Doctoral Thesis
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GegenwĂ€rtig gilt eine prĂ€operative Differenzierung zwischen Leiomyomen (LM), den LM-Varianten/STUMP und den uterinen Sarkomen, insbesondere den Leiomyosarkomen (LMS) und low-grade endometriale Stromasarkomen als schwierig. Konsekutiv wird ein hoher Anteil von uterinen Sarkomen unter der Indikation von LM inadĂ€quat operiert. Die Zielsetzung dieser Studie bestand darin anhand eines gröĂeren Patientinnenkollektivs histologisch gesicherte regelhafte LM anamnestisch, klinisch und paraklinisch zu charakterisieren. Des Weiteren wurden die in diesem Rahmen gefundenen LM-Varianten/STUMP und uterine Sarkome gesondert analysiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden mit den unter weitgehend identischen Erhebungs- bzw. Analyseverfahren erhobenen LM-Daten von Krichbaum aus MĂŒnster und den durch weitere Promovenden der Promotions- und Forschungsgruppe fĂŒr genitale Sarkome (PFGS) rekrutierten Sarkomdaten verglichen. Diese Daten sollten als Basis fĂŒr die Errechnung eines durch das DKSM (Deutsche klinisches Kompetenzzentrum fĂŒr genitale Sarkome und Mischtumoren) entwickelten Sarkom-Scores dienen. ZusĂ€tzlich erfolgte eine Analyse verschiedener Laborwerte (LDH, Neutrophilen/Lymphozyten-Ratio: NLR, Lymphozyten/Monozyten-Ratio: LMR) und der Ultraschallbefunde einschlieĂlich der Dopplersonographien. Insgesamt sollten Charakteristika gefunden werden, die zur Diskriminierung von LM und uterinen Sarkomen geeignet sind. Es wurden insgesamt 526 vollstĂ€ndige DatensĂ€tze von LM-Operationen, die im Zeitraum von Dezember 2015 bis Oktober 2016 in der Frauenklinik des Krankenhauses Sachsenhausen/Frankfurt durchgefĂŒhrt worden sind, prospektiv erfasst. Es wurden 470 FĂ€lle mit histologisch gesicherten, regulĂ€ren LM, sowie 36 zellreiche LM, 4 mitotisch aktive LM, 5 LM mit bizarren Kernen und 1 Lipoleiomyom, 1 Angioleiomyom und 1 myxoides LM in dieser Arbeit ausgewertet. ZusĂ€tzlich wurden 8 uterine Sarkome (3 LMS, 3 low grade endometriale Stromasarkome, 1 undifferenziertes uterines Sarkom und 1 Adenosarkom) analysiert. Von den 526 Patientinnen wurden 521 (470 LM, 46 LM-Varianten und 5 uterine Sarkome) unter der Diagnose LM aufgenommen und operiert. Bei den Parametern Alter, TumorgröĂe, Menopausestatus, intermenstruelle Blutung, auffĂ€llige Sonographie, schnelles Tumorwachstum und SolitĂ€rtumor zeigte sich ein hochsignifikanter Unterschied (p < 0,001) zwischen den LM-Pat. der vorliegenden Promotion und von Krichbaum auf der einen und den 236 LMS der Promovenden der PFGS auf der anderen Seite. Es ergaben sich Hinweise, dass LMS eine höhere LDH und NLR sowie eine niedrigere LMR aufweisen. Erhöhte LDH-Werte sowie eine erhöhte NLR und eine erniedrigte LMR kamen auch bei den LM vor. So wiesen die Patientinnen mit einer TumorgröĂe > 5 cm, aber auch mit stark degenerativ verĂ€nderten LM signifikant höhere LDH-Werte, als Frauen mit einer TumorgröĂe †5 cm (p = 0,04334) und LM ohne degenerative VerĂ€nderungen (p= 0,0052) auf. Die NLR von Frauen â„ 35 Jahre war signifikant höher, als bei denen mit < 35 Jahren (p = 1,4 x 10-5) und die LMR war bei â„ 35 Jahren signifikant niedriger, als bei den Frauen < 35 Jahren (p = 0,0007). Bei der Thrombozytenzahl ergaben sich gleichfalls Hinweise, dass LMS (n = 3; Mittelwert: 398 Tsd/ÎŒl) und LM (n = 469; Mittelwert: 279,42 Tsd/ÎŒl) unterschiedlich hohe Werte aufweisen. Aufgrund der geringen Fallzahl der Sarkome lieĂen sich die Ergebnisse statistisch nicht sichern. Die Sonographie ist die wichtigste diagnostische Untersuchung zur Unterscheidung zwischen LM und LMS. 9,79 % der LM und 82,63 % der LMS des DKSM wiesen einen auffĂ€lligen Sonographiebefund auf. Dopplersonographisch lieĂen sich bei den uterinen Sarkomen bzw. LMS wegen der niedrigen Zahl der uterinen Sarkome lediglich Trends erkennen. Die uterinen Sarkome zeigten eine eher zentrale Durchblutung und ein LMS (1 von 2 Pat.) hatte eine stĂ€rker ausgeprĂ€gte Durchblutung, wĂ€hrend die LM (n = 290) eher peripher (81,03 %) und weniger stark durchblutet waren. Nur 5,17 % der LM zeigten eine auffallend starke Durchblutung. Im Rahmen dieser Studie wurde der RI zentral und peripher im Tumor und in der A. uterina gemessen. Der zentrale RI der uterinen Sarkome (4 Messwerte) lag mit einem Mittelwert von 0,43 unter dem der LM (162 Messwerte) mit 0,58. Bei den LMS (2 Messwerte) wurden mit einem mittleren RI zentral von 0,35 sehr niedrige Werte gemessen. Zum Teil wiesen auch LM einen niedrigen RI auf. Der RI zentral (p = 0,0002) und der RI peripher (p= 1,59 x 10-7) waren bei LM mit einer TumorgröĂe > 5 cm hochsignifikant niedriger, als bei einer TumorgröĂe †5 cm. Dies traf bei dem RI der A. uterina nicht zu (p= 0,3805). Auch der RI zentral (p = 0,0411) und der RI peripher (p = 1,74 x 10-5) der solitĂ€ren LM war signifikant niedriger, als der RI, der im gröĂten Tumor bei multiplen LM gemessen wurde. Die Daten dieser Analyse mit 470 LM und die Daten der Promotion Krichbaum mit 199 LM wurden direkt fĂŒr die Berechnung des prĂ€operativen LMS-Risiko-Scores verwendet. Letztere erfolgte unter HinzufĂŒgung der LMS-Daten des DKSM im Institut fĂŒr Bioinformatik der UniversitĂ€tsmedizin Greifswald. Dieser Score wurde zwischenzeitlich zur Publikation eingereicht.
Das Multidrug Resistance Protein 4 (MRP4/ABCC4) ist als Mitglied der ABC-Transporterfamilie nicht nur an dem Transport zahlreicher Pharmaka, wie beispielsweise antiviraler und zytostatischer Substanzen, sondern auch an Signaltransduktionsprozessen, z.B. dem Transport von Eicosanoiden und zyklischen Nukleotiden beteiligt. MRP4 weist auĂerdem innerhalb der ABCC-Gruppe ein einmaliges Expression-, Lokalisations- und Substratspektrum auf. MRP4 wurde neben Prostata, Niere, Gehirn und Leber auch in BlutplĂ€ttchen nachgewiesen und kann zelltypabhĂ€ngig sowohl apikal oder basolateral als auch intrazellulĂ€r lokalisiert sein. Insbesondere das Vorkommen in den ÎŽ-Granula der Thrombozyten ist bemerkenswert, da die Speicherung und Freisetzung von ĂbertrĂ€gersubstanzen wie ADP auf die Thrombozytenfunktion entscheidenden Einfluss haben. Ănderungen der zelltypischen MRP4-Lokalisation, die beispielsweise bei Patienten mit ÎŽ-storage pool Defekt beobachtet wurden, können zu einem Verlust der spezifischen Transporterfunktion fĂŒhren. Das Ziel dieser Arbeit war es, das Transportprotein Multidrug resistance protein 4 in Bezug auf Protein-Protein-Wechselwirkungen genauer zu untersuchen. Da die Lokalisation von Membranproteinen u.a. durch die Wechselwirkung mit Proteinen gesteuert wird, stand die Identifikation möglicher Interaktionspartner von MRP4 mit Hilfe von Bindungs- und Kolokalisationsstudien im Vordergrund dieser Arbeit. Es schien sehr wahrscheinlich, dass AdaptormolekĂŒle ĂŒber eine Wechselwirkung mit MRP4 an dessen trafficking innerhalb der Zellen beteiligt sind und damit Einfluss auf dessen Lokalisation und konsekutiv auch auf die Funktion nehmen. Als mögliche Motive zur Vermittlung solcher Proteinbindungen liegen im MRP4-MolekĂŒl ein PDZ-Motiv sowie eine mögliche Bindungsstelle fĂŒr Adaptorprotein (AP)-Komplexe vor. Zur Ermittlung solcher potentiellen Partner wurde eine AffinitĂ€tschromatographie durchgefĂŒhrt. DafĂŒr erfolgte die Kopplung eines Peptids, welches der C-terminalen Sequenz von MRP4 mit dem PDZ-Bindemotiv entsprach, an eine Sepharosematrix und eine anschlieĂende Inkubation mit Thrombozytenlysat. Mittels Western Blot-Verfahren und FlĂŒssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie konnten im gewonnenen Eluat das ERM-bindende Phosphoprotein 50 (EBP50/NHERF1), Moesin, sowie das Post synaptic density protein 95 (PSD95) und das Hitzeschockprotein Hsp90 als mögliche Bindungspartner identifiziert werden. WĂ€hrend eine Wechselwirkung von MRP4 mit EBP50 ĂŒber seine PDZ-DomĂ€ne bereits postuliert worden war, konnten insbesondere PSD95 und Hsp90 erstmalig als mögliche Interaktionspartner von MRP4 ermittelt werden. Da PSD95 bisher vorwiegend in neuronalen Zellen beschrieben wurde, wurde das Vorkommen dieses Proteins in Thrombozyten und der megakaryoblastischen LeukĂ€miezelllinie M-07e auf RNA-Ebene untersucht und nachgewiesen. Damit konnte erstmals die Expression dieses scaffolding Proteins in Zellen der myeloischen Reihe gezeigt werden. Im Anschluss daran wurden KofĂ€rbungen von MRP4 und den identifizierten Bindungspartnern durchgefĂŒhrt. Die indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie lieferte das Ergebnis einer zumindest partiellen Kolokalisation des Transporters mit Hsp90 â in Thrombozyten und M-07e-Zellen in intrazellulĂ€ren Strukturen, in den Nierenepithelzellen LLC-PK1 und MDCKII in der Plasmamembran. Auch eine Kolokalisation von MRP4 mit PSD95 konnte in M-07e-Zellen und Thrombozyten beobachtet werden. Untersuchungen mit dem Hsp90-Hemmstoff Radicicol ergaben des Weiteren zum einen eine sichtbare Verringerung der MRP4-Expression im Western Blot nach der Inkubation, zum anderen auch eine Ănderung der Lokalisation von Hsp90 und MRP4 in den verwendeten Nierenzelllinien nach intrazellulĂ€r. Ferner konnten funktionelle Transportversuche unter Verwendung von inside-out Thrombozytenmembranvesikeln einen Abfall der Aufnahme des radioaktiv markierten MRP4-Substrats cGMP in die Vesikel nach Behandlung mit Radicicol zeigen. Um den Einfluss von PSD95 auf die MRP4-Lokalisation zu untersuchen, wurde ein spezifischer knock-down von PSD95 mittels siRNA in M-07e-Zellen durchgefĂŒhrt. Im Anschluss ergab sich in der Immunfluoreszenzmikroskopie eine deutliche Zunahme der MRP4-Lokalisation in der Plasmamembran. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit EBP50, Moesin, PSD95 und Hsp90 als mögliche Bindungspartner von MRP4 in Thrombozyten identifiziert werden. Es ist denkbar, dass Hsp90 als Hitzeschockprotein möglicherweise zu der Prozessierung und Stabilisierung von MRP4 beitrĂ€gt. Die Interaktion mit PSD95 hingegen scheint die Internalisierung des Transportproteins zu begĂŒnstigen. Die gewonnenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass Protein-Protein-Interaktionen die Lokalisation und Funktion von MRP4 entscheidend beeinflussen.
