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Unabhängig vom medizinischen Fortschritt stellt die Sepsis auch im 21. Jahrhundert ein Krankheitsbild mit hoher Mortalitätsrate, progredienter Inzidenz und zunehmender volkswirtschaftlicher Bedeutung dar. Ein zentraler therapeutischer Faktor ist der Erhalt mikro- und makrozirkulatorischer Hämodynamik. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Modulation von Tyrosinkinasen und Tyrosin-Phosphatasen die Mikrozirkulation in septischen Zuständen positiv beeinflussen kann.
Wir untersuchten die Auswirkungen des Tyrosine receptor kinase B -Agonisten Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) auf die intestinale Mikrozirkulation und Leukozyten-Endothel-Interaktion unter experimenteller Endotoxinämie mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie. Hierzu wurden die funktionelle, dysfunktionelle und nicht-funktionelle Kapillardichte der Lamina muscularis longitudinalis, circularis und des Stratums mucosae sowie die Leukozytenadhärenz der Venolen der submukösen Darmwand bestimmt. Ergänzend erfolgte eine Messung der hämodynamischen Parameter Herzfrequenz und mittlerer arterieller Blutdruck, sowie von Körpertemperatur, Blutgasen und Laktatkonzentration. Eine Bestimmung von Zyto- bzw. Chemokinen erfolgte mittels Fluorescent Bead Immunoassay.
Die intravenöse Applikation von BDNF führte unter Endotoxinämie zu einer signifikant erhöhten konstanten Leukozytenadhärenz in den Venolen dritten Grades der Darmwand und zu einer tendenziellen Zunahme um ca. 33 % in den Venolen ersten Grades. Die funktionelle Kapillardichte zeigte sich hingegen nach Behandlung der Endotoxinämie in den Laminae musculares longitudinalis und circularis tendenziell reduziert. Die Dichte nicht-funktioneller Kapillaren verhielt sich konkordant nach Behandlung mit BDNF tendenziell erhöht. Die Behandlung mit BDNF führte zu keiner Beeinträchtigung der Hämodynamik, jedoch zu einer signifikanten Basenabweichung unter Endotoxinämie. Eine Veränderung der Zytokinspiegel wurde nach BDNF-Applikation nicht verzeichnet.
Die Hinweise auf eine Verschlechterung der intestinalen Kapillarperfusion und der Nachweis einer verstärkten Leukozytenaktivierung nach BDNF-Applikation in systemischer Inflammation identifizieren die Blockade der durch endogenem BDNF vermittelten Kaskaden als mögliches therapeutisches Ziel. Es scheint daher sinnvoll, in weiterführenden tierexperimentellen und ggf. klinischen Studien den Nutzen von BDNF-Antagonisten in der Therapie systemisch-inflammatorischer Zustände wie der Sepsis zu evaluieren
Die chronische arterielle Hypertonie erhöht das Risiko für kardiovaskuläre Komplikationen wie Schlaganfall und Myokardinfarkt. In der Pathophysiologie dieser Komplikationen spielen Thrombozyten eine wesentliche Rolle. Hierbei gehen die meisten Experten derzeit davon aus, dass Thrombozyten mit den durch die Hypertonie geschädigten Gefäßwänden reagieren. Ziel unserer Untersuchungen war es, zu untersuchen, ob durch die Hypertonie auch Veränderungen in Thrombozyten entstehen. Thrombozyten zirkulieren im Kreislauf in engem Kontakt mit der Gefäßwand und reagieren sensibel auf hohe Scherkräfte und aktivierte Endothelzellen. Jede Aktivierung, auch in reversiblen Frühstadien führt dabei zu Veränderungen in der Proteinzusammensetzung der Thrombozyten, dem Proteom. Da sie keinen Kern haben, ist die Proteinneosynthese in Thrombozyten stark limitiert. So „speichern“ Thrombozyten Informationen über ihre Aktivierungshistorie während ihrer zehntägigen Überlebenszeit, da die veränderten Proteine nicht, oder nur sehr eingeschränkt durch neu synthetisierte Proteine ersetzt werden. Proteomics bietet einen Ansatz, über tausend Proteine gleichzeitig zu untersuchen. Mittels zweidimensionaler, differentieller in Gel Elektrophorese (2D-DIGE) kann dabei ein sensibler quantitativer Vergleich zweier Proben erfolgen. Die komplexe Methodik erfordert jedoch eine hochgradige Standardisierung der Versuchsgruppen. In diesem Projekt wurde daher ein Tiermodell verwendet, um die ca. 1000, mittels 2D-PAGE dargestellten Proteinspots des Thrombozytenzytosols auf hypertoniebedingte Veränderungen zu untersuchen. Dabei wurden zwei unterschiedliche Rattenmodelle der Hypertonie eingesetzt um die Aussagekraft zu erhöhen. Nach 14tägiger Hypertoniephase wurden 45 Proteinspots detektiert, deren Intensität in beiden Rattenmodellen signifikant verändert war. Die Identifikation dieser Spots mittels Massenspektrometrie zeigte neben spezifischen Thrombozytenproteinen v.a. Zytoskelett- und Zytoskelett -assoziierte Proteine. Wurde an die 14tägige Hypertoniephase eine 10tägige Erholungsphase angeschlossen, waren diese Veränderungen nicht mehr nachweisbar. Überraschenderweise waren die beobachteten Veränderungen unterdrückbar durch mehrmalige Blutentnahme vor- und während der Hypertoniephase. Dabei wurden 8 Tage vor-, sowie zweimal während der Hypertoniephase (Tage 3 und 10) 3 ml Blut entnommen. Die daraufhin durchgeführte Untersuchung auf Veränderungen des Thrombozytenproteoms durch Blutentnahmen an normotensiven Tieren zeigte ein Muster an Veränderungen, dass dem unter Hypertonie beobachteten entgegengesetzt war. Eine denkbare Ursache für diese Beobachtung ist, dass die Thrombozytopoese durch die mehrmaligen Blutverluste gesteigert wurde. Die so vermehrt ausgeschütteten „jungen“ Thrombozyten zeigen ein inverses Proteommuster, gegenüber den durch Hypertonie gestressten Thrombozyten. Um dieser Hypothese nachzugehen wurden Ratten mit dem Thrombopoetinrezeptoragonisten Romiplostim behandelt. Das Thrombozytenproteom von Ratten nach Stimulation der Thrombozytopoese ähnelt dem von Ratten nach mehrmaligen Blutentnahmen. Dies unterstützt unsere Hypothese, dass die durch Blutentnahmen bedingten Proteomveränderungen auf eine gesteigerte Thormobzytopoese zurückzuführen sind und damit auf das gesteigerte Vorkommen junger Thrombozyten im Blutkreislauf. Veränderungen des Thrombozytenproteoms, die in beiden Tiermodellen unter Hypertonie auftraten, können mit großer Sicherheit auf die Hypertonie zurückgeführt werden. Zu beachten ist allerdings, dass beide Modelle auf einer Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron Systems (RAAS) basieren. Es kann also nicht differenziert werden, ob die Veränderungen durch die Hypertonie selbst oder durch das aktivierte RAAS verursacht wurden. Die Tiermodelle spiegeln somit nur eine Subgruppe der Hypertoniepatienten wider. Wir haben mit diesen Experimenten Thrombozyten-Proteine identifiziert, die sich durch einen erhöhten Blutdruck verändern. Diese Proteine sind daher potentielle Kandidaten für Biomarker, die eine Aussage über den Blutdruckverlauf der zurückliegenden Tage ermöglichen. Solch ein Marker, ähnlich dem HbA1c beim Diabetes mellitus, könnte die Hypertoniediagnostik erheblich erleichtern. Für die in dieser tierexperimentellen Studie identifizierten Proteine finden sich analoge Proteine in menschlichen Thrombozyten. Deren Veränderung durch Bluthochdruck sollte in Fall/Kontroll-Studien am Menschen untersucht werden. In Ergänzung zum im Journal of Hypertension veröffentlichten Artikel wird in der vorliegenden deutschen Zusammenfassung detaillierter auf die Methoden eingegangen. Darüber hinaus werden zusätzliche Aspekte in der Diskussion angesprochen.
Tumornekrosefaktor-Alpha, sein Rezeptor und c-Met sowie die elektronenmikroskopische Morphologie der Nicht-Parenchymzellen während der östrogeninduzierten Hepatokarzinogenese der Ratte Das Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, ob die im Rahmen eines Models, einer intraportalen Transplantation von Ovargewebe in Rattenlebern beobachteten, morphologischen Veränderungen der Hepatozyten des Rezipientengewebes, die sich mit zunehmender Versuchsdauer als präneoplastische Herde bis zu Entwicklung von hepatozellulären Neoplasien erwiesen, von Alterationen der Nicht-Parenchymzellen begleitet werden. Die Untersuchung der Nicht-Parenchymzellen der Leber wurde mittels morphometrischer Methoden betrieben, indem die Volumenanteile der einzelnen Zellfraktionen und Zellzwischenräume der Versuchsgruppen untereinander verglichen wurden. Signifikanzen ergaben sich hierbei bei Betrachtung der Endothel- und Sternzellen, dem Dissé-Raum und dem Zellzwischenraum. Die Endothelzellen jüngerer Versuchstiere zeigten mehr Volumenanteile als diejenigen älterer Tiere. Ebenso fanden sich Endothelzellen in Kontroll- und ovarektomierten Gruppen mit weniger Volumen als diejenigen der transplantierten Tiergruppen bzw. Leberseiten. Das Volumen der Sternzellen zeigte sich vermindert in der HCC-Gruppe im Vergleich zu der gleichaltrigen Kontrollgruppe. Ebenso verhielt es sich bei der 6 Monate alten Kontrollgruppe und der ovarektomierten Tiergruppe. In der Beurteilung des Dissé-Raums fand sich lediglich eine Signifikanz, bei der in den ovarektomierten Tiergruppen das 6 Monate alte Versuchstier mehr Dissé-Raum-Volumen besitzt als das 24 Monate alt gewordene. Der Zellzwischenraum der HCC-Tiere nahm statistisch weniger Volumen ein als das der Hauptgruppe 3 Wochen post transplantationem. Zusätzlich wurden die Sternzellen hinsichtlich ihres Anteils der Fettvakuolen am Zytoplasmavolumen und der mittleren Größe der Fettvakuolen bestimmt. Letztere zeigten sich in keiner Gruppe statistisch signifikant verändert, während sich der Anteil der Fettvakuolen am Zytoplasmavolumen vor allem beim Vergleich älterer mit jüngeren Tieren vergrößert fand sowie sich transplantierte Tiergruppen mit kleineren Fettvakuolen als Kontrolltiere zeigten. Die immunhistochemische Diagnostik von TNF α zeigte sich korrespondierend zu den Literaturangaben in den Nichtparenchymzellen und den Hepatozyten. Hierbei ergaben sich keine Unterschiede beim Vergleich von unverändertem und verändertem Lebergewebe, während sich bei der Auswertung seines Rezeptors (TNF-R1) eine stärkere Farbreaktion in den präneoplastischen Hepatozyten ergab. Die Beobachtungen legen eine Bedeutung der Nicht-Parenchymzellen und der von ihnen während der östrogenvermittelten Hepatokarzinogenese gebildeten parakrinen Faktoren nahe.
Große epidemiologische Studien haben gezeigt, dass Patienten mit einem Diabetes mellitus oder einem metabolischen Syndrom ein erhöhtes Risiko für die Entstehung eines Hepatozellulären Karzinoms (HCC) besitzen. In einem in der Arbeitsgruppe von F. Dombrowski entwickelten Tiermodell konnte gezeigt werden, dass eine dauerhaft erhöhte Insulin- und Glukosekonzentration nach niedrig-dosierter portal-embolischer Pankreasinseltransplantation in diabetischen Ratten einen karzinogenen Effekt auf die Hepatozyten ausübt. Da der Signalweg über die Proteinkinase AKT und seine Effektormoleküle wie mTOR (mammalian target of Rapamycin) einerseits in der humanen Hepatokarzinogenese aktiviert ist, andererseits aber auch einen typischen intrazellulären Mediatorweg des Insulinsignals darstellt, war das Ziel dieser Arbeit, die funktionelle Bedeutung einer AKT/mTOR-Aktivierung in diesem Tiermodell mittels Western Blot und Immunhistochemie zu charakterisieren. AKT und seine Effektormoleküle (mTOR, NFkB, Bcl-2) sind dabei bereits in den frühesten Präneoplasien verstärkt exprimiert, durch AKT in ihrer Funktion negativ-regulierte Effektormoleküle (FOXO1, 4EBP1 und BAD) werden hingegen inhibiert. Diese Effekte nehmen im Verlauf der Karzinogenese vom Stadium der Präneoplasien zu den HCC deutlich zu. Daher lässt sich schlussfolgern, dass in der Insulin-induzierten Hepatokarzinogenese nach Pankreasinseltransplantation in diabetischen Ratten der AKT/mTOR-Signalweg als intrazellulärer Mediator des Insulinsignals von Beginn an aktiviert ist und an der Entstehung der Präneoplasien und der nachfolgenden Transformation in hepatozelluläre Tumoren eine wesentliche Bedeutung haben dürfte. Die AKT/mTOR Aktivierung ist ferner für die Induktion des lipogenen Phänotyps und die Heraufregulation der lipogenen Enzyme FASN, ACAC, ACLY, ähnlich wie beim HCC des Menschen und im Mausmodell, verantwortlich. Zum einen bietet dieses Modell somit auf molekularer Ebene Erklärungsansätze für die epidemiologisch gesicherte aber bisher pathogenetisch nicht verstandene Entstehung des HCC beim Menschen mit hyperinsulinämischen Diabetes mellitus. Zum anderen bleibt darüber hinaus abzuwarten, inwieweit sich durch Hemmung dieses onkogenen Signalwegs Ansätze für die Therapie des HCC bei Patienten mit dereguliertem Insulinstoffwechsel ergeben könnten.
Aging is a risk factor for stroke. Animal models of stroke have been widely used to study the pathophysiology of ischemic stroke, which in turn helped to develop numerous therapeutic strategies. Despite the considerable success of therapeutic strategies in animal models of ischemic stroke, almost all of them have been proved to be unsuccessful in the clinical trials. One of explanation is that data obtained from young animals may not fully resemble the effects of ischemic stroke in aged animals or elder patients, causing the discrepancy between animal experiments and clinical trials. To investigate these differences with regard to age, pathway specific gene arrays were used to identify and isolate differentially expressed genes in periinfarct following focal cerebral ischemia. The results from this study showed a persistent up-regulation of pro-apoptotic and inflammatory-related genes up to 14 days post stroke, a 50% reduction in the number of transcriptionally active stem cell-related genes and a decreased expression of genes with anti-oxidative capacity in aged rats. Also, it was observed that at day 3 post-stroke, the contralateral, healthy hemisphere of young rats is much more active at transcriptional level than that of the aged rats, especially at the level of stem cell- and hypoxia signaling associated genes. Next, protein levels between young and aged post-stroke rats in periinfarct were compared using proteomic tools. Among others, AnxA3 was identified as differentially regulated protein, but the expression of AnxA3 has no significant changes in periinfarct between these two age groups at day 3 and 14. Different from periinfarct, a strong upregulation of AnxA3 at day 3 in young rats plus a strengthened increase of AnxA3 at day 14 in aged rats using immunohistochemical quantification indicated a delayed microglial accumulation in infarct core of aged rats, suggesting that quick activation of microglia in infarct core of young rats might be beneficial for recovery. Colocalization with established microglial marker demonstrated that AnxA3 as a novel microglial marker is implicated in the microglial responses to the focal cerebral ischemia. In addition, it was found that AnxA3 positive microglial cells incorporated more proliferating cell marker BrdU. Third, the expression, localization and function of several transport proteins were investigated in young rats following focal ischemic stroke. P-gp staining was detected in endothelial cells of desintegrated capillaries and by day 14 in newly generated blood vessels. There was no significant difference, however, in the Mdr1a mRNA amount in the periinfarct region compared to the contralateral site. For Bcrp, a significant mRNA up-regulation was observed from day 3 to 14. This up-regulation was followed by the protein as confirmed by quantitative immunohistochemistry. Oatp2, located in the vascular endothelium, was also up-regulated at day 14. For Mrp5, an up-regulation was observed in neurons in the periinfarct region (day 14). In conclusion, reduced transcriptional activity in the healthy, contralateral sensorimotor cortex in conjunction with an early up-regulation of proapoptotic genes and a decreased expression of genes with anti-oxidative capacity in the ipsilateral sensorimotor cortex of aged rats, plus the delayed up-regulation of AnxA3 positive microglial cells in infarct core may contribute to diminished recovery in post-stroke old rats. In addition, it was demonstrated in this study that after stroke the transport proteins were up-regulated with a maximum at day 14, a time point that coincides with behavioral recuperation. The study further suggests Bcrp as a pronounced marker for the regenerative process and a possible functional role of Mrp5 in surviving neurons. This study provided several evidences for the different responses of young and aged rats using a focal ischemic stroke model. Understanding the effect of age is crucial for the development of relevant therapeutic drugs.