuchsreihen nach Stimulation der Pankreaskarzinomzelllinie Colo357 konnte bei der Beurteilung des Scores zur Betrachtung des Gefäßwachstums ein Unterschied zwischen den mit Katecholaminen behandelten und den unbehandelten Zelllinien ermittelt werden. Dieser war jedoch gerade nicht signifikant mit p=0,0766. Bei der Untersuchung der Tumorfläche zeigte sich lediglich ein geringer Unterschied zwischen den beiden Gruppen, der mit p=0,0900 nicht signifikant war. Hiernach erfolgte die Betrachtung der zentralen Tumorfläche. Hier konnte ein sehr signifikanter Unterschied mit p=0,0056 nachgewiesen werden. Diese Tendenz ließ sich in der Berechnung des Tumorvolumens bestätigen. Es zeigte sich ein hochsignifikant vermehrtes Tumorwachstum in der mit Isoproteronol behandelten Gruppe mit p=0,0001.
Das Chorioallantoismembran-Modell ist zur Anzüchtung von Pankreaskarzinomzelllinien geeignet und ermöglicht als Bindeglied zwischen in vitro und in vivo Forschung die Untersuchung verschiedener Parameter wie Tumorwachstum, Neoangiogenese und die Betrachtung der Auswirkungen von Pharmaka. Exemplarisch konnte der stimulierende Einfluss von Isoproterenol als Hormon chronischen Stresses auf das Tumorwachstum aus murinen Tierversuchen bestätigt werden. Somit kann dieses Modell zur Reduktion von Tierversuchen beitragen und ermöglicht trotzdem Einblicke, welche in der in vitro Forschung nicht zu erzielen sind.
Das fortgeschrittene, metastasierte Pankreaskarzinom stellt allen Fortschritten innerhalb der Onkologie zum Trotz weiterhin eine Diagnose mit infauster Prognose dar, deren palliative Therapiemöglichkeiten ebenfalls nicht zufriedenstellend sind. Seit einigen Jahren besteht die Hoffnung den vierten Aggregatzustand in Form von ‚nicht-thermischem Plasma' (NTP) in der modernen Tumortherapie einzusetzen. Dies beruht auf der Generierung zahlreicher reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies, die in der Balance aus Wachstum und Apoptose von Tumoren eine entscheidende Rolle einnehmen. In Zusammenschau aller im Rahmen dieser Arbeit erhobenen in vitro Ergebnisse und der hierzu einsehbaren Literatur lässt sich eine selektive, anti-tumoröse Wirkung von NTP festhalten, die sich in reduzierter Zellviabilität und -proliferation, sowie effektiver Apoptoseinduktion ohne Bildung von Nekrosen äußert. Diese Effekte werden vorrangig über im Medium gelöste reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies vermittelt, sodass auch zellfreie, NTP-behandelte Flüssigkeit diese Wirkung erzielt. In einem syngenen Mausmodell einer Peritonealkarzinose des Pankreaskarzinoms konnten die antiproliferativen und proapototischen Effekte dieser indirekten NTP-Behandlung nachgestellt werden. Die repetitive intraperitoneale Applikation resultierte in einer signifikanten Reduktion der Tumoren hinsichtlich Anzahl, Größe und Gewicht. Dabei zeigte sich eine beachtliche effektive Eindringtiefe innerhalb der Tumorläsionen. Lokale oder systemische Nebenwirkungen konnten unter der Therapie nicht beobachtet werden, insbesondere wiesen die übrigen aufgearbeiteten intraperitonealen Gewebe keine makro- oder mikroskopisch sichtbaren Veränderungen auf und auch die Blutzusammensetzung zeigte sich unverändert gegenüber der Kontrollgruppe. In dieser Arbeit wurde zudem - nach Kenntnisstand des Autors - erstmals der Einfluss einer indirekten NTP-Behandlung auf das Überleben immunkompetenter, Tumor-tragender Mäuse untersucht und hierbei ein signifikanter Überlebensvorteil demonstriert.
Die präsentierte Arbeit stellt einen wichtigen Schritt in der Entwicklung neuer Therapieoptionen des metastasierten Pankreaskarzinoms dar, als dass die selektive in vitro Wirksamkeit von NTP nun auch in vivo in einem komplexen Organismus wie der immunkompetenten Maus nachgestellt werden konnte. Künftige Arbeiten zu den NTP-Regulationsmöglichkeiten durch Flüssigkeits- und Plasmamodifikationen werden mutmaßlich das vollständige Potential dieses neuartigen Therapieansatzes offenbaren.
Das Pankreaskarzinom weist unter allen Krebsarten eine der niedrigsten Überlebensraten auf. Der einzige kurative Therapieansatz ist die chirurgische Resektion, unterstützt durch chemotherapeutische Regime. In den aktuellen Leitlinien findet sich keine Empfehlung für eine immunmodulatorische Therapie.
Im Rahmen dieser Dissertation sollte die Wirkung des CCR4-Chemokin-Rezeptors auf die Progression des murinen Pankreaskarzinoms untersucht werden.
Es wurden unter Verwendung der Tumorzelllinie 6606PDA in einem murinen orthotopen Pankreaskarzinommodell CCR4-Knockout-Mäuse und Wildtypmäuse verglichen. Der Rezeptor ist in die gezielte Migration von Immunzellen involviert und wurde unter anderem auf Makrophagen beschrieben. Hierzu liegen im Mausmodell keine Erkenntnisse vor. Daher wurden die Tumoren verglichen, um die Rolle der tumorassoziierten Makrophagen zu analysieren.
In der Tumorvolumenmessung mittels 7-Tesla-MRT zeigten die Wildtypmäuse nach 5 Wochen größere Tumoren (442.1 ± 57.86 mm3) im Vergleich zu den CCR4-Knockout-Mäusen (114.0 ± 19.24 mm3, p<0,0001). Nach Induktion orthotoper Pankreaskarzinome zeigten die CCR4-Knockout-Mäuse in der Überlebenskinetik ein längeres medianes Überleben (76 Tage) im Vergleich zu den Wildtypmäusen (33 Tage, p=0,0039). In der histopathologischen Auswertung zeigte sich bei den Pankreaskarzinomen der CCR4-Knockout-Mäuse eine geringere Makrophagendichte (0,14±0,026 %F4/80+Tumorfläche) im Vergleich zu denen der Wildtypmäuse (0,390± 0,060 %F4/80+ Tumorfläche, p=0,0019). In vitro zeigten Makrophagen mit Verlust des CCR4-Chemokin-Rezeptors (6622 ± 839 Makrophagen) im Vergleich zu Wildtyp-Makrophagen (49230 ± 11080 Makrophagen) in modifizierten Boyden-Kammern eine geringere Migration von Makrophagen auf 6606-Tumorzellen hin (p=0,0018).
Im Rahmen dieser Dissertation konnte die Beeinflussung von Makrophagen durch das murine Pankreaskarzinom nachgewiesen werden. Der Verlust des CCR4-Chemokin-Rezeptors führte zu einer verlangsamten Progression des Pankreaskarzinoms, zu einem längeren Überleben der Versuchstiere und zu einer geringeren Makrophagendichte im Tumorgewebe.
Wären diese neuen Erkenntnisse aus dem Mausmodell auf den Menschen übertragbar, so könnten chirurgische und chemotherapeutische Therapien unterstützt und um einen immunmodulatorischen Therapieansatz ergänzt werden. Ein anti-CCR4 Antikörper wurde in aktuellen Studien erfolgreich bei humanen hämato-onkologischen Tumoren angewendet. Zukünftig sollte eine Erforschung des Antikörpers beim Pankreaskarzinom erwogen werden.