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Im Jahr 2020 wurden die 50-häufigsten Operationen insgesamt 15.823.464-mal durchgeführt und das entspricht rechnerisch ca. einer Operation auf fünf Einwohnern in Deutschland. Bei jeder dieser Operationen ist die Blutungsstillung eine therapeutische Notwendigkeit. Intraoperativ wird dafür häufig die Elektrokauterisierung verwendet, die aber mit einem Risiko der Nachblutung, Perforation und Gewebezerstörung einhergeht. Eine neue Variante zum Blutungsmanagement kann kaltes physikalisches Plasma (Gas-Plasma) darstellen. Dies ist ein energiereiches Gas, welches durch verschiedene Mechanismen, wie Temperatur, angeregte chemische Spezies, UV- und Wärmestrahlung, wechselwirkt. Es wurden in-vitro Untersuchungen an menschlichem Blut durchgeführt, um einen Wirkungsmechanismus von Gas-Plasma zu demaskieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, dass ein Großteil der Thrombozytenaktivierung durch Gas-Plasma (ca. 55 %) auf eine Lyse der Erythrozyten zurückzuführen ist. Die Hämolyse wurde spektroskopisch nachgewiesen und in Abhängigkeit von der Behandlungszeit quantifiziert. Die Thrombozyten reagieren mit einer PI3K/Akt/p38-vermittelten Signalkaskade, welche schließlich zu deren Aktivierung führt. Bei der Signaltransduktion wurde eine Bedeutung von intrazellulären ROS und eine Hyperpolarisation der Mitochondrien der Thrombozyten festgestellt. Die Signaltransduktion kann über den Einfluss von ADP auf den P2Y12-Rezeptor erklärt werden. Es wurde ein auf künstliche Intelligenz basierender Auswertungsalgorithmus angewandt, welcher den Nachweis von vermehrten Thrombozytenaggregaten nach Applikation von Gas-Plasma erbrachte. Gas-Plasma wirkt über eine Vielzahl an reaktiven Spezies und ein alleiniger Einfluss von Wasserstoffperoxid, hypochloriger Säure und Superoxidanionen scheint unwahrscheinlich. Die Erklärung der Hämolyse wurde auf Singulett-Sauerstoff und Ozon zurückgeführt. Daneben kann NO direkt auf Thrombozyten wirken. Es wurde die erste Messung der oberflächlichen Temperatur einer Flüssigkeit bei Behandlung mit Gas-Plasma vollzogen. Dabei wurde eine geringe Änderung der Temperatur festgestellt. Weiterhin wurde der Einfluss der Evaporation als gering gewertet. Da die Anwendung von Gas-Plasma körpereigene Gerinnungsmechanismen beschleunigt, desinfizierend wirkt und nebenwirkungsarm ist, besitzt Gas-Plasma großes klinisches Potential im Bereich der chirurgischen Blutgerinnung.
Das Afrikanische Schweinepestvirus (ASPV) ist ein wirtschaftlich wichtiger und in Haus- und Wildschweinen Hämorrhagie mit hoher Sterblichkeitsrate verursachender viraler Erreger.
1921 erstmals in Kenia beschrieben, breitete sich die ASP seit 2007 auch über den
Kaukasus, ins Baltikum (2014), weiter in europäische und asiatische Länder und seit 2020 in Deutschland aus. Trotz der hohen genetischen Stabilität des Afrikanischen
Schweinepestvirus (ASPV) wurden Genomvarianten identifiziert, bei denen Unterschiede
in der Genexpression von Multigenfamilien (MGF) dominieren. Letztlich divergieren ASPV-Stämme in ihrer Virulenz und verursachen akut-letale bis chronische Verläufe im Schwein. Aufgrund der enormen Komplexität des Virus und seiner vielfältigen
Immunevasionsstrategien sind viele Mechanismen der Virus-Wirts-Interaktion, die zur
Immunpathogenese beitragen, nicht ausreichend verstanden und erschweren somit die
Impfstoffentwicklung. Dabei können virale Subversionsmechanismen der Wirtszelle die
antivirale Immunantwort modulieren und stehen deshalb im Fokus dieser Arbeit. Zur
Charakterisierung und mechanistischen Aufklärung dieser ASPV-spezifischen
Immunsubversionsmechanismen wurden primäre porzine Monozyten von Hausschweinen
mit hochvirulentem (Armenia) und natürlich-attenuiertem (Estonia) ASPV infiziert. Die
Resultate ergaben sowohl stammunabhängige als auch -abhängige Unterschiede in der
Regulation myeloider Oberflächenmarker infizierter Monozyten. Insbesondere
beobachteten wir eine stammunabhängige Suppression des Phagozytose-regulierenden
CD172a und eine stammabhängige Regulation von porzinem MHC I (SLA I). Weitere
Experimente zur Untersuchung der zugrundeliegenden Mechanismen ergaben, dass zwar
beide Stämme die Oberflächenexpression von CD172 unterdrücken, jedoch nur Armenia-,
im Gegensatz zu Estonia-infizierten Monozyten, eine reduzierte Recyclingrate sowie eine Abspaltung (Shedding) von CD172a von der Zelloberfläche zeigten. Dies lässt vermuten, dass die Virus-vermittelte Suppression von CD172a der beiden ASPV-Stämme auf unterschiedlichen Subversionsmechanismen beruht. Reinfektionsexperimente und
molekularbiologische Untersuchungen belegten zudem, dass das abgespaltene
Oberflächen-CD172a der Armenia-infizierten Monozyten mit einer gesteigerten
Infektionsrate einhergeht, dies ist wahrscheinlich das Ergebnis (entweder direkt oder indirekt) einer Komplexbildung zwischen dem virulenten Armenia-Virus und löslichem
CD172a. Im Gegensatz dazu resultierte die Infektion von Monozyten mit Armenia, jedoch nicht mit Estonia, in einem deutlichen Oberflächenverlust von porzinem SLA I, welches für die Antigenpräsentation gegenüber CD8+ T-Zellen essentiell ist. Weitere Versuche zeigten einen Reifungsdefekt von SLA I, der mit dem Abbau funktioneller ER-Strukturen und der Induktion von ER-Stress in Armenia-infizierten Monozyten in Zusammenhang stand. Gleichzeitig wurde eine deutlich reduzierte Überlebensfähigkeit Armenia-infizierter Monozyten beobachtet, die mit einem Verlust mitochondrialer Funktionen und der Bildung von Aggresomen aus fehlgefalteten Proteinen im Zytoplasma einherging. Vertiefende Analysen dazu zeigten einen Caspase-3 aktivierten Zelltodmechanismus und ein infektionsbedingtes, progressives Abschalten der Proteintranslation in Armenia-infizierten Zellen. Um einen möglichen Zusammenhang zwischen den beobachteten
Subversionsmechanismen und der Expression bestimmter viraler MGF-Gene zu finden,
wurden weitere ASPV-Stämme in die Untersuchungen zur CD172a- und SLA I-Oberflächenexpression einbezogen. Ähnlich wie Armenia zeigte sich auch für die Stämme
NHV und OURT88/3 eine deutliche Reduktion der SLA I-Oberflächenlevel, auch wenn diese
in vivo gering-virulent sind. Andererseits zeigte das hochvirulente Benin97/1-Isolat im Gegensatz zu Armenia keine SLA I-Subversion, sondern ähnlich wie nach Estonia-Infektion kaum veränderte SLA I-Level, was vermuten lässt, dass der SLA I Subversionsmechanismus nicht alleinig den Virulenzgrad der ASPV-Stämme bestimmt. Ein direkter Genomvergleich identifizierte verschiedene Mitglieder der MGF110- und MGF505-Gene als möglicherweise beteiligte virale Genkandidaten. Im Gegensatz hierzu ergaben sich keine detektierbaren Unterschiede bei den Analysen zur Oberflächensuppression von CD172a innerhalb der verwendeten Isolate, wie bereits bei Armenia und Estonia Infektion beobachtet. Interessanterweise beobachteten wir dabei das Vorhandensein von MGF110-14 als eine genomische Gemeinsamkeit, die für die generelle Oberflächenreduktion von CD172a, zusätzlich zu anderen Genen, die ein Shedding und die Armenia-spezifische Interaktion bestimmen könnten, verantwortlich sein könnte.
Insgesamt zeigen die Resultate dieser Arbeit erstmals, dass das virulente ASPV Armenia, anders als das attenuierte ASPV Estonia, einen ausgeprägten Funktions- und Vitalitätsverlust in seinen primären Zielzellen (z. B. Monozyten) bewirkt. Die gesteigerte Infektiosität, Induktion von zellulärem Stress und Beeinträchtigung der SLA I-vermittelten Antigenpräsentation werden in infizierten Schweinen eine entscheidende Rolle in der Virus-Verbreitung und der Immunevasion spielen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Befunde dieser Arbeit neue und vertiefte Einblicke in die zellulären Mechanismen der SLA I- und CD172a-Subversion im Zusammenhang mit der Immunevasion durch hoch-virulentes ASPV Armenia und attenuiertes ASPV Estonia gibt und zudem wichtig für das bessere Verständnis der ASP-Immunpathogenese sind.
Viral diseases are a threat to bacteria and enormous animals alike. Vaccines are available against several viruses. However, for some viruses, like ASFV, we still lack vaccines, while for others, like IAV, they are not as effective as we need them to be. To a large extent, this is because we do not fully understand the mechanisms conferring antiviral immunity. To improve our understanding of antiviral immunity, we used a model species that is in many immunological aspects closer to humans than the widely used laboratory mice, pigs. In this thesis, pigs were investigated as a potential biomedical model species for viral respiratory infections in humans and as a natural host for viral infections. Both approaches provide valuable insights into aspects of porcine immunology that can either be used as the foundation for translational research or for the design of targeted therapeutics and vaccines for pigs.
Insights into fundamental characteristics of the porcine immune system form the basis for translational studies. Paper I pioneered a detailed characterization of porcine iNKT cells. To make pigs and porcine iNKT cells more available for scientific investigations, we established multicolor flow cytometry analysis platforms that allow for a more detailed investigation of these cells than previously possible. We found porcine iNKT cells circulating in peripheral blood to be a rare population among CD3+ lymphocytes that displays a pre-activated effector state and can be divided into at least three functional subsets. Upon antigenic activation, they proliferated rapidly, secreted pro-inflammatory cytokines, and exerted cytotoxicity. Moreover, we provided first evidence for a role of iNKT cells in porcine IAV and ASFV infections, which we investigated in more detail in paper IV. Central characteristics, i.e., phenotype and functional properties, exhibit a high degree of similarity between humans and pigs. Moreover, differences between human and murine iNKT cells are more pronounced than between humans and pigs.
Based on the results obtained in paper II, the established biomedical model could be used for further studies of infectious respiratory diseases. IAV infections pave the way for secondary co-infections with increased morbidity and lethality. These bactoviral co-infections are a threat to both pigs and humans. The shared susceptibility as well as homologies on the physiological and immunological level make pigs exceptionally suitable animal models for studies of these infections. Paper I and II can also be interpreted under translational aspects. Activation of iNKT cells in porcine vaccination studies showed promising results. Based on these and our findings, this might be a suitable approach for humans as well. Along with other studies, our results suggest that pigs might be a well-suited large animal model for research in infectious diseases. This is true especially for respiratory infections, such as seasonal IAV infections, for which pigs are natural hosts and contribute to viral spread and emergence as “mixing vessels”, which can result in pandemic strains like H1N1pdm09. We could show that porcine iNKT cells as well as the antiviral responses of cTC against H1N1pdm09 in pigs are comparable to human cells and processes. The increased implementation of pigs in basic and applied research might enable an improved translation of scientific knowledge to human and veterinary medicine.
In two further studies, papers III and IV, we investigated T-cell responses during a viral infection, ASF, for which pigs are the only natural hosts. Immune responses were similar after highly and moderately virulent ASFV infection in domestic pigs and wild boar, respectively. However, they differed between both species. Antiviral immunity in domestic pigs was predominantly exerted by αβ T cells, CD8α+ and DP αβ T cells, while the response in wild boar was dominated by γδ T cells, mainly CD8α+ effector cells. Since wild boar show a higher disease severity and lethality, even during infection with moderately virulent ASFV “Estonia2014”, a shift to γδ T cells seems to be detrimental. In contrast, domestic pigs survive infections with moderately virulent ASFV “Estonia2014”, which indicates that CD8α+ or DP αβ T cells confer protection at least in infections with non-highly virulent ASFV strains. Interestingly, in paper V we found higher and prolonged inflammation in domestic pigs, correlating with increased T-cell influx. However, histopathological analyses revealed no direct explanation for the differences in disease progression and lethality in domestic pigs and wild boar. These findings require further studies to elucidate the underlying mechanisms.
The lack of basic data about immunological differences between domestic pigs and wild boar hampers attempts to understand immunity against ASFV. We found differences between both suid subspecies already at steady state and even more prominent during ASFV infections in papers III-V. Most apparently, T-cell responses in wild boar were heavily biased towards γδ T cells, while immune responses in domestic pigs were based on αβ T cells. However, information about even basic characteristics, like the composition, phenotypes, and functional qualities of wild boar’s immune system, is missing. Therefore, essential baseline data must be obtained in order to adequately assess changes in future studies.
Analyses like these reveal major advantages of pigs as a biomedical model. On the one hand, similar to conventional model species, researchers can investigate every tissue at any desired time. Tissue from human patients is often scarce or not at all available, so models that can be investigated at specific times after infection are needed. On the other hand, results obtained in pigs are more comparable to humans than data from murine studies. Moreover, pigs are susceptible to similar pathogens as humans and experimental infections can be investigated without the need for major genetic manipulations. However, there are also limitations of the porcine model system. Analysis tools are not as advanced as they are for mice, especially in terms of availability of mAbs or genetically modified organisms. Still, given the major advantages that become more and more obvious, efforts should be made to make pigs more applicable for basic and translational research. In addition, findings derived from pigs can be used for the species itself. Pigs are a major livestock species and new treatments, or vaccines could also be used for them. Therefore, this research could eventually also improve animal welfare.
In summary, the presented thesis significantly enhanced our knowledge of porcine immune processes for cTC in general and iNKT cells in particular. Results were obtained both at steady state and in the context of IAV and ASFV infections, and thus, made pigs more available as a model for future research. The use of multicolor flow cytometry provided a broad overview of the ongoing immune reactions and enables further, more wide-ranging studies that can also address open questions in even more complex infection scenarios.
The focus of this thesis is the engineering and analysis of the enantioselectivity of esterases using 3-phenylbutyric acid (3-PBA) as model substrate. An ultra high throughput assay for identification of enantioselective esterases has been developed, based on the combination of in vivo selection and flow cytometry. The in vivo selection medium consists of a couple of pseudo-enantiomers of 3-PBA; one enantiomer is coupled to glycerol (GE), and hydrolysis of this substrate will enable cell survival. The other enantiomer is coupled to the toxin 2,3-dibromopropanol (BE), the hydrolysis of this substrate will cause cell death. Thus, cell survival is a function of the enantioselectivity of the enzyme expressed. The pseudo-enantiomeric substrates are structurally similar to allow selection for enantioselectivity instead of selection for enzyme substrate affinity. Next, esterase BS2 was chosen as negative control to establish the selection system since it hydrolyses both pseudo-enantiomers with low enantioselectivity (E~3 and 1, respectively). High enantioselective esterases towards 3-PBA: esterases PestE and CL1 (E > 100, both (R)-selective) were identified in a screening and used as positive controls. Further, the hyperthermophilic esterase PestE was crystallized. After elucidation of the enzyme structure, the high enantioselectivity of the enzyme towards 3-PBA could be explained by molecular modelling. The optimal concentration of the pseudo-enantiomeric substrates was set to be 5 mM for GE (higher concentrations were toxic) and 20 mM for BE (lower concentrations did not completely inhibit bacterial growth). The in vivo selection system was established together with the identification of a flow cytometric method to differentiate bacterial physiological status. The combination of Syto9 and PI was chosen as staining technique, because it allowed differentiation of the viable and the dead cell populations, and of these from the background. After viability detection by flow cytometry was established, esterases PestE and BS2 were cultivated in selection ((R)-GE and (S)-BE) and anti-selection medium ((S)-GE and (R)-BE). Clear differences in the culture viability depending on the enantioselectivity of the enzyme expressed appeared: cells expressing the (R)-enantioselective PestE could proliferate in selection medium, but could not proliferate in anti-selection medium. Cells expressing the non-selective BS2 did not grow in any media. Further, cultures containing mixtures of BS2/PestE or BS2/CL1 expressing cells were incubated in selection and anti-selection medium, and the viable clones were detected by flow cytometry analysis, sorted out and plated on agar. When the mixtures were incubated in selection medium, enrichment of the (R)-selective enzyme (PestE or CL1) over the non-selective enzyme (BS2) was observed. When the enzyme mixtures were incubated in anti-selection medium, very few colonies grew on agar, indicating that cell survival was a function of enzyme enantioselectivity. The successfully developed assay was used to identify variants with increased enantioselectivity in a mutant library of esterase PFEI (E ~ 3, (R)-selective) created by saturation mutagenesis. After library expression, 108 clones were in vivo selected and analyzed by flow cytometry. The viable cells were sorted out and plated on agar. The 28 resulting colonies were transferred to one microtiterplate and their activity and enantioselectivity (Eapp) was investigated using p-nitrophenyl derivatives. Four interesting mutants were identified: Table 1. Enantioselectivity of the in vivo selected mutants. Mutant Eapp[a]Etrue[b]Etrue[c]Etrue[d]Etrue[e] Mutations C4 80 4 4 3 1 V121I, F198G, V225A E7 >100 2 n.d. 3 n.d. V121S E8 2 25 16 50 >100 V121S, F198G, V225A F5 5 13 15 18 80 F121I, F198C [a] with separate (R)- or (S)-enantiomers of p-nitrophenyl-3-phenylbutanoate. [b] towards GE with cell lysate or [c] pure enzyme. [d] towards Et-3-PB with cell lysate or [e] pure enzyme. n.d. not determined. The mutants were purified and activity and enantioselectivity were determined in kinetic resolutions towards Et-3-PB and GE (Table 1). Mutants identified as highly enantioselective in the Eapp-assay (C4 and E7) were low selective in kinetic resolutions. On the contrary, mutants E8 and F5, which showed low enantioselectivity towards p-nitrophenyl-3-phenylbutanoate, hydrolyzed the 3-phenylbutyric esters with good to excellent enantioselectivities. This confirms that Eapp values can differ much from Etrue values as “you get what you screen for”, and supports that the here described method is very suitable for identification of enantioselective esterases. In this PhD thesis a novel strategy for identification of enantioselective esterases has been developed. This method allows a very high throughput (≥ 108 mutants/day) and opens the bottleneck of variant analysis, which exists in protein engineering technology.
Krebs in einem fortgeschrittenen, disseminierten Stadium kann nur durch eine systemisch wirksame Therapie beeinflußt werden. Die Wirkung von Zytostatika auf die meisten Krebsarten ist begrenzt, oft kann die Krebserkrankung lediglich aufgehalten werden, eine Heilung ist im fortgeschrittenen Stadium nur selten und in speziellen Fällen möglich. Die Aufklärung tumorspezifischer Determinanten der Zytostatika- und Zytokin-Resistenz stellt daher einen wichtigen experimentellen Ansatz für zukünftige Therapieverbesserungen dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, inwieweit die Suppression der zellulären Faktoren PKCr| und Bcl-XL eine Zytokin- und Zytostatikasensiblisierung der Lungenadenokarzinomzellinie A549 zur Folge hat. Es wurden PKCrj und Bcl-XL in dieser Lungenkarzinomzelllinie mit spezifischen gapmer Antisense Oligonukleotiden supprimiert. Als Kontrolle wurde ein unspezifisches AODN verwendet. Die spezifische Suppression von PKQi und Bcl-XL wurde 1.) auf RNA-Ebene mit der Taq Man PCR <§> und 2.) auf Proteinebene mit der Western Blot Analyse nachgewiesen. Die funktionellen Testungen an der behandelten Zelllinie umfaßten 1.) die Aktivierung von Caspase-3 und 2.) die Anfärbung des Zellkerns mit Propidiumjodid. Es konnte gezeigt werden, dass die Suppression von Bcl-XL und PKCr) eine signifikante Sensibilisierung gegen die Zytostatika Vincristin und Taxol und gegen die Zytokine TRAIL und TNFa zur Folge hat. Die Versuche zeigen, dass die Inhibition von Bcl-XL und PKCr| einen Therapienutzen im Rahmen adjuvanter Chemotherapien von Krebspatienten aufweisen könnte, wenn diese Faktoren bevorzugt in malignen Geweben exprimiert oder bevorzugt in malignen Geweben supprimiert werden.