Doctoral Thesis
Die Sepsis (Typ B) als Folge des regelhaft auftretenden postoperativen Immundysfunktions-syndroms ist prognostisch als besonders ungünstig einzustufen und ein immer noch schwer beherrschbares Problem auf chirurgischen Intensivstationen. Eine adäquate Therapie ist vor diesem Hintergrund unbedingt erforderlich. In diesem Kontext war es das Ziel, den Einfluss von R-848 als synthetischen TLR7-Agonisten in murinen Sepsismodellen zu untersuchen und nähere Aussagen über die Expression von TLR7 in der murinen Sepsis zu gewinnen. Methodisch wurde die 16G-CASP als endogenes und die i.v.-Infektion mit Burkholderia pseudomallei als exogenes Sepsismodell verwendet. Sowohl immunhistochemisch als auch auf molekularer Ebene (mRNA) konnte eine schwache Expression von TLR7 in nativen murinen Milzmakrophagen, B-Zellen und plasmazytoiden dendritischen Zellen und im Verlauf der Sepsis eine Hochregulation dieses Rezeptors gezeigt werden. Ex vivo wurde der Nachweis erbracht, dass R-848 in vergleichbarem Maße wie LPS pro- und antiinflammatorische Zytokine induziert. Eine immunstimulatorische Potenz des TLR7-Agonisten konnte in der nativen Maus anhand von Analysen der Zytokine nach Gabe von R-848 in vivo gezeigt werden. TLR7-Stimulation ändert den Ablauf der Sepsis in vivo, was zunächst im CASP-Modell untersucht wurde. Die Überlebenskinetik zeigte einen Trend zur Mortalitätsreduktion nach R-848-Vorbehandlung. Unter Burkholderieninfektion konnte eine signifikante Verlängerung des Überlebens ebenfalls ermittelt werden. Um diesen Unterschied erklären zu können, wurden als nächstes die bakterielle Belastung und Zytokinspiegel verschiedener Kompartimente unter TLR7-Stimulation 12 und 20 Stunden nach CASP analysiert. Bei tendentiell gegenläufigem Zytokinprofil zeigte sich die Bakterienzahl unter R-848-Stimulation sowohl im Peritoneum, als auch in der Milz signifikant gegenüber der Kontrolle abgesunken. R-848 konnte in vorinfizierten RAW-Makrophagen die Phagozytoserate gegenüber der physiologischen Kontrolle steigern, zeigte jedoch keinen Unterschied bei nicht-infizierten Makrophagen. In einem Replikations- und Invasionsassay fand sich die intrazelluläre Keimzahl unter R-848-Stimulation um 50 Prozent nicht signifikant abgesunken. Septische Apoptoseraten korrelieren mit dem Schweregrad des Sepsisverlaufs. Der protektive Einfluß von R-848 konnte anhand eines signifikanten Rückgangs der Apoptoserate in immunologisch bedeutenden Organen gezeigt werden. TLR7 als primär für die Virusabwehr bekannter Mustererkennungsrezeptor kann demnach auch in systemischen bakteriellen Infektionen ein mögliches Ziel immuntherapeutischer Interventionen sein, was weitergehend untersucht werden sollte.
Die optimale Behandlung von Patienten mit einer akuten Pankreatitis hängt stark von der frühen Prognose des Verlaufs der Erkrankung ab. In 80% der Fälle verläuft die akute Pankreatitis mild und die Patienten verlassen innerhalb einer Woche beschwerdefrei das Krankenhaus. Bei. 20% der Patienten nimmt die Erkrankung einen schweren Verlauf mit Komplikationen wie z.B. SIRS, Sepsis. Diese Patienten entwickeln (infizierte) Pankreasnekrosen, (Multi)-Organversagen und benötigen eine intensivmedizinische Betreuung. In 10-20% endet die schwere akute Pankreatitis tödlich. Bis zum jetzigen Zeitpunkt gibt es keine validen Marker die zuverlässig den Schweregrad der akuten Pankreatitis vorhersagen. Mustererkennungsrezeptoren sind Teil des angeborenen Immunsystems und dienen als Sensoren für pathogen bakterielle Bestandteile. Nach Erkennen der Bakterien werden pro- und anti-inflammatorische Immunantworten eingeleitet, die für die Eliminierung der Bakterien zuständig sind. Zur Familie der Mustererkennungsrezeptoren gehören u.a. die Toll-like Rezeptoren und die Nod-like Rezeptoren. Viele Studien konnten Assoziationen zwischen Mutationen in Mustererkennungsrezeptoren und immunologischen Erkrankungen aufzeigen. Die am besten untersuchten Assoziationen sind die zwischen Morbus Crohn und Mutationen in Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) oder Nod-like Rezeptor 2 (NOD2). Mutationen in diesen Rezeptoren führen zu einem Funktionsverlust der Rezeptoren und verhindern eine effektive Eliminierung von Bakterien. Dadurch wird z.B. die entzündliche Darmerkrankung Morbus Crohn begünstigt. Während der akuten Pankreatitis, einer primär sterilen Inflammation, bilden sich bei einem schweren Verlauf, durch in das Pankreas translozierende Darmbakterien, (infizierte) Pankreasnekrosen. Die Annahme, dass ein Funktionsverlust der Mustererkennungsrezeptoren TLR4 oder NOD2 den Schweregrad der akuten Pankreatitis und das Ausbilden infizierter Pankreasnekrosen beeinflusst, sollte in dieser Arbeit sowohl bei Patienten mit akuter Pankreatitis als auch im Tiermodell der Nod2-knock-out Maus überprüft werden. Mutationen im Toll-like Rezeptor 4 wurden in dieser Arbeit weder als Risikofaktoren für die akute Pankreatitis, noch den Schweregrad der akuten Pankreatitis oder das Überleben identifiziert. Wir detektierten in Patienten mit akuter Pankreatitis und gesunden Blutspendern für die TLR4 Mutationen Asp299Gly und Thr399Ile vergleichbare Allelfrequenzen. Anders verhielt es sich für die Mutationen im Nod-like Rezeptor 2. Die Mutation Arg702Trp dieses Mustererkennungsrezeptors konnte als ein Risikofaktor für eine erhöhte Mortalität bei Patienten mit einer schweren akuten Pankreatitis identifiziert werden. Wir können zeigen, dass sich das Risiko, an einer schweren akuten Pankreatitis zu versterben bei heterozygoten Mutationsträgern auf 2,5 und bei Homozygoten auf das 9-fache erhöht. Mutationen in Arg702Trp führten allerdings nicht vermehrt zur Entwicklung von Sepsis oder (infizierten) Pankreasnekrosen. Lediglich die Häufigkeit ein Multiorganversagen zu entwickeln, war bei Mutationsträgern signifikant erhöht. Die beiden anderen untersuchten NOD2 Mutationen (Gly908Arg und Leu1007fsinsC) hatten keinen signifikanten Effekt auf die Entwicklung einer akuten Pankreatitis. Untersuchungen der Rolle einer Nod2-Defizienz im experimentellen Mausmodell der schweren nekrotisierenden Pankreatitis zeigten einen im Vergleich zum Menschen unterschiedlichen Phänotyp hinsichtlich des Verlaufs der schweren akuten Pankreatitis. Die lokalen Schäden am Pankreas, aber auch die systemischen Reaktionen waren in den ersten 36h nach Induktion der nekrotisierenden Pankreatitis nicht wesentlich verändert. Das Langzeitüberleben (14 Tage) der Nod2-defizienten Mäuse war jedoch deutlich verbessert. Wir stellten in den Nod2 knock-out Tieren sowohl eine persistierende intestinale Barrierestörung, als auch eine epitheliale Barrierestörung der Lunge fest. Als Konsequenz war bereits in den unbehandelten Nod2-defizienten Tiere eine erhöhte bakterielle Translokation und eine erhöhte Neutrophilentransmigration ins Gewebe sichtbar. Durch die Barrierestörungen entwickeln die Nod2 knock-out Mäuse eine Toleranz gegenüber den infiltrierenden Bakterien. Diese Toleranzentwicklung kommt 48h nach Induktion der Pankreatitis zum Tragen. Zu diesem Zeitpunkt stellt sich bei den Nod2-defizienten Mäusen ein hypoinflammatorischer Zustand ein. Im Vergleich dazu verstarben die Wildtyp-Mäuse an den Folgen sekundärer Infektionen und einem daraus resultierenden Organversagen. Die NOD2 Mutation Arg702Trp ist somit ein Risikofaktor und potentieller genetischer Prognosemarker für eine erhöhte Mortalität in Folge einer schweren akuten Pankreatitis. Der Funktionsverlust von NOD2 beeinflusst den systemischen Verlauf der schweren akuten Pankreatitis und trägt zu einer deregulierten inflammatorischen Antwort und verschlechterten bakteriellen Kompensation bei. Der lokale Schaden am Pankreas während der schweren akuten Pankreatitis ist dagegen vergleichbar zwischen Patienten mit und ohne NOD2 Arg702Trp Mutation. Ursächlich für das bessere Überleben der NOD2 knock-out Mäuse ist vermutlich die induzierte Barrierestörung, die eine bakterielle Toleranz in diesen knock-out Mäusen induziert. Dadurch wird unter schwerer akuter Pankreatitis eine Entgleisung des Immunsystems verhindert und die bakterielle Translokation in die Organe deutlich effizienter kompensiert. Vergleichende Untersuchungen mit einem knock-out/knock-in Model der NOD2 Mutation Arg702Trp könnten dazu beitragen den Pathomechanismus dieser spezifischen NOD2-Mutation im Menschen weiter aufzuschlüsseln.
Zusammenfassung: Heparin ist ein häufig verwendetes Medikament, das zur Prophylaxe und Therapie von Thrombosen eingesetzt wird. Eine unerwünschte Nebenwirkung des Heparins ist die Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT), die paradoxerweise mit potentiell lebensbedrohlichen arteriellen und venösen Gefäßverschlüssen assoziiert ist. Die Erkrankung wird durch die Bil-dung von Thrombozyten-aktivierenden Antikörpern der Klasse Immunglobulin G (IgG) aus-gelöst. Diese sind gegen Komplexe aus dem Thrombozytenprotein Plättchenfaktor 4 (PF4) und Heparin gerichtet. Die zugrunde liegende B-Zell-vermittelte Immunität entspricht nicht der klassischen Immunantwort und führt zu einer frühzeitigen und transienten Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern der Klassen IgM und IgG. In der vorliegenden Arbeit wurden die B-Zellen, die an der Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern beteiligt sind, identifiziert. Hierfür wurden die Mäuse systemisch mit PF4/Heparin-Komplexen immunisiert. Das Vorliegen einer Immunantwort wurde durch den Nachweis der Antikörperproduktion mittels eines neu entwickelten Fluid-Phase ELISA nach-gewiesen. Der Einsatz von rekombinanten Maus-PF4/Heparin-Komplexen zeigte, dass die beim Menschen für die HIT charakteristisch frühe und transiente Antikörperproduktion auch im Mausmodell auftritt. Diese Immunantwort war spezifisch für PF4/Heparin-Komplexe und konnte nicht durch andere unspezifische Reize wie ein Gewebetrauma oder dem Modellanti-gen Ovalbumin ausgelöst werden. Der Nachweis der anti-PF4/Heparin-Antikörper-sezernierenden B-Zellpopulation(en) wurde durch die Etablierung des Zell-spezifischen Enzym-gekoppelten Immun-Spot Tests (ELISPOT) auf der Fluid-Phase Basis – Detektion der PF4/Heparin-Antikörper-Komplexe in der löslichen Phase – ermöglicht. Unterschiedliche Gewebe/Kompartimente (Milz, Knochen-mark, Peritonealhöhle) von naiven, nicht-immunisierten und PF4/Heparin-immunisierten Mäusen wurden mit diesem Assay auf das Vorliegen von PF4/Heparin-spezifischen B-Zellen untersucht. Während in nicht-immunisierten Mäusen ausschließlich B-Zellen nachgewiesen werden konnten, die anti-PF4/Heparin-Antikörper der Klasse IgM produzierten, wurden in immunisierten Mäusen sowohl kurzlebige PF4/Heparin-spezifische IgM (7%)- als auch IgG (25%)-sezernierende B-Zellen detektiert. Die spezifischen Zellen befanden sich in beiden Fällen in der Milz. Dieses Gewebe dient als Nische für follikuläre, Marginalzonen (Mz)- und B1-B-Zellen, wobei sie im Fall der Mz-B-Zellen die einzige Überlebensnische darstellt. Den Hauptanteil der Antikörper-produzierenden Milzzellen bilden die follikulären B-Zellen, deren Antikörperproduktion T-Zell-abhängig ist. Als Hauptquelle der anti-PF4/Heparin-Antikörper konnte diese Zellpopulation ausgeschlossen werden, da T-Zell-defiziente Mäuse nach der Behandlung mit PF4/Heparin weiterhin spezifische Antikörper produzierten. Normale Mäuse, denen vor der PF4/Heparin-Behandlung die Milz und somit die Mz-B-Zellen operativ entfernt wurden, konnten hingegen keine anti-PF4/Heparin-Antikörper mehr bilden. Dies zeigt, dass B1-Zellen allein nicht ausreichend sind, um die anti-PF4/Heparin-Antikörperproduktion zu induzieren, und dass Mz-B-Zellen für die Immunantwort notwendig sind. Der Mechanismus, der die Aktivierung der PF4/Heparin-spezifischen Mz-B-Zellen auslöst, ist bisher nicht im Detail bekannt. Jedoch konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die in vitro Stimulation von B-Zellen mit Mitogenen wie CpG und SAC antigenunabhängig zur Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern führt. Dies lässt vermuten, dass neben dem Kontakt mit dem Antigen auch andere immunstimulatorische Faktoren in die Induktion der Immunantwort gegen Maus-PF4/Heparin-Komplexe involviert sind.
