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Physiologische und molekularbiologische Untersuchungen zur Adaptation von Staphylococcus aureus an anaerobe Bedingungen (2011)
Fuchs, Stephan
Auf den inneren und Ă€ußeren OberflĂ€chen des Menschen existieren zahlreiche Mikrohabitate mit limitiertem Sauerstoffangebot. Vor allem wĂ€hrend infektiöser VorgĂ€nge kann aufgrund einwandernder Neutrophile die Sauerstoffkonzentration im menschlichen Gewebe auf unter 1% sinken. Eine rasche Anpassung an das vorherrschende Sauerstofflevel und die Nutzung effizienter alternativer Atmungsformen oder des GĂ€rungsstoffwechsels sind deshalb entscheidend fĂŒr das mikrobielle Überleben im menschlichen Wirt. In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurde die anaerobe Genexpression von Staphylococcus aureus sowie die zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismen nĂ€her untersucht. Die sich in vier Teile gliedernde Arbeit befasst sich zunĂ€chst mit einer eingehenden Beschreibung der anaeroben Adaptation und Physiologie von S. aureus auf Ebene des Transkriptoms, der Proteinsynthese und des extrazellulĂ€ren Metaboloms. Die Identifikation eines konservierten Sequenzmotivs (inverted repeat) vor zahlreichen anaerob induzierten Genen war Ausgangspunkt fĂŒr die Untersuchung der entsprechenden regulatorischen VorgĂ€nge im zweiten Teil dieser Arbeit. Diese fĂŒhrten letztlich in Kooperation mit Arbeitsgruppen aus den USA, Schweden und Deutschland (AG R. Proctor, UniversitĂ€t Wisconsin; AG C. von Wachenfeldt, UniversitĂ€t Lund; AG C. von Eiff, UniversitĂ€t MĂŒnster; AG M. Lalk, UniversitĂ€t Greifswald) zu der Identifikation des Rex Proteins (SACOL2035) als zentraler Regulator der anaeroben Genexpression in S. aureus. Neben der Rex-abhĂ€ngigen Expressionskontrolle wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Friedrich Götz (UniversitĂ€t TĂŒbingen) auch der Einfluss des Zwei-KomponentenÂŹsystems NreBC auf die Genexpression in S. aureus nĂ€her untersucht. Auf Ebene des Transkriptoms, Proteoms und Metaboloms konnte so die essentielle Bedeutung des NreBC-Systems fĂŒr die Expression der dissimilatorischen Nitrat- und Nitritreduktasen in S. aureus nachgewiesen werden. Der dritte Teil dieser Arbeit beschĂ€ftigt sich mit der Einordnung des anaeroben ProteinsyntheseÂŹmusters (Proteomsignatur) in den Kontext zahlreicher anderer stressinduzierter Proteomsignaturen von S. aureus. Die aus diesem komplexen Vergleich gewonnenen Ergebnisse geben detaillierte Einblicke in die SpezifitĂ€ten und GemeinsamÂŹkeiten der Proteinsynthese von S. aureus als Reaktion auf oxidativen Stress (H2O2, Diamid und Paraquat), nitrosativen Stress (NO), Sauerstofflimitation in An- und Abwesenheit von Nitrat, Hitzestress (48°C) sowie subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen (Puromycin, Mupirocin). FĂŒr die Bereitstellung der entsprechenden Daten wurde im Rahmen dieser Arbeit zudem ein mySQL-basiertes System entwickelt, das die Visualisierung der Daten mit komplexen Abfrage- und Filtermöglichkeiten verknĂŒpft (http://www.aureolib.de). Im letzten Teil gibt diese Arbeit schließlich einen Überblick ĂŒber die Leistungen und Möglichkeiten der Proteomanalyse hinsichtlich physiologischer und infektionsrelevanter Fragestellungen. Besondere Beachtung findet hier die AufklĂ€rung und Struktur des bereits erwĂ€hnten Rex Modulons.
Einfluss der Kochsalzaufnahme auf die renale Genexpression von Komponenten des Endothelinsystems (2011)
Klinger, Franziska Martha
In der vorliegenden Studie wurde das renale Endothelinsystem auf Genexpressions- und Peptidebene bei Variation der diĂ€tetischen Kochsalzaufnahme in physiologisch relevanten GrĂ¶ĂŸenordnungen bei der Sprague-Dawley-Ratte ubtersucht. Das Ziel war eine systematische Darstellung der VerĂ€nderungen der wichtigsten Komponenten des Endothelinsystems mit einer differenzierten Betrachtung von Nierenrinde und Nierenmark. Dazu wurde in einer ersten experimentellen Serie der Kochsalzgehalt der zugefĂŒhrten Nahrung zwischen 0,15% und 1,80% variiert. Um den Einfluss des Renin-Angiotensin-Systems auf kochsalzinduzierte VerĂ€nderungen des renalen Endothelinsystems zu untersuchen, wurde ein Teil der Tiere mit dem AT1-Rezeptorblocker Losartan behandelt. Es wurden simultan Herzfrequenz, arterieller Blutdruck und die renale Na+-Bilanz bei den Tieren gemessen und am Ende des Experimentes die Nieren gewonnen. Anschließend erfolgten die Bestimmung der mRNA-Gehalte von PrĂ€-pro-ET-1, des ETA- und ETB-Rezeptors sowie des renalen immunreaktiven ET-1-Gehaltes. Zur besseren Lokalisierung und PrĂ€zisierung der gefundenen VerĂ€nderungen schlossen wir eine zweite experimentelle Serie an, in der eine feinere PrĂ€paration des Nierenmarks in Ă€ußere und innere Medulla, eine weitere Verringerung des Kochsalzgehaltes der Niedrigsalzgruppe (0,05%) sowie eine Erweiterung der Genexpressionsuntersuchungen um das Endothelin-Converting-Enzym-1 (ECE-1) erfolgte. Die Ergebnisse der Studie lassen sich wie folgt zusammenfassen: Die Variation der SalzdiĂ€t beeinflusste weder den arteriellen Blutdruck noch die Herzfrequenz der Tiere. Hinsichtlich der Genexpression war eine NiedrigsalzdiĂ€t von 0,15% NaCl mit einem Anstieg der mRNA-Expression von PrĂ€-pro-ET-1 (51%), des ETA- (81%) und ETB- Rezeptors (33%) sowie mit einem erhöhten immunreaktiven ET-1-Gehalt (110%) im gesamten Nierenmark assoziiert. In der weiterfĂŒhrenden Untersuchung unter 0.05% NaCl konnte dieser Effekt auf der Genexpressionsebene in der Ă€ußeren Medulla reproduziert werden, allerdings in milderer AusprĂ€gung (PrĂ€-pro- ET-1 37%, ETA 20%, ETB n. sign., ECE-1 16%). Diese DiĂ€teffekte ließen sich durch eine selektive AT1-Rezeptorblockade mittels Losartan teilweise bzw. vollstĂ€ndig aufheben. Der renale Cortex blieb durch Variation der Kochsalzaufnahme sowohl hinsichtlich der mRNA-Expression der einzelnen Komponenten des Endothelinsystems als auch hinsichtlich des immunreaktiven ET-1-Gehaltes weitgehend unbeeinflusst. Daraus lĂ€sst sich schlussfolgern, dass vorwiegend das medullĂ€re Endothelinsystem sowohl auf Transkript- als auch auf Peptidebene auf moderate VerĂ€nderungen der nutritiven Kochsalzaufnahme reagiert. Die signifikanten VerĂ€nderungen auf Genexpressionsebene betreffen dabei PrĂ€-pro-ET-1 und den ETA-Rezeptor insbesondere in der Ă€ußeren Medulla unter NiedrigsalzdiĂ€t. Diese Alterationen werden zumindest partiell durch AT1-Rezeptoren vermittelt.
Zur Bedeutung von Arzneistofftransportern fĂŒr die Therapie pulmonaler Infektionen mit Makrolidantibiotika und Rifampicin bei Fohlen (2011)
Peters, Jette
Der klinische Erfolg einer Arzneimitteltherapie wird maßgeblich durch pharmakokinetische Eigenschaften eines Arzneistoffes bestimmt. Dieser ist unter anderem vom Transport und der Verteilung des Arzneistoffes in die Zielkompartimente abhĂ€ngig. WĂ€hrend der Einfluss intestinal exprimierter Transportproteine auf die Absorption eines Arzneistoffes nach oraler Gabe bereits umfassend untersucht wurde, ist die Beteiligung dieser Proteine bei der Verteilung von Xenobiotika in die jeweiligen Wirkkompartimente ist bisher weniger umfassend untersucht. Ein Beispiel ist die pulmonale Penetration eines oral verabreichten Arzneistoffes. Es gibt erste Hinweise, die auf eine Beteiligung von Transportproteinen an der Akkumulation von beispielsweise Makrolidantibiotika in der Lunge schließen lassen. Ziel dieser Arbeit war, die Expression von fĂŒr den Arzneimitteltransport wichtigen Proteinen in unterschiedlichen Kompartimenten der Lunge und gleichzeitig den Einfluss dieser auf die Verteilung von Arzneistoffen in die pulmonale EpithelialflĂŒssigkeit und die bronchoalveolĂ€ren Lavagezellen zu untersuchen. Die klinisch indizierte Kombinationstherapie eines Makrolides mit Rifampicin zur Eradikation von Rhodococcus equi in Fohlen bietet eine geeignete Grundlage dafĂŒr. Zur Auswertung pharmakokinetischer Untersuchungen entwickelten und validierten wir eine FlĂŒssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS)-Methode. Diese ermöglichte die Quantifizierung von Clarithromycin, 14-Hydroxyclarithromycin, Rifampicin und dessen Hauptmetaboliten 25-O-Desacetylrifampicin sowohl in den Proben der tierexperimentellen Studien als auch in den Zelllysaten der in vitro-Untersuchungen. In zwei Interaktionsstudien an gesunden Fohlen sollte der Einfluss einer chronischen Komedikation von Rifampicin, einem Induktor der Genexpression von ABC-Transportern, auf die Verteilung der Makrolide Tulathromycin bzw. Clarithromycin in die pulmonalen Kompartimente untersucht werden. Hierbei stellten wir nach Rifampicingabe eine deutliche Abnahme der Akkumulation beider Makrolide in den pulmonalen Kompartimenten fest. Die mittels TaqManÂź-Methoden durchgefĂŒhrten Genexpressionsuntersuchungen ergaben den unerwarteten Befund einer fehlenden Induktion der mRNA von ABCB1 und ABCC2 durch Rifampicin. FĂŒr Clarithromycin ist bekannt, dass es ein Substrat von ABCB1 und ABCC2 ist. In in vitro-Transportstudien an ĂŒberexprimierenden Zellmodellen sowie Vesikeln transfizierter Zellen zeigten wir, dass Tulathromycin keine AffinitĂ€t zu den genannten Transportproteinen besitzt. Somit konnten die pulmonalen AuswĂ€rtstransporter nicht ursĂ€chlich sein fĂŒr den Verlust an Makrolidkonzentration an ihrem Wirkort. Gleichzeitig sank die orale BioverfĂŒgbarkeit von Clarithromycin signifikant um mehr als 90% wohingegen die BioverfĂŒgbarkeit von Tulathromycin nur um 25% sank. Dieser drastische Verlust an BioverfĂŒgbarkeit von Clarithromycin konnte weder allein mit einem gesteigerten intestinalen Efflux noch durch den gesteigerten hepatischen Metabolismus des CYP3A4-Substrates erklĂ€rt werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine Beteiligung anderer intestinaler Aufnahmemechanismen hin. Die anschließend durchgefĂŒhrte Studie zur Untersuchung der akuten Interaktion von Clarithromycin und Rifampicin erbrachte Ă€hnliche Ergebnisse bezogen auf die pulmonalen Kompartimente. Die orale Absorption war jedoch um „nur“ 70% reduziert. Den Unterschied von etwa 20% in der VerĂ€nderung der oralen Absorption von Clarithromycin verglichen zur chronischen Therapie konnten wir mit der nach akuter Komedikation ausbleibenden Induktion von ABCB1, ABCC2 und dem Biotransformationsenzym CYP3A4 begrĂŒnden. Auffallend waren die verdoppelten VerhĂ€ltnisse der Konzentration von Clarithromycin in der EpithelialflĂŒssigkeit verglichen zum Plasma sowohl nach chronischer als auch nach akuter Komedikation. Die weiteren Transportuntersuchungen an transfizierten Zellen zeigten einen inhibitorischen Einfluss von Clarithromycin auf alle Vertreter der organic anion transporting polypeptide (OATP-) Familie (OATP1B > OATP1B1 > OATP1A2 > OATP2B1). In den direkten Akkumulationsversuchen stellte sich Clarithromycin jedoch nicht als Substrat der genannten Transportproteine dar. Wir konnten somit verdeutlichen, dass die klinisch indizierte Kombinationstherapie aus Makroliden und Rifampicin zur Elimination des pathogenen R. equi mit einer drastischen Absorptionsminderung von Clarithromycin verbunden ist und die Akkumulation im pulmonalen Zielkompartiment deutlich beeintrĂ€chtigt ist. Dennoch werden in der pulmonalen EpithelialflĂŒssigkeit und den bronchoalveolĂ€ren Lavagezellen therapeutisch ausreichend hohe Konzentrationen erreicht. Wir konnten im Vergleich der akuten und der chronischen Interaktion der Antibiotika die Beteiligung von intestinalen Transportmechanismen, die durch Rifampicin modulierbar sind, nachweisen. Die detaillierte AufklĂ€rung der beteiligten Transportproteine bietet Ansatzpunkte fĂŒr zukĂŒnftige Forschungsarbeiten.
Genexpression von TRP-KanÀlen und histologische Charakterisierung der Skelettmuskulatur von normalen und TRPV4-Knock out MÀusen (2011)
Steinberger, Saskia
Die Duchenne Muskeldystrophie stellt eine X-chromosomal rezessiv vererbte, schwere Form der Muskeldystrophie dar. Die Ursache ist eine Mutation im Dystrophingen und die Folgen Ă€ußern sich in MuskelschwĂ€che, Muskelfasernekrosen und einer verstĂ€rkten Fibrosierung. Der genaue Pathomechanismus ist noch nicht abschließend geklĂ€rt. Durch Muskelbiopsien von DMD Patienten und mit Hilfe des homologen Tiermodells, der mdx-Maus, konnte herausgefunden werden, dass der intrazellulĂ€re Kalziumgehalt der Dystrophin-defizienten Muskelfasern erhöht ist. Einen möglichen Therapieansatz könnte die Blockierung von KationenkanĂ€len der Muskelfasermembran, die den pathologischen Kalziumeinstrom ermöglichen, darstellen. In vorangegangenen Arbeiten werden die TRP-KanĂ€le (Transient Receptor Potential channels) fĂŒr den pathologischen Kalziumeinstrom mitverantwortlich gemacht. In der vorliegenden Arbeit wurde der Fokus in erster Linie auf einen Vertreter der TRP-Kanal-Superfamilie, den TRPV4, gelegt. Zu diesem Zweck wurde die TRPV4-Knock out Maus nĂ€her untersucht. ZunĂ€chst fĂŒhrte man eine Standardhistologie mit Hilfe von HE, Sirius RED und ATPase-FĂ€rbung durch. Sowohl die Faserkaliberbestimmung als auch die Messung des Bindegewebsanteils zeigten keine Unterschiede zum Wildtypen. Eine anschließende Genstudie mittels RT-PCR ermöglichte die Quantifizierung der mRNA Expression von 22 TRP-KanĂ€len in der murinen Skelettmuskulatur. Dabei sollte in dieser Arbeit unter anderem die Frage einer möglichen Gegenregulation anderer-KanĂ€le auf Grund des TRPV4-Mangels in der TRPV4-KO Maus geklĂ€rt werden. Des Weiteren wurde auch ein Vergleich der mRNA Kanal-Expression zwischen schnellen (EDL) und langsamen (SOL) Muskel vorgenommen. Die Untersuchungen zeigten, dass von den 22 analysierten TRP-KanĂ€len 16 auf mRNA Ebene exprimiert werden. Dabei wiesen TRPV2 und TRPV3 eine erhöhte mRNA Expression in der TRPV4-KO Mutante im Vergleich zum Wildtyp auf. Signifikant war dieser Unterschied fĂŒr TRPV2 im M. soleus und fĂŒr TRPV3 in allen drei untersuchten Skelettmuskeln (TA, EDL, SOL). Dies könnte fĂŒr eine Gegenregulation dieser 2 TRP-KanĂ€le in TRPV4-defizienten Muskelfasern sprechen. Des Weiteren wurde eine signifikant verstĂ€rkte mRNA Expression von TRPM3, M4, M6, M8, V2, V4, und V6 im langsam zuckenden M. soleus im Vergleich zum schnell zuckenden EDL beobachtet. Dies trifft sowohl fĂŒr die TRPV4-KO als auch fĂŒr die WT MĂ€use zu und könnte fĂŒr eine stĂ€rkere Expression dieser TRP-KanĂ€le in den langsamen TYP 1 Fasern des M. soleus sprechen. Aus den vorliegenden Ergebnissen geht hervor, dass im Falle des Verlustes eines TRP-Kanals höchstwahrscheinlich andere Vertreter dieser Kanalfamilie in der Lage sind durch eine verstĂ€rkte Expression den Mangel zu kompensieren. Dies gilt es im Rahmen einer möglichen Therapie der Duchenne Muskeldystrophie, zum Beispiel mit Hilfe von TRP-Kanalblockern, zu beachten.
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