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Zur Reproduzierbarkeit von Augeninnendruckmessungen am Tiermodell mittels Ocular Response Analyzer
(2016)
Hintergrund: FĂŒr die Bestimmung des intraokularen Drucks stehen verschiedene Messprinzipien zur VerfĂŒgung. Alle Messmethoden, die von auĂen den Augeninnendruck (IOD) ermitteln, werden durch individuell variierende biomechanische Gewebeeigenschaften der HH beeinflusst. Die berĂŒhrungslose Luft-Puls-Tonometrie gilt als ein von der Hornhaut-dicke weniger abhĂ€ngiges Verfahren, welches den Intraokulardruck jedoch im Vergleich zur Goldmann-Applanationstonometrie (GAT) eher ĂŒberschĂ€tzen soll. Vor diesem Hintergrund wurden die ReliabilitĂ€t und der Einfluss des IOD auf die korneale Hysterese (CH) und den kornealen Resistenzfaktor (CRF) des Ocular Response Analy-zer (ORA) an einem tierexperimentellen Augenmodell untersucht. Methodik: Die Kontrolleinheit eines neu entwickelten biomechanischen Augenmodells (IAM) wurde fĂŒr das Experiment am ORA an 10 Bulbi junger Schweine genutzt, um die ORA- Parameter IOPg (analog GAT), IOPcc (korrigierter IOD), CH und CRF zu ermitteln. Die Steuerungseinheit regelte in 5-mmHg-Schritten den wahren IOD zwischen 10 und 40 mmHg mithilfe von 2 Schrittmotoren ĂŒber ein bidirektionales System. Nach der Ult-raschallpachymetrie wurden die Bulbi anhand der zentralen Hornhautdicke (CCT) in zwei Gruppen (Gruppe 1 CCTâ€1450 ÎŒm, Gruppe 2 CCT>1450 ÎŒm) unterteilt. Bei stu-fenweiser Erhöhung und Absenkung (jeweils immer 5 mmHg) des wahren Intraokulard-ruckes (Istdruck) wurden die ORA-Parameter ermittelt. Ergebnisse: Die Differenz IOPg/Istdruck verhielt sich stets negativ und nahm mit steigendem Druck zu. Besonders groĂ war die Differenz bei den Schweinebulbi der Gruppe 1. Der IOPcc stand im niedrigen Druckbereich bis ca. 15 mmHg in einem positiven VerhĂ€ltnis zum Istdruck. Mit steigendem IOD wurde die Differenz zum Istdruck negativ. Die VerhĂ€lt-nisĂ€nderung war im Vergleich zum Kurvenverlauf des IOPg konstant. Die HornhĂ€ute der Gruppe 2 waren fehleranfĂ€lliger. Die Differenz IOPg/Istdruck betrug im Median in der Gruppe 1 -7,9 mmHg und in der Gruppe 2 -7,0 mmHg. Der IOPcc wurde in geringe-rem MaĂe von der zentralen Hornhautdicke beeinflusst. Die Differenz war in der Grup-pe 1 im Median bei -1,8 mmHg und in der Gruppe 2 bei -2,8 mmHg. Die CH war mit einem Mittelwert von 5,5±2,7 mmHg in der Gruppe 1 und 7,1±2,1 mmHg (Gruppe 2) bei allen Drucklagen konstant. Schlussfolgerung: Die Untersuchungen am tierexperimentellen Augenmodell (IAM) zeigen, dass der IOPcc in einem Bereich zwischen 10 und 25 mmHg den wahren intrakameralen vor-herrschenden Druck misst. In diesem âphysiologischen Bereichâ kann der ORA einen wichtigen diagnostischen Nutzen fĂŒr die âZieldruckbereichâ-Einstellung zahlreicher Glaukompatienten haben. Bei höheren Druckwerten sind Abweichungen zu beobachten. Die CH in der Gruppe 2 ist gröĂer, jedoch in beiden Gruppen ĂŒber den gesamten Druckverlauf ohne signifikante Abweichung. Die CH ist demnach ein IOD- und CCT-unabhĂ€ngiger Faktor. Das gemessene Verhalten der CH steht im Widerspruch zu den bislang in der Literatur veröffentlichten Daten. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergeb-nisse zeigen die Bedeutung zusĂ€tzlicher, noch nicht identifizierter Einflussfaktoren auf die CH. Umfangreichere Evaluierungen des ORA wĂ€ren daher zur Analyse systemati-scher Abweichungen hilfreich, um dementsprechend die Software des ORA optimieren zu können.
Die Nutzung von Hochfeld MRT Systemen zur Volumetrie und Beurteilung intradiskaler VerĂ€nderungen ist innovativ und eröffnet einzigartige Möglichkeiten bei der nicht invasiven Diagnostik und Kontrolle von therapeutischen Effekten an der Bandscheibe. In der vorliegenden Studie wurden 76 porcine Bandscheiben von 15 Schweinen in vitro hinsichtlich der VolumenĂ€nderung des Nucleus pulposus nach Mikrodiskektomie mit dem MD SpineWandÂź (Fa. Arthrocare) untersucht. Ziel der Untersuchungen war es, die GröĂe dieser VolumenĂ€nderung mit Hilfe des 7 Tesla Hochfeld MRT (BioSpin ClinScanÂź, Fa. Bruker) zu objektivieren und einen signifikanten Volumenunterschied bei DurchfĂŒhrung des OP-Verfahrens mit und ohne Applikation der Coblationsenergie nachzuweisen. Das Volumen des Nucleus pulposus konnte durch Anwendung der Mikrodiskektomie sowohl mit als auch ohne Einschalten der Coblationsenergie reduziert werden. Der Vergleich der Gruppen zeigte mit p < 0,001 jedoch eine hochsignifikant gröĂere Volumenreduktion in der Versuchsgruppe. Insgesamt konnte in den Bandscheiben der Versuchsgruppe (n = 38) eine absolute Reduktion des Nukleusvolumen um 229,03 mmÂł gemessen werden, wobei der Effekt in den Bandscheiben der LWS (n = 19) mit 257,01 mmÂł gröĂer war als in den etwas kleineren Bandscheiben der BWS (201,05 mmÂł, n = 19). Relativ zu den Ausgangsvolumina entsprechen diese Ergebnisse einer Volumenreduktion des Nucleus pulposus um 24,66 % in der LWS und 22,96 % in der BWS. FĂŒr die Kontrollgruppe ohne Anschalten der Coblationsenergie ergaben sich vergleichsweise relative Volumenreduktionen um 6,04 % in der LWS (n = 19) und 4,99 % in der BWS (n = 19). Zieht man zusĂ€tzlich die Volumina der hypointensen intradiskalen LĂ€sionen mit in die Berechnungen ein, so ergibt sich ein hypothetischer reduzierender Volumeneffekt in der Versuchsgruppe von 37,47 % (LWS) und 37,23 % (BWS). Die Studie hat als erste ihrer Art die Volumenreduktion nach minimalinvasiver Mikrodiskektomie am porcinen Modell in vitro beschrieben. Die Ăbertragung der Ergebnisse auf ein in vivo-Modell sowie den Menschen bleibt offen, stellt jedoch eine interessante Zielstellung kĂŒnftiger Forschung dar.
Gegenstand: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die experimentelle Untersuchung eines mit verschiedenen ZusĂ€tzen modifizierten Calciumphosphatzementes an Minischweinen. Als Alternative zu autogenen Knochentransplantaten gewinnen Knochenersatzmaterialien zunehmend an Bedeutung. Der mit Chondroitinsulfat modifizierte Calciumphosphatzement soll fĂŒr die Sanierung von Knochendefekten genutzt werden. Diese Arbeit untersucht die osteogene Potenz kleiner funktioneller Gruppen der extrazellulĂ€ren Matrix wie Chondroitinsulfat. Material und Methode: Insgesamt wurden 40 Defekte an zehn adulten LEWE-Minischweinen im Unterkieferbereich gesetzt (4 Defekte pro Minischwein) und mit Knochenersatzmaterial gefĂŒllt. Ein mit Eigenblut und autologer Spongiosa gefĂŒllter Defekt wurde als Referenz genutzt. Die drei anderen Defekte wurden entweder mit Biozement D, mit Biozement D/Kollagen-I-Gemisch oder Biozement D/Kollagen-I/Chondoitinsulfat-Gemisch gefĂŒllt. Alle drei Knochenersatzmaterialien basierten auf einem pastösen Hydroxylapatit-Zement-Gemisch. Die Versuchsauswertung erfolgte mittels histologischer Imageanalyse am unentkalkten Trenn-DĂŒnnschliffprĂ€parat. Alle zehn Tiere konnten nach komplikationsloser Einheilung nach drei Monaten einer histomorphometrischen Bewertung zugefĂŒhrt werden. Der intraoperationem aushĂ€rtende Hydroxylapatit-Kollagen-I-Chondroitinsulfat-Zement zeigte osteokonduktive Materialeigenschaften. Die vom Defektrand ausgehende Resorption und knöcherne Substitution gestaltete sich auĂerordentlich rasch. Nach 3-monatiger Einheilzeit konnte bei Zweidrittel der DefektflĂ€che ein knöchernes Remodeling nachgewiesen werden. Schlussfolgerungen: Der neu entwickelte Hydroxylapatit-Kollagen-I-Chondroitinsulfat-Zement eignet sich als Knochenersatzmaterial am Tiermodell. Diese Schlussfolgerung basiert sowohl auf seiner guten knöchernen Integration und Resorption als auch durch seine gute Applizierbarkeit intra operationem. Der Zusatz von Chondroitinsulfat und Kollagen Typ I zu Calciumphosphatzementen fĂŒhrt zu einer statistisch signifikanten Steigerung des Knochenumbaus und der Knochenneubildung. Die vorliegenden Versuche belegen, dass durch Zugabe von Komponenten der extrazellulĂ€ren Matrix wie Chondroitinsulfat die osteogene Potenz von Knochenersatzstoffen weiter gesteigert werden kann.
Beim Typ-1 Diabetes handelt es sich um eine multifaktorielle Autoimmunerkrankung, die auf dem Zusammenspiel genetischer, immunologischer und umweltbedingter Faktoren beruht. Hilfreich bei der Identifizierung krankheitsassoziierter Genloci sind diverse Tiermodelle, bei denen durch Kreuzungsstudien kongene Linien mit spontanen Rekombinationen im Bereich diabetes-suszeptibler oder diabetes-resistenter Genloci entstehen. Ein âProduktâ solcher Kreuzungen ist die homozygote BB.6S m Rattenlinie, die obwohl TrĂ€ger der diabetogenen Iddm1 und Iddm2 Genloci, nur eine T1D-Inzidenz von 10 % aufwies. Ursache fĂŒr den diabetes-protektive Effekt war der alleinige chromosomale Austausch des diabetogenen Iddm4 Bereiches auf Chromosomen 6 der BB/OK Ratte durch den einer mĂ€nnlichen, diabetes-resistenten SH Ratte. Innerhalb dieser Arbeit sollten daher folgende Fragestellungen geklĂ€rt werden. 1. Ist die Iddm4 vermittelte Reduktion der Diabetesinzidenz auf die Expression eines oder mehrere potentieller diabetes-protektiver Gene zurĂŒckzufĂŒhren? 2. Wird das T1D Risiko durch den in diesem Bereich liegenden Imprintinglokus Dlk1-Dio3 beeinflusst? Zur Beantwortung dieser Fragen wurde eine zweite kongene Rattenlinie generiert. Die BB.6S f Linie, deren Iddm4 Genlocus von weiblichen SH Ratten abstammte, zeichnete sich wie die BB.6S m durch eine massive Reduktion der T1D Inzidenz aus. Nur 13 % der BB.6S f Ratten entwickelten einen T1D. Bei der Analyse der Expression von Strukturgenen konnten keine einheitlichen Muster zwischen BB.6S m und BB.6S f Ratten im Bezug zu BB/OK Ratten detektiert werden. Erst die Analyse des Expressionsmusters von mikroRNAs, deren Gene im Iddm4 Bereich und hier insbesondere im Dlk1-Dio3 Gencluster lokalisiert sind, ergaben sich Hinweise auf die mikroRNAs mir-337, mir-345 und mir-299 als potenzielle Kandidaten fĂŒr einen T1D Schutz. Im zweiten Teil der Arbeit sollte geklĂ€rt werden, ob die T1D Inzidenz durch genomische PrĂ€gung der Gene des Dlk1-Dio3 Imprintingclusters beeinflusst wird: So sind auf dem vĂ€terlich vererbten Allel unter anderem die Gene Dlk1, Rtl1 und Dio3 aktiviert, wĂ€hrend bei mĂŒtterlicher Abstammung Gtl2 und mikroRNAs exprimiert werden. Zur KlĂ€rung dieser Fragestellung wurden heterozygote F1 Hybride aus den Kreuzungen (BB/OK x BB.6S m) und (BB.6S m x BB/OK) generiert. Die phĂ€notypischen Daten belegen, dass die heterozygoten Tiere in der Regel eine höhere T1D Inzidenz aufwiesen, die zusĂ€tzlich in AbhĂ€ngigkeit vom Geschlecht der Nachkommen und dem Vererbungsmuster zwischen 21 und 74 % variierte. Generell waren weibliche Nachkommen besser vor einem T1D geschĂŒtzt als mĂ€nnlichen Nachkommen. AuĂerdem zeigte sich, dass die T1D Inzidenz niedriger war, wenn das SHR Allels vĂ€terlicherseits vererbt wurde. Diese Sachverhalte deuten einerseits auf eine Interaktion des Iddm4 Bereichs von Chromosom 6 mit dem biallelischen X-Chromosom hin. Eine weitere Analyse der Dlk1 Expression belegt, dass es beim Fehlen des paternalen SHR Allels ĂŒberraschenderweise zu einer biallelischen Expression des Dlk1 Genes kommt. Dieser Effekt ist assoziiert mit dem Verlust der Iddm4 vermittelten T1D Protektion. Die Daten der vorliegenden Arbeit lassen zusammenfassend drei Aussagen zu. I. Es konnte unter Einsatz der beiden kongenen BB.6S Rattenlinien kein Gen identifiziert werden, das den durch den Iddm4 Bereich der SH Ratte vermittelten Diabetesschutz bewirkt. II. Die Diabetesinzidenz wird offensichtlich durch Interaktion zwischen Chromosom 6 und dem biallelischen X-Chromosom beeinflusst. III. Hier konnte erstmals tierexperimentell bestĂ€tigt werden, dass die Manifestation eines T1D durch Imprinting geprĂ€gt wird.
Zerebrale kavernöse Malformationen sind GefĂ€Ăfehlbildungen des menschlichen zentralen Nervensystems, die mit einer PrĂ€valenz von etwa 1:650 in der Bevölkerung auftreten und zu rezidivierenden Kopfschmerzen, KrampfanfĂ€llen und Gehirnblutungen fĂŒhren können. Diese LĂ€sionen treten sowohl sporadisch als auch als Konsequenz von erblichen Mutationen (familiĂ€re Kavernomatose) mit unvollstĂ€ndiger Penetranz und variabler ExpressivitĂ€t auf. Kausale Mutationen sind fĂŒr die Gene CCM1 ( KRIT1), CCM2 (Malcavernin) und CCM3 (PDCD10) beschrieben. Die vorliegende Dissertationsarbeit mit dem Titel âIdentifizierung und Charakterisierung eines neuen Kandidatengens fĂŒr kavernöse GefĂ€Ămalformationen des zentralen Nervensystemsâ hatte die Suche neuer CCM-assoziierter Gene und deren Beschreibung zur Aufgabe. Als Ausgangspunkt dienten fĂŒnf Indexpatienten aus der Kohorte Stahl et al. 2008, bei denen keine ursĂ€chliche Mutation in den bekannten CCM-Genen identifiziert werden konnte. Die Exomsequenzierung mittels SOLiDâą 5500XL ergab fĂŒr die vier isolierten und den familiĂ€ren Fall mehr als 210.000 Varianten. Nach Filterung und Priorisierung dieser VerĂ€nderungen wurden acht Kandidatengene definiert, von denen fĂŒnf mittels klassischer Sanger-Sequenzierung validiert werden konnten. Das vielversprechendste Kandidatengen, FAM222B (C17orf63), in dem 2012 keine Loss-of-function Mutationen bekannt waren und das fĂŒr ein Protein unbekannter Struktur und Funktion kodiert, wurde fĂŒr die weitere Charakterisierung ausgewĂ€hlt. ZunĂ€chst konnten durch einen Yeast Two-Hybrid Screen Interaktionspartner identifiziert werden, die sich in die bekannten CCM-Signalwege integrieren lieĂen. Funktionelle Studien mittels Morpholino- und TALEN-Technik im Zebrafischmodell und mit humanen Nabelschnurvenenendothelzellen zeigten jedoch keinen signifikanten Effekt von FAM222B auf die Angiogenese. Auch eine detaillierte Bewertung der Informationen, die erst Ende 2014 in der ExAC-Datenbank veröffentlicht wurden, spricht in Zusammenschau mit den experimentellen Daten eher dagegen, FAM222B als neues Kandidatengen fĂŒr die Entstehung von CCMs einzustufen. Parallel zu den funktionellen Studien wurde die Kohorte von Stahl et al. 2008 kontinuierlich erweitert. Bei den molekulargenetischen Analysen fanden sich mehr kausale Mutationen im CCM3-Gen als bisher angenommen. Ferner konnte gezeigt werden, dass rund ein Drittel der Probanden vor Erreichen des Erwachsenenalters und ein FĂŒnftel der MutationstrĂ€ger bereits vor dem 10. Lebensjahr erkranken.
Neurogenese in adulten Ratten ist vor allem in der Subventrikularzone und im Gyrus dentatus des Hippocampus aktiv und kann durch gezielte Aktivierung nach einem Schlaganfall zu einer verbesserten FunktionalitĂ€t fĂŒhren. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob auch in gealterten Ratten eine Stimulation der endogenen Neurogenese nach Schlaganfall die Erholung verbessert. Dazu wurde das Neurogenese-verstĂ€rkende Pentylentetrazol zum ersten Mal auf seine Wirkung nach Schlaganfall in einem gealterten Tiermodell untersucht. Dazu wurde in 12-Monate alten Sprague-Dawley-Ratten eine transiente fokale IschĂ€mie per Okklusion der mittleren Hirnschlagader (MCAO) ausgelöst und die endogene Neurogenese mit subkonvulsivem Pentylentetrazol verstĂ€rkt. Die funktionelle Erholung wurde mit mehreren Verhaltenstests ĂŒber einen Zeitraum von sieben Wochen ĂŒberwacht. Nach dem Ablauf des Ăberlebenszeitraums wurde von den gewonnenen Hirngeweben eine globale Genexpressionsanalyse vom Infarktareal sowie immunhistochemische FĂ€rbungen fĂŒr Zellproliferation und neuronale VorlĂ€uferzellen im Infarktgebiet und der ipsilateralen Subventrikularzone durchgefĂŒhrt. Die Verhaltenstests Acht-Arm-Labyrinth und SchrĂ€ge zeigten eine signifikant verbesserte Erholung bei Tieren mit postischĂ€mischer Pentylentetrazolbehandlung. Die immunhistochemische FĂ€rbung fĂŒr den Neurogenese-Marker Doublecortin ergab eine signifikante Steigerung der Neuroblastenanzahl in der Subventrikularzone. Im Infarktkerngebiet konnte signifikant mehr beta-3- Tubulin-positives axonales Aussprossen detektiert werden. Die globale Genexpressionsanalyse wies auf signifikante VerĂ€nderungen von Genen der Inflammationsreaktion und der Neurogenese hin. Insgesamt zeigen die vorliegenden Ergebnisse, dass eine postischĂ€mische Stimulation der Neurogenese mit Pentylentetrazol auf die funktionelle Erholung einen positiven Einfluss hat.
Die Auswirkungen eines abdominalchirurgischen Eingriffs auf das Immunsystem stellen im klinischen Alltag ein bedeutendes Problem dar. Ein operatives Trauma stört das Gleichgewicht des Immunsystems und verursacht eine Immundysfunktion. So ist die MortalitĂ€t einer postoperativ erworbenen Sepsis um ein Vielfaches höher als die einer spontan auftretenden. Deshalb sind dringend Modelle erforderlich, die es ermöglichen, die Mechanismen der postoperativen Immundysfunktion zu charakterisieren. Beim Intestinalen Manipulationsmodell (IMM), an der UniversitĂ€t Bonn ursprĂŒnglich als Ileusmodell konzipiert, wird bei eröffnetem Abdomen des Versuchstiers der Darm durch moderate Kompression manipuliert. Das simuliert die klinische Situation eines bauchchirurgischen Eingriffs. Unter der Fragestellung, ob sich IMM als Modell der postoperativen Immundysfunktion eignet, wurden verschiedene Parameter der systemischen Immunantwort untersucht. Um die Effekte durch die Manipulation des Darms darzustellen, verglichen wir verschiedene Schweregrade des operativen Traumas. In einem nĂ€chsten Schritt sollte geklĂ€rt werden, ob durch die Kombination IMM mit einem Sepsis-Modell, der problematische klinische Verlauf einer postoperativ auftretenden Sepsis simuliert werden kann. 1) Jede Form des chirurgischen Eingriffs fĂŒhrte zu einer Immundysfunktion. Dies konnte sechs Stunden postoperativ anhand einer erhöhten IL6-Konzentration im Serum, der supprimierten Sekretionsleistung stimulierter Splenozyten und einer Reduktion zirkulierender Lymphozyten gezeigt werden. Dabei war die Immunreaktion bei weitem nicht so schwer, dass eine gesteigerte Apoptoserate von Thymozyten beobachtet werden konnte. 2) Bei den genannten Effekten handelte es sich um weniger als drei Tage anhaltende PhĂ€nomene. Diese waren zudem abhĂ€ngig vom AusmaĂ des operativen Traumas, wie die protrahierte und verstĂ€rkte Zytokin-Sekretionsstörung stimulierter Splenozyten aus MĂ€usen mit dreimaliger Manipulation des Darms zeigte. 3) Die Ăberlebensrate einer postoperativ induzierten Sepsis war in den vor der Sepsisinduktion operierten MĂ€usen gegenĂŒber den zuvor nicht operierten erhöht. Weiterhin unterschieden sich die operierten Gruppen voneinander abhĂ€ngig vom Zeitpunkt der Sepsisinduktion. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass IMM wichtige Merkmale einer postoperativen Immundysfunktion nachstellen kann. ZusĂ€tzlich erfĂŒllt dieses Modell die Voraussetzungen, um die Auswirkungen einer postoperativ erworbenen Sepsis kĂŒnftig untersuchen zu können.
Das Pankreasadenokarzinom zeichnet sich durch aggressives Wachstum, frĂŒhe Metastasierung, spĂ€te Diagnosestellung und vermindertes Ansprechen auf zytostatische Therapien aus. Ziel der vorliegenden Arbeit ist zum Einen die Etablierung und Validierung eines Ganzkörper-Fluoreszenz-basierten Nachweises von Tumorwachstum und Metastasierung im Mausmodell als mögliche Basis fĂŒr darauf aufbauende prĂ€klinische Pankreaskarzinom-Studien. Zum Anderen werden Vor- und Nachteile im Vergleich zum Schnittbildverfahren eines 7-Tesla-Kleintier-MRT untersucht. Nach stabiler Transfektion der murinen Adenokarzinom-Zelllinie Panc 02 mit eGFP-, RFP- und Lumineszenz-Expressionsvektoren wurde deren Fluoreszenz-/Lumineszenz-, Proliferations- und Apoptoseverhalten in vitro evaluiert. Nach orthotoper Injektion in den Pankreaskopf wurde das Tumorwachstum und Metastasierungsverhalten in vivo ĂŒber einen Zeitverlauf von 21 Tagen mittels Ganzkörper-Fluoreszenz-Imaging und MRT untersucht. ErgĂ€nzend erfolgten im Anschluss entsprechende Analysen zu Proliferation und Apoptose in situ anhand der explantierten histologisch und immunhistochemisch aufgearbeiteten Organe. Die murine Panc 02 Adenokarzinom-Zelllinie konnte mit einer Proliferationsrate von 88,4 % bei 0 % Apoptose in vitro als besonders aggressiv wachsende Adenokarzinom-Zelllinie charakterisiert werden. Die Ergebnisse Ă€nderten sich auch in situ kaum. WĂ€hrend das Fluoreszenz-Imaging hochspezifisch, kostengĂŒnstig, untersucherunabhĂ€ngig und einfach auswertbar progredientes lokales Tumorwachstum mit deutlicher peritonealer Metastasierung nachweisen konnte, zeigte das MRT eine bessere anatomisch-topographische Auflösung ohne Interferenz mit Haut, Haaren und Narbengewebe bei jedoch geringerer SensitivitĂ€t und SpezifitĂ€t. Mit Hilfe der Fluoreszenz-Kryo-Histologie konnte anschlieĂend ein Tumornachweis bis auf Einzelzellebene erbracht werden. Zwischen den beiden bildgebenden Verfahren des Ganzkörper-Fluoreszenz-Imagings und MRTs konnte ein komplementĂ€res Bild aufgezeigt werden.
Eine Maximalkomplikation der Sepsis stellt das Multiorganversagen dar, welches mit dem Auftreten einer disseminierten intravasalen Koagulopathie (DIC) und gleichzeitig einem letalen Endpunkt assoziiert ist. Es gibt bisher keine wirksame Therapie, zuletzt scheiterte die Anwendung von aktiviertem Protein C (APC) in klinischen Studien. Es fehlt an geeigneten Tiermodellen, um die Grundlagen der Pathophysiologie der DIC zu verstehen. Die Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) stellt ein Modell der Schweren Sepsis dar. In der schweren Sepsis kommt es bei 37 % der Patienten zu einer DIC. Die klinischen Diagnosekriterien der DIC sollten im Mausmodell der CASP analysiert werden, um anschlieĂend Untersuchungen zur Bedeutung des CC-Chemokinrezeptors 4 (CCR4) auf Thrombozyten fĂŒr die DIC zu tĂ€tigen. Hierzu wurden zunĂ€chst durchflusszytometrische Untersuchungen zur Aktivierung des Thrombozyten in der Sepsis getĂ€tigt, welche zeigten, dass es zu einer vermehrten AusschĂŒttung von α-Granula im septischen Verlauf kam. Der Thrombozyt beteiligt sich anscheinend aktiv durch die AusschĂŒttung seines Sekretoms an den immunologischen VorgĂ€ngen einer Sepsis. ZusĂ€tzlich konnte mit molekularbiochemischen und proteinbiochemischen Methoden gezeigt werden, dass der Thrombozyt die FĂ€higkeit des SpleiĂens und der Proteinbiosynthese aus entwicklungsgeschichtlich jĂŒngeren Zeiten konservierte. Im Modell der CASP zeigte die Wildtyp-Maus eine signifikant erniedrigte Thrombozytenzahl, erniedrigte Fibrinogenplasmaspiegel, Thrombozytenablagerung in der Leber und eine verlĂ€ngerten extrinsische Gerinnungszeit. Diese Kriterien beschreiben das klinische Vorhandensein einer DIC. In den vergleichenden Untersuchungen des AusmaĂes der DIC der CCR4-defizienten Maus mit der Wildtyp-Maus konnten keine Unterschiede detektiert werden. Die CCR4-defiziente Maus hat einen Ăberlebensvorteil in der Sepsis trotz der klinischen Kriterien einer DIC. Sowohl der Fibrinogen-ELISA als auch die Immunfluoreszenzhistologien hatten methodisch bedingte SchwĂ€chen. Es bleibt jedoch festzuhalten, dass die vorgelegte Arbeit keinen negativen Einfluss des CCR4 auf die DIC detektieren konnte. Die Bedeutung der CCR4-vermittelten Aggregation des Thrombozyten fĂŒr den Organismus bleibt unklar. Festzuhalten ist, dass das CASP-Modell geeignet ist um das klinisch-analytische Bild einer DIC in der Schweren Sepsis zu untersuchen. Vor dem Hintergrund mangelnder realitĂ€tsnaher Tiermodelle leistet dies einen Beitrag fĂŒr weitere Forschung. Die Experimente zur mRNA-Regulation und Protein-Synthese bilden einen weiteren Baustein im VerstĂ€ndnis des Thrombozyten als kernlose Immunzelle. In ihrer Gesamtheit soll die vorgelegte Arbeit die Sichtweise auf Thrombozyten schĂ€rfen. Es handelt sich hierbei nicht um âMegakaryozytenzelltrĂŒmmerâ, deren Funktion ausschlieĂlich in der Blutgerinnung zu suchen ist. Vielmehr können Thrombozyten als eine Art Andenken an die Phylogenese des Immunsystems angesehen werden. DreiĂigmillionen Jahre Entwicklungsgeschichte sind zwischen dem Amöbozyten und dem Thrombozyten vergangen und haben ein breites Rezeptor- und Mediatorrepertoire erhalten. Ob diese dem Organismus im Falle einer Sepsis nutzen oder eher schaden bleibt zu klĂ€ren. Dass das Fehlen von Thrombozyten in bestimmten inflammatorischen Konstellationen einen Vorteil darstellt, ist auch fĂŒr die abdominelle Sepsis untersucht. Die Depletion von Thrombozyten erzeugt eine 60 %-ige Verringerung des zellulĂ€ren Ădems und des pulmonalen Schadens. In folgenden Untersuchungen soll das Modell der CASP genutzt werden um den Einfluss von Thrombozyten auf die DIC und das Ăberleben in der CASP zu untersuchen.
Tod kardiovaskulĂ€rer Ursache ist laut Statistiken der WHO zum Zeitpunkt dieser Arbeit wie auch in den Jahren zuvor die Haupttodesursache weltweit. Hypertension und konsekutive myokardiale Hypertrophie sind jeweils unabhĂ€ngige Risikofaktoren fĂŒr kardiovaskulĂ€re MortalitĂ€t. Im Umkehrschluss geht eine Reduktion myokardialer Hypertrophie mit einer verbesserten kardialen LeistungsfĂ€higkeit und gesteigerten Ăberlebensraten einher. In dieser Arbeit vorangegangenen Studien ergaben sich erste Hinweise, dass bestimmte Arzneistoffe unabhĂ€ngig von deren Wirkung auf den Blutdruck eine Regression myokardialer Hypertrophie erreichen können. Die vorliegenden Studien zeigten jedoch SchwĂ€chen in ihren Designs, insbesondere durch die Wahl der jeweils genutzten Hypertrophiemodelle. Zur Untersuchung Blutdruck-unabhĂ€ngiger Effekte auf die myokardiale Hypertrophie ist die Wahl des Hypertrophiemodells jedoch entscheidend. In der vorliegenden Arbeit konnte mit der cyp1a1ren-2 transgenen Ratte ein PhĂ€notyp von hohen Proreninspiegeln mit Bluthochdruck und kardialer Hypertrophie in vollstĂ€ndig reversibler Weise induziert werden. Mit der gewĂ€hlten Dosis von 0,167 % des zur Induktion des Transgens notwendigen sekundĂ€ren Pflanzenstoffs Indol-3-Carbinol ĂŒber eine Gabedauer von vier Wochen war es möglich, eine konzentrische Hypertrophie des linken Ventrikels mittels der MRT-Bildgebung dokumentiert zu induzieren. Die Hypertrophie wie auch die Hypertonie waren nach Ablauf der vierwöchigen Substitutionsdauer im Verlauf der folgenden Wochen der Untersuchung vollkommen reversibel. Im Gegensatz zu vorhergehenden Studien mit höheren Dosen von I3C ergab sich kein Hinweis auf einen bleibenden Endorganschaden, insbesondere war die kardiale Funktion unbeeintrĂ€chtigt. Ferner gestattet die in vivo-Bildgebung mit den Versuchstieren Langzeitstudien ĂŒber eine ausgedehnte Dauer, bei der im Gegensatz zu Versuchen ohne Bildgebungsverfahren keine Ergebnisse jeweils durch Sektion der Tiere erhoben werden mĂŒssen. Durch das bildgebende Verfahren wird demnach die Anzahl der notwendigen Versuchstiere erheblich reduziert. Zudem wird durch den Verzicht auf invasive MaĂnahmen bei den hinsichtlich der Hypertrophie im MRT untersuchten Tiere ein proinflammatorischer und konsekutiv potentiell die Untersuchungsergebnisse verfĂ€lschender Einfluss vermieden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auĂerdem eine Zeitfenster isoliert werden, in dem sich das Potential fĂŒr weitergehende Studien von Arzneistoffen hinsichtlich derer etwaigen Blutdruck-unabhĂ€ngigen antihypertrophen Wirkung auf das Myokard ergibt.
Sepsis zĂ€hlt zu den fĂŒhrenden Todesursachen in Deutschland und die optimale Blutzuckerkontrolle bei Sepsispatienten in Hinblick auf ein verbessertes Outcome ist immer wieder Gegenstand vieler klinischer Studien. In unserer gemeinsamen Arbeit untersuchten wir den Einfluss von Blutzuckerspiegel und Insulingabe auf die intestinale Mikrozirkulation im Rattenmodell unter EndotoxinĂ€mie. Als Sepsismodell diente die LPS-induzierte EndotoxinĂ€mie. Wir teilten die Versuchstiere zum einen in Gruppen mit niedrig dosierter Glukoseinfusion bzw. Placebogabe in Form von 0,9%iger Kochsalzlösung, in denen wir (hoch)normale Blutzuckerwerte zwischen 3-8 mmol/l messen konnten und zum anderen in Gruppen mit hoch dosierter Glukoseinfusion mit 2g/kg/h, wodurch wir hyperglykĂ€me Werte ĂŒber 10 (bis maximal 15) mmol/l erzielen konnten. Zu Beginn und am Ende des Experiments erfolgten jeweils eine arterielle Blutgasanalyse und Zytokinbestimmung (IL-1-alpha, MCP-1, TNF-alpha, IFN-gamma, GM-CSF, IL-4). Um die intestinale Mikrozirkulation beurteilen zu können, untersuchten wir mittels Intravitalmikroskopie zum einen die Leukozyten-Endothel-Interaktion in Form von âRollingâ und âStickingâ, zum anderen die Funktionelle Kapillardichte in den 3 Muskelschichten des terminalen Ileums. Wir konnten feststellen, dass Insulingabe sowohl bei niedrig - als auch hoch dosierter Glukoseinfusion die Anzahl an fest adhĂ€rierenden Leukozyten (âStickerâ) unter EndotoxinĂ€mie signifikant reduziert. Eine mögliche antiiflammatorische Wirkung. Ebenfalls zeigte sich eine deutliche Erholung der unter LPS-Einfluss verminderten Funktionellen Kapillardichte durch Insulin. IFN-gamma-, GM-CSF- und IL-4-Konzentrationen verringerten sich unter EndotoxinĂ€mie, wenn hochdosierte Glukoseinfusion appliziert wurde in Kombination mit - oder ohne Insulinbolus. Insgesamt sahen wir unter Insulineinfluss eine erhebliche Verbesserung der intestinalen Mikrozirkultion unter LPS-induzierter EndotoxinĂ€mie im Tiermodell. ZusĂ€tzlich verringerten sich die Konzentrationen obengenannter Zytokine unter HyperglykĂ€mie in unserem LPS-Sepsismodell. Ob diese VerĂ€nderungen durch erhöhte Insulinfreisetzung der Versuchstiere hervorgerufen wurden, lĂ€sst sich fĂŒr uns nicht klĂ€ren.
Die Neurotrophine (Nerve Growth Factor, Brain-derived Neurotrophic Factor, Neurotrophin-3 und Neurotrophin-4/5) zĂ€hlen zu den wichtigsten Wachstumsfaktoren des Nervensystems und sind von groĂer Bedeutung fĂŒr Gehirnentwicklung und neuronale PlastizitĂ€t. Sie vermitteln ihr Wirkungen ĂŒber zwei Rezeptorsysteme: Trk-Rezeptoren binden Neurotrophine spezifisch und mit hoher AffinitĂ€t. Sie aktivieren anti-apoptotische, wachstums- und differenzierungsfördernde Signalwege. Der niedrigaffine p75-Neurotrophinrezeptor (p75) hingegen kann Rezeptorkomplexe mit verschiedenen Ko-Rezeptoren und einer Vielzahl von Liganden bilden. Das Spektrum seiner möglichen Effekte ist beachtlich, wobei pro-apoptotische und wachstumshemmende Wirkungen ĂŒberwiegen. Interessanterweise kommt es bei einer Reihe von pathologischen Prozessen zu einer vermehrten Expression von p75, etwa bei Morbus Alzheimer, Amyotropher Lateralsklerose, Chorea Huntington und nach Gehirnverletzungen. Inhibitoren der pro-apoptotischen und wachstumshemmenden Wirkung bergen Potenzial fĂŒr die Therapie dieser Krankheitsbilder. Transgene p75-Knockout-Modelle sind ein wichtiges Instrument fĂŒr ein besseres VerstĂ€ndnis des Rezeptors. Aus den bisher vorliegenden Daten zu Morphologie und Verhalten solcher MĂ€use ergibt sich jedoch ein widersprĂŒchliches Bild. Im gesunden adulten Nervensystem wird p75 insbesondere durch cholinerge Neurone des basalen Vorderhirns (BFCN) exprimiert. In mehreren Studien wurde bei p75-defizienten MausstĂ€mmen eine Hypertrophie der BFCN und der cholinergen Innervation des Hippocampus beobachtet. FĂŒr ein weiteres wichtiges Zielgebiet von BFCN-Projektionen, die basolaterale Amygdala (BLA), liegen bisher jedoch keine Daten vor. Ein Ziel dieser Arbeit war daher die Erfassung der cholinergen Innervationsdichte dieses Kerngebiets bei jungen und gealterten p75-Knockout-Tieren und Vergleich mit den entsprechenden Wildtyp-Kontrollen. In allen Altersgruppen war bei p75-Defizienz eine erhöhte Faserdichte nachweisbar. Im Hippocampus unterliegen die cholinergen Neuriten bei Knockout-Tieren einer verstĂ€rkten Degeneration im Alter. Dieser Effekt trat in der BLA nicht auf. Da im adulten Hippocampus p75 physiologischerweise exprimiert wird, in der adulten Amygdala jedoch nicht, weist dies auf eine trophische Wirkung des Rezeptors fĂŒr hippocampale cholinerge Neurone hin, die vermutlich in Assoziation mit Trk-Rezeptoren vermittelt werden. Eine Testung höherer Verhaltensfunktionen bei p75-Defizienz erbringt Hinweise auf die funktionellen Auswirkungen der morphologischen VerĂ€nderungen. Bisherige Studien zeigen Abweichungen bei lokomotorischer AktivitĂ€t, Angstverhalten und rĂ€umlichem Lernen, sind jedoch im Detail widersprĂŒchlich. Geringe KohortengröĂen und ungenaue Angaben zur TestdurchfĂŒhrung schrĂ€nken die Aussagekraft teilweise ein. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher die PrĂŒfung dieser Verhaltensfunktionen bei p75-Defizienz mittels standardisierter Testmodelle unter Verwendung gröĂerer Testkohorten. Im Open Field-Versuch wiesen Knockout-Tiere eine erhöhte motorische AktivitĂ€t auf. Im Holeboard-Versuch zeigte sich jedoch keine begleitende Zunahme zielgerichteter Exploration. In der Dark/Light Box fiel ein signifikanter Gruppenunterschied im Einfluss der zirkadianen Rhythmik auf das Verhalten in diesem Testmodell auf. Dies erschwert die Testinterpretation, trĂ€gt jedoch auch zur ErklĂ€rung der Diskrepanzen in der Literatur bei. Im Morris Water Maze zeigten Knockout-Tiere deutliche Defizite beim rĂ€umlichen Lernen. Als Ursache der VerhaltensauffĂ€lligkeiten kommen VerĂ€nderungen des cholinergen Systems, der neuronalen PlastizitĂ€t und der zirkadianen Rhythmik in Betracht. Zudem sind VerĂ€nderungen weiterer Transmittersysteme wahrscheinlich. Die Untersuchung dieser Systeme und die DurchfĂŒhrung spezialisierter Verhaltenstests sind interessante Ansatzpunkte fĂŒr zukĂŒnftige Studien.
KardiovaskulĂ€re Erkrankungen gehören zu den Haupttodesursachen in der westlichen Bevölkerung. Die MorbiditĂ€t und MortalitĂ€t der Herzinsuffizienz und ischĂ€mischer Erkrankungen sind trotz vielfĂ€ltiger TherapieansĂ€tze weiterhin sehr hoch. Bei Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie (DCM) konnte hinsichtlich der Genexpression des Carnitin-Transporters OCTN2 eine deutliche Reduktion festgestellt werden. Diese korrelierte signifikant mit einer verminderten Ejektionsfraktion (EF) und stellt somit einen möglichen Risikofaktor fĂŒr die Entwicklung bzw. Progression einer DCM dar. Physiologisch ist die OCTN2-vermittelte Carnitin-Aufnahme von besonderer Bedeutung fĂŒr die Energiegewinnung der Zelle ĂŒber die Betaoxidation. ZusĂ€tzlich zu dieser endogenen Verbindung können jedoch auch zahlreiche Arzneistoffe, wie Mildronat, von OCTN2 transportiert werden und die Carnitin-Aufnahme hemmen. Ein Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es demzufolge, den Einfluss einer verminderten OCTN2-Funktion auf die Entwicklung einer DCM, anhand hĂ€modynamischer Analysen (MRT und Konduktanz-Katheter-Technik) zu ĂŒberprĂŒfen. DafĂŒr wurden MĂ€use, die homo- oder heterozygot eine Mutation im Octn2-Gen (Slc22a5) aufwiesen (sogenannte juvenile viscerale Steatose-MĂ€use) und entsprechende Kontrolltiere als Modell verwendet. Die heterozygot-defizienten Tiere unterschieden sich dabei sowohl hinsichtlich des Gehalts an freiem Carnitin im Serum und im Herzgewebe als auch hinsichtlich der hĂ€modynamischen Parameter (wie z. B. EF, LVRI und dP/dtmin) nur wenig von den Kontrollen. Die Modulation des Carnitin-Spiegels durch pharmakologische Intervention mit Mildronat ging zwar mit einer Verminderung des Carnitin-Spiegels einher, resultierte jedoch nicht in einer pathophysiologisch verĂ€nderten Herzfunktion. Interessanterweise deuten einige kardiale und molekularbiologische Parameter (wie z. B. EF und NT-proBNP-Gehalt) unter Hemmung des OCTN2 tendenziell sogar auf eine leicht verbesserte Herzfunktion hin. AuĂerdem wurde in diesem Tiermodell auch der Einfluss der OCTN2-Funktion und damit der Carnitinversorgung fĂŒr das AusmaĂ der GewebeschĂ€digung beim akuten Myokardinfarkt untersucht. Diese Untersuchungen zeigten ebenfalls keine negativen Auswirkungen bei verminderter OCTN2-Funktion. Sie sprachen im Gegenteil fĂŒr eine protektive Wirkung eines reduzierten Carnitin-Spiegels hinsichtlich IschĂ€mie-bedingter kardialer SchĂ€digungen. So zeigte sich ein deutlicher Gendosis-Effekt hinsichtlich Carnitin-Spiegel und Infarktareal, der durch Carnitin-Applikation teilweise wieder aufgehoben werden konnte. Insgesamt ist aus den Untersuchungen zur kardialen Bedeutung von OCTN2 hervorgegangen, dass eine moderate BeeintrĂ€chtigung der Transportfunktion und damit der Carnitin-Spiegel keinen negativen Einfluss auf die Herzfunktion besitzt.
