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In vitro and in vivo analyses of mono- and mixed-species biofilms formed by microbial pathogens
(2022)
Microbial biofilms can be defined as multicellular clusters of microorganisms embedded in a self-produced extracellular matrix (ECM), which is primarily composed of polymeric biomolecules. Biofilms represent one of the most severe burdens in both industry and healthcare worldwide, causing billions of dollars of treatment costs annually because biofilms are inherently difficult to prevent, treat, and eradicate. In health care settings, patients suffering from cystic fibrosis, or patients with medical implants are highly susceptible to biofilm infections. Once a biofilm is formed, it is almost impossible to quantitatively eradicate it by mechanical, enzymatical, chemical, or antimicrobial treatment. Often the only remaining option to fully eradicate the biofilm is removing of the infected implant or body part. The primary reasons for the inherent resistance of biofilms against all forms of antimicrobial treatment are (I) a reduced metabolic activity of biofilm-embedded cells climaxing in the presence of metabolic inactive persister cells, as well as (II) the protective nature of the biofilm matrix acting as a (diffusion) barrier against antimicrobials and the host immune system. Consequently, there is an urgent need to better understand microbial biofilms from a structural and (patho-) physiological point of view in order to be able to develop new treatment strategies.
Therefore, the aims of this study were to investigate fundamental physiological properties of different clinically relevant single and multi-species biofilms, both in vitro and in vivo. Furthermore, the effectiveness of a novel treatment strategy using cold atmospheric pressure plasma was evaluated in vitro to treat biofilms of the pathogenic fungus C. albicans.
In article I, the intracellular and ECM protein inventory of Staphylococcus aureus during in vitro biofilm growth in a flow reactor was analyzed by liquid-chromatography coupled to tandem mass-spectrometry (LC-MS/MS) analysis combined with metabolic footprint analysis. This analysis showed that anaerobiosis within biofilms releases organic acids lowering the ECM pH. This, in turn, leads to protonation of alkaline proteins – mostly ribosomal proteins originating from cell lysis as well as actively secreted virulence factors – resulting in a positive net charge of these proteins. As a consequence, these proteins accumulate within the ECM and form an electrostatic network with negatively charged cell surfaces, eDNA, and metabolites contributing to the overall biofilm stability.
In article II, the in vivo metaproteome of the multi-species biofilm community in cystic fibrosis sputum was investigated. To this end, an innovative protocol was developed allowing the enrichment of microbial cells, the extraction of proteins from a small amount of cystic fibrosis sputum, and subsequent metaproteome analysis. This protocol also allows 16S sequencing, metabolic footprint analysis, and microscopy of the same sample to complement the metaproteome data. Applying this protocol, we were able to significantly enhance microbial protein coverage providing first insights into important physiological pathways during CF lung infection. A key finding was that the arginine deaminase pathway as well as microbial proteases play a so far underappreciated role in CF pathophysiology.
In articles III and IV, a novel treatment strategy for biofilms formed by the important fungal pathogen Candida albicans was evaluated in vitro. Biofilms were treated with two different sources of nonthermal plasma (with the Nonthermal Plasma Jet “kINPen09” as well as with the Microwave-induced plasma torch “MiniMIP”) and the effect on growth, survival, and viability was assessed by counting colony-forming units (CFU), by cell proliferation assays, as well as by live/dead staining combined with fluorescence microscopy, confocal laser scanning microscopy, (CLSM) and atomic force microscopy (AFM). These tests revealed that biofilms were effectively inactivated mostly on the bottom side of biofilms, indicating a great potential of these two plasma sources to fight biofilms.
The here presented dissertation investigated the molecular mechanisms, by which the food industry model bacteria Pseudomonas fluorescens and Listeria monocytogenes, grown either as planktonic cultures, were inhibited by plasma treated water (PTW) produced by a microwave-induced plasma source (MidiPLexc). As a starting point, optimal operating parameters were determined with 5 standard liters per minutes(slm)compressed air during the treatment of 10 ml deionized water within a treatment time of up to 15 min (pre-treatment time). Treatment times of 1, 3 and 5 min were selected (post-treatment time). In addition to physical parameters, i.e. temperature measurements at different spots at the plasma source during the production of the PTW, the chemical composition of PTW was determined by pH measurements, chronoamperometry (determination of the H2O2 concentration), ion chromatography (determination of the NO2-, NO3- and ONOO- concentrations) and mass spectrometry (qualitative determination of the molecules). In addition, concentration changes of reactive species over a period of 3 h indicated a decrease of the NO2- concentration as well as an increase of the NO3- and ONOO- concentration in the PTW. Microbiological assays, i.e. quantification of colony-forming units (CFU), fluorescence and XTT assays, revealed a significant reduction of the proliferation ability of the cells, membrane damages and metabolic activity have been demonstrated for planktonic cultures as well as mono- and multispecies biofilms. PTW effects on biofilm structures were investigated using microscopic methods such as fluorescence microscopy, confocal laser scanning microscopy (CLSM), atomic force microscopy (AFM), and scanning electron microscopy (SEM), as well as physical methods such as contact angle measurements. Significant changes in the biofilm structure have been shown, which indicate an ablation of the biofilm mass from top to bottom by approximately 2/3 of the biofilm mass and a destruction of the extracellular matrix (ECM) by the reactive species within the PTW. Subsequently, fresh-cut lettuce has been treated with PTW produced by up-scaled plasma sources. Apart from qualitative parameters of the lettuce after PTW treatment such as texture and color, the concentration of PTW reactive species have been determined. These experiments showed that the composition of the reactive species were slightly different from that of the laboratory-scaled plasma source MidiPLexc. Notably, the PTW treatment did not cause significant changes in texture and color of the fresh-cut lettuce. Finally, a synergistic effect of PTW treatment followed by plasma-processed air (PPA) drying was demonstrated application-specific.
Das Speichelperoxidase-System nimmt in der Gruppe der unspezifischen Abwehr eine besondere Stellung ein, indem es das orale Mikrobiom reguliert. Damit ist das Speichelperoxidase-System eine gute Grundlage für die Entwicklung eines sicheren und wirkungsvollen Mundpflegeproduktes. Die erstmals 1943 aus der Kuhmilch isolierte Lactoperoxidase weist in Struktur und Reaktivität eine hohe Ähnlichkeit zur Speichelperoxidase auf. Beide Peroxidasen vermitteln die Oxidation von Thiocyanat (SCNˉ) in das antibakteriell sehr effektive Hypothiocyanit (OSCNˉ), wobei Wasserstoffperoxid (H₂O₂) als Sauerstoffdonator fungiert.
Im Rahmen des Verbundforschungsprojekts „Large Protection of Oral Health“ wurden Mundhygienelutschdragees als Ergänzung zur mechanischen Zahnreinigung entwickelt und getestet.
Zur Untersuchung der Wirksamkeit der entwickelten LPO-Dragees wurde eine randomisierte, doppelt verblindete Studie im 4-fach Cross-over Design angewendet. Alle Probanden benutzten zeitlich versetzt zwei Lutschdragees, die LPO und SCNˉ mit unterschiedlichen H₂O₂ Gehalten (Dragee B: 0,083 % und Dragee C: 0,04 %) enthielten, ein Placebo-Dragee als Negativkontrolle und eine handelsübliche Mundspüllösung (Listerine® Total Care, Johnson & Johnson, Germany) als Positivkontrolle in zufälliger Reihenfolge. Das Placebo und die zwei Lutschdragee-Varianten waren hinsichtlich Aussehen, Geschmack und der Darreichungsform nicht voneinander zu unterscheiden. Zwischen den Anwendungen der verschiedenen Präparate lag eine Wash-out-Phase von jeweils 10 Tagen.
Ziel der Studie war, die Auswirkungen der entwickelten Lutschdragees auf die Plaqueneubildung, S. mutans, Lactobacillen und die Gesamtkeimzahl zu untersuchen. Zusätzlich wurden folgende chemische Parameter ionenchromatographisch bestimmt: Thiocyanat (SCNˉ), Hypothiocyanit (OSCNˉ), Nitrat (NO₃ˉ) und Nitrit (NO₂ˉ).
Beide Prüfdragees führten im Vergleich zum Placebo zu einer statistisch signifikanten Hemmung der Plaqueneubildung, die aber unter der der Positivkontrolle lag. Dragee B hatte eine größere statistisch signifikante Hemmung von S. mutans gegenüber Dragee C und dem Placebo. Bei den Lactobacillen zeigte das Dragee C eine statistisch signifikant bessere Wirkung als die Positivkontrolle, Dragee B und dem Placebo. Sowohl die Test-Dragees als auch beide Kontrollen hatten keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die Gesamtkeimzahl.
Im Speichel war ein erhöhter SCNˉ Gehalt bei der Anwendung der Prüfdragees festzustellen, was vermutlich mit dem SCNˉ Gehalt des Dragees im Zusammenhang steht. Hingegen wurde keine Erhöhung des hochreaktiven OSCNˉ zum Zeitpunkt der Messung am 5. Tag beobachtet. Das Nitrat/Nitrit Verhältnis deutet daraufhin, dass die Anzahl der kardiovaskulär positiv einzustufenden nitratreduzierenden Bakterien durch Dragee B statistisch signifikant höher war als bei der Anwendung von Listerine®.
Insgesamt kann festgestellt werden, dass durch die Anwendung eines Lutschdragees mit den Komponenten des Lactoperoxidase-Systems bezüglich der Hemmung der Plaqueneubildung und der Proliferation von kariogenen Keimen ein Nutzen für den Anwender zu erzielen ist und die gewählte Applikationsform sich gut in Alltag integrieren lässt.
Das Ziel dieser Studie war es, die Wirkung von kaltem Atmosphärendruckplasma und Natriumhypochlorit, allein oder in Kombination, auf einen Enterococcus faecalis Biofilm in Wurzelkanälen von extrahierten Zähnen zu vergleichen. Die antibakterielle Wirksamkeit wurde durch Ermittlung des Logarithmus der koloniebildenden Einheiten pro Milliliter bestimmt (log10CFU/ml). Zusätzlich wurden rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen angefertigt, um den Behandlungseffekt auf den Biofilm zu visualisieren. Die adjuvante Behandlung mit NaOCl + Argon-O2-Plasma hat im Vergleich zur 12 min Monotherapie mit Natriumhypochlorit einen besseren, wenn auch statistisch nicht signifikanten Effekt auf die Keimreduktion in einem Enterococcus faecalis Biofilm. Die Behandlung mit Argon-O2-Plasma allein zeigt eine signifikante Verbesserung der Wirksamkeit bei einer Verlängerung der Behandlungszeit von 6 auf 12 min, blieb aber hinter der Keimreduktion nach Behandlung mit NaOCl + Argon-O2-Plasma zurück.
Ziel der Arbeit war der Vergleich verschiedener Wundspüllösungen (0,9 %-NaCl-Lösung, Ringer-Wundspüllösung, Wasser und das tensidhaltige Prontosan®), um Unterschiede in der Effektivität der Spüllösungen festzustellen. Dazu wurden die Spüllösungen mit verschiedenen Prüfanschmutzungen an verschiedenen Testmodellen geprüft, wobei drei Modelle in die engere Wahl kamen: das Drei-Kammer-Verfahren, ein Biofilm-Modell und das Flow-Cell-Verfahren. Als Prüfanschmutzung wurden Drei-Feld-Objektträger mit Blutplasma und Fibrin als Anschmutzung im Drei-Kammer-Verfahren, angezüchtete Mono-Biofilme beim Biofilm-Modell und kommerziell erhältliche Blutplasmaanschmutzung auf Metallstreifen als Prüfkörper bei der Flow-Cell-Methode eingesetzt. Die Bestimmung der eluierten/gelösten Proteine erfolgte mittels modifizierter Biuret-Methode. Sowohl im Drei-Kammer-Verfahren als auch in der Flow-Cell-Methode zeigte NaCl-Lösung ein geringes, aber besseres Ablösungsvermögen von Proteinen als Ringer-Lösung. Eine ähnlich überlegene Wirkung zeigt Wasser im Vergleich zu Ringer-Lösung. Am Biofilm-Modell waren NaCl-Lösung und Ringer-Lösung Wasser in der Reinigungswirkung überlegen, ein Unterschied zwischen den elektrolythaltigen Lösungen war nicht erkennbar. Die tensidhaltige Wundspüllösung Prontosan® zeigte mittels Biuret als Proteinnachweisverfahren gegenüber den anderen Spüllösungen eine höhere Proteinmenge in der Lösung. Im Widerspruch dazu wurden hier aber auch die höchsten Restproteinmengen nach der Spülung festgestellt. Daraus ist zu schlussfolgern, dass die Proteinbestimmungsmethode durch Prontosan® gestört wird, so dass aus den Proteinkonzentrationen in prontosanhaltigen Spüllösungen nicht auf eine bessere Spülleistung geschlossen werden kann. Ohne die Klärung des Einflusses vom Prontosan® auf die Proteinbestimmung ist eine Bewertung der Spülleistung von Prontosan® nicht möglich. Dies war im Rahmen dieser Arbeit nicht zu klären. Erst nach diesem Schritt wäre eine definitive Aussage zu diesem Punkt möglich. Es zeigte sich, dass es schwierig ist, zwischen den getesteten Spülmitteln Unterschiede in der Spülleistung messbar zu machen. Die Ursache hierfür sind unkontrollierte mechanische Einflüsse, die z. B. bei dem Modell des Drei-Kammer-Verfahrens beim Durchmischen der Spüllösung auftreten und einen zusätzlichen Spüleffekt verursachen, was zu einer starken Streuung der Messwerte führte. Von den getesteten Verfahren eignet sich deshalb nur die Flow-Cell-Methode. Als ungeeignet erwiesen sich das Drei-Kammer-Verfahren und das Biofilm-Modell. Aufgrund der Fließtechnik kann die Mechanik bei der Flow-Cell-Methode konstant gehalten werden. Dadurch werden die Spülleistungen verschiedener Wundspüllösungen überhaupt erst vergleichbar. Bei dem Drei-Kammer-Verfahren und dem Biofilm-Modell ist das nicht möglich. Von den getesteten Prüfanschmutzungen erwiesen sich Anschmutzungen auf Proteinbasis als gut abspülbar. Mit dieser Prüfanschmutzung sind Unterschiede in der Spülleistung nur bei Modellen mit keiner oder einer exakt definierbaren mechanischen Einwirkung beim Spülvorgang deutlich zu machen. Besser geeignet sind Prüfanschmutzungen auf der Basis von Fibrin, Biofilm und denaturierten Proteinen. Von den geprüften und bewertbaren Wundspüllösungen zeigt NaCl-Lösung eine Überlegenheit im Vergleich zu Ringer-Lösung und Wasser.
Die Inaktivierung von Bakterien durch Antiseptika, z. B. auf chronischen Wunden ist unter anderem aufgrund der Bildung von Biofilmen erschwert. Ebenso stellt die Entwicklung von Resistenzen gegenüber Antibiotika ein immer größer werdendes Problem bei der Behandlung von Infektionen dar. Zudem ist die antimikrobielle Behandlung nur ein Teilaspekt, um chronisch infizierte Wunden in einen regenerativen Heilungsprozess zu überführen. Daher sind neue, alternative Behandlungsstrategien von hoher Bedeutung. Hierfür scheint physikalisches Plasma aufgrund seiner antimikrobiellen wie auch wundheilungsfördernder Wirkungsweise eine aussichtsreiche Perspektive darzustellen. Zur Erzeugung von sog. Tissue Tollerablen Plasma (TTP) stehen verschiedene Plasmaquellen zur Verfügung, die zur Anwendung gegen Mikroorganismen in Biofilmen in Frage kommen. In der vorliegenden Arbeit wurden der kinpen09 und zwei Dielektrisch-Behinderte-Oberflächen-Entladungs-Quellen, die Conplas- und die Epoxidharz-Plasmaquelle, auf ihre antimikrobielle Wirkungsweise mit Argonplasma mit und ohne Sauerstoffbeimischung und mit Luftplasma v. a. an Biofilmen mit P. aeruginosa SG81 und S. epidermidis RP62A untersucht. Mit dem kinpen09 wurde zusätzlich die antimikrobielle Effektivität von Plasma mit Helium oder Stickstoffbeimischungen getestet. Bei Einsatz des kinpen09 zeigte sich Argon als das antimikrobiell effektivste Trägergas. Bei der Epoxidharz-Plasmaquelle war Luftplasma am wirksamsten. Bei der Conplas sind Luft- und Argonplasma etwa gleich effizient gegen mikrobielle Biofilme. Die Reduktionsraten bei Argonplasma mit dem kinpen09 und Conplas lagen nach 300 s Expositionszeit bei P. aeruginosa bei ca. 5 log10 und mit dem kinpen09 bei S. epidermidis bei 3 log10. Diese Reduktionsraten übersteigen mit Ausnahme von 300 s Ar+O2-Plasma (kinpen09) die Wirksamkeit von Chlorhexidin (0,1 %), einem Standard-Antiseptikum zur Behandlung von Biofilmen, nach 10 min Behandlungsdauer von ca. 1,5 log10 signifikant (p < 0,005). In Übereinstimmung zur Literatur lässt sich aus den Ergebnissen ableiten, dass v. a. Sauerstoffradikale für die antimikrobielle Wirksamkeit verantwortlich sind. Neben der alleinigen Anwendung von TTP könnten Kombinationsbehandlungen mit Antiseptika aussichtsreiche Verfahren zur gezielten Inaktivierung von Mikroorganismen in Biofilmen und zur Modulation von Wundheilungsprozessen darstellen.
Die Zahl von Parodontitispatienten steigt jährlich an. Außerdem wurden vermehrt Implantate insertiert, die analog zur Parodontitis von Periimplantitis betroffen sind. Ursächlich für beide Erkrankungen sind Biofilme. Es gibt keine befriedigenden Methoden zur Biofilmentfernung, die außerdem eine wundheilungsfördernde Oberfläche erzeugen. Daher werden neue Behandlungsmethoden benötigt. In dieser Arbeit wurde drei Biofilmmodelle mit C. albicans, S. mutans und Speichelmikroorganismen mit drei verschiedenen Plasmaquellen (kINPen09, Hohlelektroden-DBD, Volumen-DBD) sowie zwei verschiedenen Gasmischungen (Argon und Argon+1% O2) jeweils 1, 2, 5 und 10 min mit Plasma behandelt. Als Positivkontrolle wurde Chlorhexidin mitgeführt. Außerdem wurden verschiedene Titanbearbeitungsformen (maschiniert, diamantbearbeitet, pulverbestrahlt sowie geätzt und gestrahlt) mit Argon+1%O2-Plasma mittels kINPen09 behandelt. Anschließend wurden die Elementzusammensetzung, der Kontaktwinkel sowie die Ausbreitung von osteoblastenartigen Zellen MG-63 auf diesen Oberflächen bestimmt. SLactive􀂓 wurde hierbei als Positivkontrolle verwendet. Um eine potentielle Anwendung in der Parodontologie zu prüfen, wurden diese Untersuchungen auch auf Dentin durchgeführt. Alle Plasmaquellen und –parameter wirkten antimikrobiell. Die Zerstörung der Zellen wurde im Rasterelektronenmikroskop deutlich. Hierbei reduzierte die Volumen-DBD die Koloniebildenden Einheiten um circa 5 log-Stufen und wies damit die höchste antimikrobielle Wirksamkeit auf. Sauerstoffzumischung führte nur bei der Hohlelektroden-DBD zu einer erhöhten antimikrobiellen Wirksamkeit. Die Plasmabehandlung reduzierte die Kontaktwinkel auf allen Oberflächen teilweise bis in den superhydrophilen Bereich. EDX-Analysen zeigten eine Reduktion der Masseprozent von Kohlenstoff sowie eine Erhöhung des Sauerstoffgehalts aller Oberflächen nach Plasmabehandlung. Die Ausbreitung der Osteoblasten war auf den plasmabehandelten Oberflächen signifikant höher als auf den unbehandelten Oberflächen und konnte sogar die Werte der hydrophilen SLactive􀂓-Oberfläche übersteigen. Diese Effekte konnten sowohl auf Titan als auch auf Dentin nachgewiesen werden. Da Plasma antimikrobiell wirkt und, wie in weiterführenden Versuchen gezeigt werden konnte, auch Biofilm entfernt, eignet es sich zur Therapie der Periimplantitis und Parodontitis. Außerdem wird die Oberfläche biokompatibler, wodurch die Wundheilung gefördert werden könnte. Da Plasma weitere wundheilungsstimulierende Faktoren beinhaltet, stellt es in Zukunft eine Erfolg versprechende Therapieoption für die Behandlung von Parodontitis und Periimplantits dar.
Bakterien, die in einem Biofilm organisiert sind, weisen eine um ein Vielfaches höhere Resistenz gegenüber antimikrobiellen Substanzen auf als planktonisch gelöste Zellen. Der häufigste beim Menschen vorkommende Biofilm ist die dentale Plaque. Als Keim zur Herstellung eines Biofilms wurde Streptococcus sanguis benutzt. Dieser bildete nach 48 h aerober Bebrütung bei 37 °C einen sichtbaren Biofilm auf Hydroxylapatit-Plättchen, die zur Imitation der Zahnoberfläche in einer Wachstumskammer mit kontinuierlicher Flusskultur-Technik aufgehängt waren. Zur Überprüfung der Funktionalität des Modells wurde die Wirksamkeit von drei Antiseptika getestet. Die HA-Plättchen wurden aseptisch aus der Wachstumskammer entnommen und jeweils in verschiedene Reagenzröhrchen mit Chlorhexidin (0,1% oder 1,0%), PVP-Iod (1,5% oder 7,5%) sowie Octenidindihydrochlorid (0,05% oder 0,1%) gegeben. Die Einwirkzeit jeder Konzentration betrug 5 min oder 30 min. Proben aus der Bakteriensuspension der Wachstumskammer wurden entsprechend behandelt. Ein zugefügtes spezifisches Neutralisationsmittel beendete die Wirkung der Antiseptika. Es lag eine signifikante Differenz zwischen der antimikrobiellen Aktivität gegen Bakterien in gelöster Form und solchen in Biofilmen vor. Beste Reduktionsfaktoren konnten mit Chlorhexidin (1,0%, 30 min), sowohl in Bezug auf Biofilme (3,97 log) als auch auf planktonische Zellen (= 5,58 log), ermittelt werden. Bei jeder der getesteten Substanzen zeigte sich eine klare Dosis-Zeit-Wirkungs-Beziehung. Es wurde daher geschlussfolgert, dass das entwickelte Modell in der Lage ist, schnell und kosteneffektiv die Aktivität antimikrobieller Substanzen gegen als Biofilm gewachsene Bakterien darzustellen.