Doctoral Thesis
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Das Ziel dieser Studie war, das maschinelle Aufbereitungssystem (n=30), im Vergleich mit der Handaufbereitung (n=15), auf seine klinische Tauglichkeit zu überprüfen. Hierfür kam ein spezielles Muffelsystem zur Anwendung, sodass die Kanalmorphologie der extrahierten Zähne zu jedem Zeitpunkt der Aufbereitung ausgewertet werden konnte. Verwendet wurden nur mesiale Kanäle von UK-Molaren Untersucht wurden die Veränderungen der Wurzelkanalkrümmung anhand von Röntgenbildern, die Veränderungen des Wurzelkanalquerschnittes anhand von Querschnittsfotografien, die Reinigungswirkung unter dem REM, die Arbeitssicherheit und die Aufbereitungszeit. In einer weiteren Untersuchungsreihe wurde die integrierte Längenmessfunktion überprüft (n=35). Die maschinelle und manuelle Aufbereitung der Wurzelkanäle führten zu geringen Begradigungen der Wurzelkanalkrümmungen. Die Querschnittsformen ergaben überwiegend akzeptable Ergebnisse. Die Ergebnisse der Reinigungswirkung sind für beide Systeme als unzureichend einzustufen, wobei die manuelle Aufbereitung bezüglich des Debris im mittleren Drittel überlegen war. Bezüglich der Arbeitssicherheit, der Begradigung und der Querschnittsuntersuchungen ergaben sich keine statistisch signifikanten Unterschiede. Hinsichtlich der Aufbereitungszeit ist das Tri Auto ZX der Handaufbereitung deutlich überlegen. Die Längenmessfunktion ergab in 88,6 % klinisch akzeptable Ergebnisse und stellt eine sinnvolle Ergänzung zur röntgenologischen Längenbestimmung dar.
In der vorliegenden Arbeit konnte bei 55 Patienten mit B-Non-Hodgkin-Lymphomen (B-NHL) der maligne B-Zellklon mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) nachgewiesen werden: bei 41 Patienten mit chronisch lymphatischer Leukämie (CLL), 6 mit Mantelzell-Lymphom (MCL), 4 mit follikulärem Lymphom (FL) und bei je einem Patienten mit Haarzell-Leukämie (HCL), hoch-malignem B-NHL, lymphoplasmozytoidem Immunozytom (LP-1Z) und Plasmozytom. Für die Etablierung einer quantitativen, Klon-spezifischen (Allel-spezifischen) "real-time" PCR für die rekombinierten VDJ-Gene des IgH-Locus der malignen B-Zellen wurde die CLL gewählt, da bei dieser Erkrankung eine exzessive Vermehrung eines B-Zellklons vorliegt und - im Vergleich zu hochmalignen NHL und vor allem dem Plasmozytom - relativ selten erhebliche Mutationen im VH-FR3-Bereich auftreten. Für die Identifizierung des VDJ-Rearrangements des jeweiligen Patientenklons wurde in der primären PCR als 3´ Primer ein Oligonukleotid komplementär zu einem konservierten Abschnitt aller sechs JH-Segmente in Kombination mit einem von sechs verschiedenen 5´ Primern komplementär zu den konservierten Abschnitten der sechs VH-Familien-spezifischen VH-FR3-Regionen verwendet. Zusätzlich wurden sechs VH-Familienspezifische DNA-Sonden eingesetzt. Als Positivkontrolle wurde ein Moniertes k-ras DNA-Fragment als Standard verwendet. Alle PCR-Amplifikate (VH1-VH6) wurden auf ein Agarosegel aufgetragen. In fast allen Fällen fanden wir im Fall einer VH-Familienspezifischen Reaktion eine positive Reaktion in der "real-time" PCR und ein erwartetes DNA-Fragment von 100-200 Basenpaaren (bp). Bei 31/55 Patienten (21 CLL, 5 MCL, 2 FL, l HCL, l cb-NHL, l Plasmozytom) wurde das in der primären PCR identifizierte IgH-Rearrangement des malignen Zellklons sequenziert. Die ermittelten Sequenzen wurden mit veröffentlichten Sequenzen aus der Genbank "Igblast - Blast for Nucleotide Sequences" des "National Center for Biotechnology Information" (NCBF) zur Bestimmung der VH-N-D-N-JH Übergangsregionen verglichen. Wie in der Literatur bei der CLL beschrieben, fanden wir ein bevorzugtes Rearrangement der Gene VH l-69, VH3-30, VH3-33 und VH4-34. Im Anschluss an die Sequenzierung des jeweiligen malignen B-Zellklons wurden für die quantitative, Klon-spezifische PCR-Analyse Allel-spezifische Oligonukleotid-Primer (ASO-Primer) aus der VH-N-D-N-JH Übergangsregion ausgewählt. Die Spezifität des jeweiligen 3' ASO-Primers für ein bestimmtes Rearrangement wurde an zellulärer DNA mit Hilfe der PCR analysiert. Die ausgewählten ASO-Primer wurden vor dem weiteren Einsatz in der Klon-spezifischen PCR für den einzelnen Patienten an positiven und, wenn möglich, an morphologisch/zytologisch negativen Remissionskontrollen des Patienten, DNA Präparationen von fünf anderen CLL Patienten und fünf PBMNC ("peripheral blood mononuclear cells") gesunder Spender getestet. Für die Quantifizierung der eingesetzten zellulären DNA diente eine quantitative "real-time" PCR für k-ras. Bei 8/21 sequenzierten CLL-Patienten wurden Verlaufskontrollen mit Hilfe der Allel-spezifischen, quantitativen "real-time" PCR (ASO-PCR) für das klonale VDJ-Rearrangement des IgH-Locus durchgeführt. Die Methode wurde dann bei weiteren 8 Patienten mit verschiedenen B-NHL (4 MCL, 2 FL, l HCL, l hoch-malignes NHL) erfolgreich zur Verlaufskontrolle unter Chemotherapie z.T. in Kombination mit dem monoklonalen Antikörper Rituximab®, sowie nach autologer bzw. allogener Blutstammzell-Transplantation eingesetzt. Ziel war u.a. die Überwachung residualer Leukämie- bzw. Lymphomzellen ("minimal residual disease" = MRD). Bei zwei der im Rahmen dieser Arbeit allogen transplantierten Patienten mit MCL und HCL war es mit Hilfe der quantitativen ASO-PCR möglich, frühzeitig eine Therapie des molekularen Relapses (Anstieg peripherer zirkulierender Lymphomzellen über mehr als 3 log Einheiten) durch eine erneute Gabe des monoklonalen Antikörpers Rituximab® und durch Reduktion bzw. Wegnahme der Immunsuppression (Ausnutzung des immunologischen Effektes "Graft-versus-Leukemia" - GvL) einzuleiten. So konnte bei beiden Patienten der molekulare Relaps erfolgreich behandelt und ein klinischer Relaps verhindert werden. Zusammenfassend lässt sich festellen, dass die Allel-spezifische, quantitative "real-time" PCR (ASO-PCR) hervorragend geeignet ist, den malignen B-Zellklon bei verschiedenen B-NHL auch in der Phase der kompletten klinisch-zytologischen Remission zu verfolgen und damit eine Hilfe für differenziertere Therapieentscheidungen in die Hand zu bekommen.