Doctoral Thesis
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Trotz der Verfügbarkeit von verschiedenen Impfstoffen zählen Influenza-A-Viren (IAV) nach wie vor zu den gefährlichsten humanpathogenen Krankheitserregern weltweit. Ebenso verursachen einige animale IAV-Stämme bei zahlreichen Wild- und Nutztierarten schwerwiegende und teilweise tödlich verlaufende Infektionen. Daher ist die Entwicklung moderner und effektiver Impfstoffe gegen IAV für die Tier- und Humanmedizin von größter Wichtigkeit. Im ersten Teil der Arbeit wurde auf Basis des IAV-Stamms A/Bayern/74/2009 (pH1N1) eine doppelt-attenuierte IAV-Mutante, genannt BY74-NS1-99-E, mit einem Elastase-sensitiven HA-Spaltmotiv und einer C-terminalen Verkürzung des Interferon-Antagonisten NS1 generiert und hinsichtlich ihrer Eignung als IAV-Lebendimpfstoff untersucht. In vitro zeigte sich BY74-NS1-99-E streng Elastase-abhängig und replizierte ausschließlich unter dessen Zugabe zu ähnlich hohen Titern wie der Wildtyp unter Zugabe von Trypsin. Aufgrund der geringen Elastase-Verfügbarkeit in vivo war die Mutante in ihrer Replikationsfähigkeit stark eingeschränkt und zeigte sich im Gegensatz zum Wildtyp sowohl im Mausmodell als auch im Schwein vollkommen apathogen. In der Maus führte die einmalige intranasale Applikation von BY74-NS1-99-E zu einer deutlichen Bildung von H1-spezifischen Serumantikörpern. Ihr Auftreten korrelierte mit dem Schutz der Mäuse gegen eine Belastungsinfektion mit dem homologen Wildtyp-Virus. Während eine singuläre Immunisierung mit einer Dosis von 106 TCID50 BY74-NS1-99-E komplett vor einer Replikation des homologen Belastungsvirus schützte, verhinderten Dosen ab 104 TCID50 die Ausbildung klinischer Symptome, einen Gewichtverlust und reduzierten die pulmonale Viruslast. Im Schwein erwies sich die Mutante als wenig immuogen. So ließ sich selbst nach zweifacher intranasaler Applikation mit der Mutante keine H1- oder NP- spezifische Antikörper-Antwort nachweisen. Um künftig leichter Fragen zum Zelltropismus und zur Virusausbreitung auch in Echtzeit sowohl in vitro als auch in vivo untersuchen zu können, wurde im Rahmen des zweiten Teils der Arbeit ein replikationsfähiges IAV mit einem membranständigen eGFP generiert. Die Strategie zur Herstellung des rekombinanten, Fremdgen exprimierenden Virus, basierte auf einer Veröffentlichung von Gao et al. (2010), in welcher ein IAV mit einem zusätzlichen neunten Gen-Segment beschrieben wird. Bei den in vitro Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der mittels reverser Genetik hergestellten Mutante BY74-eGFP, wurde eine im Vergleich zum parentalen Wildtyp verminderte Replikationseffizienz festgestellt. Genetisch zeigte sich BY74-eGFP weitgehend stabil. Die Ergebnisse der Western-Blots sowie die Immunfärbungen zur konfokalmikroskopischen Auswertung deuteten stark auf eine Inkorporation des NA-eGFP-Fusionsproteins in die virale Membran der Mutante hin. Ein solches Reportergen-exprimierendes Virus könnte zukünftig als molekulares Werkzeug bei der Untersuchung und Aufklärung der genauen Verläufe einer IAV-Infektion in vitro und in vivo dienen. Ziel des dritten Teils dieser Arbeit war es, auf Grundlage der Arbeiten von Gao et al. (2010) und Stech et al. (2005), ein Elastase-abhängiges IAV, welches zwei verschiedene Hämagglutinine (H1 und H3) exprimiert, zu generieren und auf seine Eignung als LAIV im Mausmodell zu untersuchen. Als Basis für das generierte Neunsegmentvirus BY74-H1H3-E diente der Stamm A/Bayern/74/09 (pH1N1). Das zusätzlich bereitgestellte neunte Gensegment codierte für das H3-HA des Stammes A/Swine/Bissendorf/IDT1864/2003 (H3N2) (SB03). Bei den In-Vitro-Untersuchungen zur Expressions-Stabilität konnte zwar zunächst eine schwache H3-HA-Expression in den infizierten Zellen beobachtet werden, jedoch reduzierte sich diese von Passage zu Passage und verschwand letztendlich. Die Genomanalyse zeigte, dass das H3-tragende Gensegment letztlich verloren ging. Im Vergleich zum Wildtyp wies das potentielle Impfvirus in vitro eine stark verringerte Replikationsfähigkeit auf. Im Mausmodell erwies sich die BY74-H1H3-E-Mutante im Gegensatz zu A/Bayern/74/09 (pH1N1) und A/Swine/Bissendorf/IDT1864/2003 (H3N2) als vollkommen apathogen. Eine zweifache intranasale Immunisierung mit 103 TCID50 der dualen Virusmutante induzierte eine deutliche H1-spezifische und zum Teil eine moderate H3-spezifische Antikörper-Antwort. Sie schützte die Tiere bei einer homologen Belastungsinfektion BY74-Wildtyp (H1N1) komplett vor einem Gewichtsverlust und der Ausbildung klinischer Symptome. Bei einer heterosubtypischen Belastungsinfektion mit SB03-Wildtyp (H3N2) reduzierte sie den Gewichtsverlust und die klinischen Symptome. Die Doppelimmunisierung führte sowohl bei den Tieren, die einer homologen als auch bei den Tieren die einer heterologen Belastungsinfektion unterzogen worden waren zu einer Reduktion der pulmonalen Viruslast. Insgesamt erfüllte BY74-H1H3-E die Anforderungen eines potentiellen dualen LAIV-Kandidaten nur bedingt.
Die Glykoproteine gB und gH-gL sind bei allen Herpesviren konserviert und wichtig für den Viruseintritt und die direkte Zell-Zell-Ausbreitung. Allerdings kann sich PrV in Abwesenheit von gL noch in einem sehr geringen Ausmaß von Zelle zu Zelle ausbreiten, was Reversionsanalysen durch serielle Zellkultur-Passagen einer gL-negativen PrV-Mutante erlaubt. So konnte in einem Passageexperiment die Revertante PrV-ΔgLPassB4.1 isoliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden die molekularen Grundlagen der gL-unabhängigen Infektiosität von PrV-ΔgLPassB4.1 untersucht. Dabei wurden Mutationen in den Glykoproteinen gB, gH und gD nachgewiesen und deren Auswirkung auf die Proteinfunktion mit Hilfe von transienten Transfektions-Fusionsassays untersucht. Die Aufklärung der Kristallstrukturen eröffnete die Möglichkeit, über zielgerichtete Mutagenese die Funktion von gH-gL besser zu analysieren. Erstaunlich war, dass im gH des Impfstammes PrV-Bartha ein ansonsten hochkonserviertes Prolin durch Serin ersetzt ist. Für dieses Prolin wurde postuliert, dass es für die Ausbildung einer ebenfalls bei allen Herpesviren konservierten Disulfidbrücke notwendig ist. Um den Effekt der Substitution und die Funktion der Disulfidbrücke zu testen, wurden gH Mutanten hergestellt, die entweder Prolin oder Serin an Position 438 oder Serin statt Cystein an Position 404 exprimierten. Diese wurden in transienten Transfektions-Fusionsassays sowie während einer Virusinfektion getestet. Obwohl die Aminosäuresequenzen der gH-Proteine der Herpesviren nur eine geringe Homologie aufweisen, sind die Kristallstrukturen erstaunlich ähnlich. Daher sind konservierte Strukturmotive wie die Disulfidbrücke in der Domäne III, für die eine Bedeutung für die Faltung und Stabilität der Domäne III postuliert wurde, von besonderem Interesse. Um weitere funktionsrelevante konservierte Regionen in Domäne III aufzudecken, welche für die Lokalisierung und Funktion des gH wichtig sein könnten, wurden zunächst Sequenzvergleiche zwischen EBV und PrV gH unter Berücksichtigung der vorhandenen gH-Kristallstrukturen durchgeführt. Hierbei wurden komplexe Interaktionsnetzwerke über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen konservierten und benachbarten nicht-konservierten Aminosäuren vorhergesagt. Diese wurden im EBV und PrV gH mutiert und die gH-Proteine anschließend auf ihre Oberflächenexpression und Fusionsfunktion untersucht. Zusätzlich wurden PrV Rekombinanten mit entsprechenden gH-Mutationen hergestellt und charakterisiert.
Staphylococcus (S.) aureus ist vor allem bekannt als einer der Haupterreger nosokomialer Infektionen weltweit. Die Mechanismen, mit denen S. aureus und das Immunsystem des Wirtes miteinander interagieren sind komplex und bis heute nicht vollständig verstanden. Ziel der vorliegenden Dissertation war es daher, bekannte Virulenzfaktoren von S. aureus und Proteine, deren Funktion für das Bakterium bisher unbekannt ist, hinsichtlich ihrer Immunogenität und ihrer Fähigkeit, Interaktionen mit Zellen und Plasmafaktoren des humanen Blutes einzugehen, zu charakterisieren. Die Entwicklung und Anwendung eines für den Organismus S. aureus spezifischen Proteinmikroarray war eines der Hauptziele dieser Arbeit, welches unter der Bezeichnung Staph-Toxin-Ag verwirklicht wurde. Der Array trug bis zu 62 S. aureus-Antigene und zeigte sich als geeignet zur Charakterisierung und Quantifizierung von Antikörperantworten in verschiedenen humanen und murinen Wirtsproben, wie Blutplasma und -serum sowie anderen extrazellulären Flüssigkeiten wie Nasensekret und Bauchwasser von gesunden und infizierten Probanden. Im ‚Protein-Interaktionsassay‘ wurde der Staph-Toxin-Ag dazu verwendet, Interaktionen von S. aureus-Proteinen zu humanen Blutplasmaproteinen zu identifizieren – Faktor H, Fibronektin, Fibrinogen, Plasminogen und Vitronektin. Der Staph-Toxin-Ag wurde in zwei unabhängigen globalen Studien angewendet, welche die S. aureus spezifischen Antikörperantworten von gesunden humanen Probanden untersuchten, darunter Träger und Nicht-Träger von S. aureus. In der ersten Studie wurden die IgG-Antworten in den Blutplasmen, in der zweiten Studie die Antikörperantworten der Klassen IgG und IgA, hier in den Nasensekreten der Probenaden charakterisiert. In beiden Studien wurde wie erwartet eine enorme Heterogenität der detektierten Antikörperantworten innerhalb der Kohorten beobachtet, die unabhängig vom Trägerstatus bestand. Vergleichende Analysen der IgA- mit den IgG-Antworten in den Nasensekreten konnten den Grad der Heterogenität noch einmal deutlich erhöhen. Für keinen der untersuchten Probanden stimmten die S. aureus-Antigen-Muster beider Antikörperklassen vollständig überein. Für die untersuchten S. aureus-Träger wurden im Durchschnitt höhere Antikörperlevel nachgewiesen als für die Nicht-Träger. Statistische Analysen (Mann-Whitney U-Test) der gemessenen IgG- bzw. IgA-Level identifizierten insgesamt zehn Antigene, gegen die die Testgruppe der Träger im Vergleich signifikant höhere Antworten zeigte. Für das virulenzassoziierte Protein IsaA (Immunodominant staphylococcal Antigen A) wurden die beschriebenen Unterschiede in beiden globalen Studien und für beide untersuchten Antikörperklassen identifiziert. Die stärksten und häufigsten Antikörperantworten konnten gegen Proteine aus zwei funktionellen Gruppen – die nicht-egc-Superantigene (SEB, SEC, TSST-1) und die Komplement- und Koagulationsinhibitoren (SCIN, Efb, Sbi, SSL-7, SACOL1169) – detektiert werden. Mindestens 60 % der untersuchten Probanden zeigten spezifische IgG- und/oder IgA-Antworten gegen Komplementinhibitoren. Hingegen konnten für Superantigene vor allem Antikörperspezifitäten der Klasse IgG detektiert werden. Für den Komplementinhibitor Sbi (S. aureus Binder of IgG) wurde eine Lücke in den IgG-Antworten beobachtet. Beide funktionelle Gruppen werden folglich bei der Invasion des Wirtes von S. aureus in vivo exprimiert. Komplementinhibitoren sind darüber hinaus offensichtlich für S. aureus von besonderer Relevanz bei der Kolonisierung der Naseschleimhaut. Zahlreiche neue Erkenntnisse konnten gewonnen werden zu Proteinen, die von S. aureus sekretiert werden, deren Funktion für das Bakterium jedoch bisher unbekannt ist. Gegen zehn dieser Proteine wurden mithilfe des Staph-Toxin-Ag spezifische IgG- und/oder IgA-Antworten nachgewiesen, besonders häufig gegen die Antigene SACOL0479, SACOL0480, SACOL0985 und SaurJH1_2034. Dies zeigte, dass diese Proteine durch S. aureus in vivo synthetisiert werden und dass sie immunogen wirken. Im ‚Protein-Interaktionsassay‘ konnten für 20 der sekretierten Proteine mit unbekannter Funktion Interaktionen mit humanen Blutplasmafaktoren nachgewiesen werden. In durchflusszytometrischen Analysen mit humanem Vollblut wurden für sieben Proteine – SACOL0021, SACOL0742, SACOL0908, SACOL0985, SACOL1788, SACOL1802 und SACOL2197 – spezifische Bindungen an PMNs (Polymorphonuclear Leukocytes) und/oder Monozyten gezeigt. In der vorliegenden Dissertation wurden mithilfe immunologischer und durchflusszytometrischer Methoden potentielle neue Virulenzfaktoren, Vakzinkandiaten sowie diagnostische Biomarker identifiziert. Neben der wissenschaftlichen Anwendung ist der Proteinarray Staph-Toxin-Ag durch seine Eigenschaften prädestiniert für einen Einsatz als Screening-Methode in der diagnostischen Medizin.
Clostridium (C.) difficile ist beim Menschen ein bedeutender Erreger von Krankenhaus-assoziierten Durchfallerkrankungen. Die vorliegende Dissertation umfasst die Erhebung und Analyse der ersten epidemiologischen Daten zu C. difficile in deutschen Heim- und Nutztierbeständen und die Entwicklung eines neuartigen DNA-Microarrays, der eine einfache Ribotypisierung von C. difficile ermöglicht. In drei Studien wurden Kotproben von Hunden, Katzen, Ferkeln und Kälbern kulturell auf C. difficile untersucht. Das Bakterium wurde aus 5 von 135 Katzenkot- (3,7%), 9 von 165 Hundekot- (5,4%), 176 von 999 Kälberkot- (17,6%) und 147 von 201 Schweinekotproben (73,1%) isoliert. Neugeborene Ferkel und Kälber waren in den ersten 2 bzw. 3 Lebenswochen signifikant häufiger kulturpositiv für C. difficile als ältere Tiere. Die in den Studien isolierten Stämme wurden 25 Ribotypen zugeordnet; darunter befanden sich 6 bisher nicht beschriebene Varianten. Bei den Ferkelproben dominierten die einander sehr ähnlichen Ribotypen 078 (55% der Isolate) und 126 (20%). Die Ribotypen 033 (57% der Isolate) und 078 (17%) wurden bei Kälbern am häufigsten vorgefunden. Basierend auf ihren Typisierungsprofilen wurden die Ribotypen in einer UPGMA-Analyse (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) untereinander verglichen. Von den 25 bei den untersuchten Tieren gefundenen Ribotypen formten 11 einen Cluster, zu dem auch die Ribotypen 033, 078 und 126 gehörten und in dem sich 90% aller in den beiden Nutztierstudien isolierten Stämme wiederfanden. Alle Isolate dieses Clusters waren zudem PCR-positiv für ein binäres Toxin und, im Gegensatz zu allen nicht zu dem Cluster gehörenden Ribotypen, PCR-negativ für den MLVA-Lokus A6Cd. Hierdurch, aber auch durch frühere Studien, in denen gezeigt werden konnte, dass die dem Cluster zugeordneten Ribotypen 033, 045, 078 und 126 den gleichen MLST-Typ (ST-11, Multilocus Sequence Typing) und eine charakteristische Deletion (delta 39 bp) im Toxinregulatorgen tcdC aufweisen, wird die These einer genetische Verwandtschaft unterstützt. In allen untersuchten Tierpopulationen wurden Ribotypen gefunden, die mit C.-difficile-Infektionen des Menschen assoziiert werden. Da Stämme des Ribotyps 078 in deutschen und europäischen Krankenhäusern zunehmend häufiger als Ursache von Durchfallerkrankungen auftreten, wurden alle ermittelten MLVA-Daten von Ribotyp-078-Stämmen humanen und tierischen Ursprungs mit entsprechenden Daten anderer Studien aus 5 europäischen Ländern verglichen. In einer hierbei durchgeführten Minimum-Spanning-Tree-Analyse mit 294 Datensätzen wurde die genetische Abgrenzung von MLVA-Typen unterschiedlicher geographischer Herkunft verdeutlicht und belegt, dass einige aus Tieren und Menschen isolierte C.-difficile-Stämme sehr ähnlichen oder sogar identischen MLVA-Typen entsprechen. Die in den Haus- und Nutztierstudien isolierten C. difficile wurden anschließend mit dem neu entwickelten DNA-Microarray ribotypisiert. Das Sondendesign des Microarrays basiert auf der bei C. difficile modular aufgebauten Intergenic Spacer Region (ISR), welche auch Zielstruktur der herkömmlichen Ribotypisierungsmethoden ist. Die Sonden wurden von in der GenBank-Datenbank publizierten ISR-Modulsequenzen und theoretisch möglichen Modulsequenzkombinationen abgeleitet. Nachdem die Eignung des Arrays in theoretisch und praktisch durchgeführten Experimenten belegt werden konnte, wurde mit 142 repräsentativ ausgewählten C.-difficile-Stämmen eine 48 Ribotypen umfassende Datenbank aus Referenzhybridisierungsmustern erstellt. Diese Referenzmuster wurden anschließend in einer Ähnlichkeitsmatrix-Analyse untereinander verglichen, wobei 27 Referenzmuster eindeutig differenziert werden konnten. Zu den gut unterscheidbaren Ribotypen gehörten u.a. die häufig mit humanen C.-difficile-Infektionen assoziierten Ribotypen 001, 014/020, 027 und 078/126. Nicht unterscheidbar hingegen waren die 11 Ribotypen des oben beschriebenen Clusters, wodurch sich die These ihrer molekularen Verwandtschaft weiter erhärtet. Die Praxistauglichkeit des DNA-Microarrays wurde abschließend in einer Anwendungsstudie überprüft. Hierbei wurden 50 C.-difficile-Stämme, die im Rahmen eines anderen Projektes aus Kotproben von Haustieren und deren Besitzern isoliert wurden, mit herkömmlicher und DNA-Microarray-basierter Ribotypisierung vergleichend untersucht. Berücksichtig man, dass durch den Microarray einige sehr ähnliche Ribotypen derzeit noch nicht unterschieden werden können, wurden alle Isolate dem richtigen Ribotypen bzw. der richtigen Ribotypengruppe zugeordnet. Darüber hinaus wurden 6 für das Microarray unbekannte Ribotypen korrekt als „neu“ und klar voneinander unterscheidbar erkannt. Zusammenfassend trägt das Dissertationsprojekt zum Verständnis über das Vorkommen von C.-difficile-Genotypen in Heim- und Nutztierbeständen bei und präsentiert einen neuartigen DNA-Microarray zur einfachen Ribotypisierung von C. difficile.