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Die chronische Herzinsuffizienz (HI) bezeichnet das Unvermögen des Herzens, die vom Körper benötigte Blutmenge bedarfsgerecht zu befördern und stellt in der Allgemeinbevölkerung das Endstadium vieler Herzerkrankungen dar. Trotz großer Fortschritte in der medikamentösen Therapie ist die Prognose der HI auch heute noch schlecht. Der progrediente Verlauf erstreckt sich von einer kompensierten Herzhypertrophie mit aufrechterhaltener Pumpfunktion bis hin zu einer massiven Ventrikeldilatation mit stark eingeschränkter Herzfunktion und weist dementsprechend eine schlechte Prognose auf. Die zellulären Veränderungen auf Protein- und Genexpressionsebene während der Progression einer HI sind sehr komplex und trotz ausgiebiger wissenschaftlicher Arbeiten nicht ausreichend geklärt. Dabei ist es von entscheidender Bedeutung, in welcher Phase der Erkrankung spezifische Änderungen in der Genregulation entstehen und inwiefern sich diese auf den Phänotyp auswirken. Auf Grund dessen beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit den zeitabhängigen Veränderungen auf mRNA-und Proteinebene während der Progression der HI. Um alle Stadien beginnend von einer subklinischen Organschädigung bis hin zur Ausbildung einer HI experimentell untersuchen zu können, wurde zunächst ein Mausmodell etabliert, welches durch eine chronische Nachlasterhöhung mittels Einengung des Aortenlumens eine Myokardschädigung durch eine arterielle Hypertonie simuliert (transverse aortic constriction, TAC). Die Herzfunktion der Mäuse wurde an den postoperativen Tagen 4, 14, 21, 28, 42, und 56 durch Messungen im Kleintier-MRT (Magnetresonanztomografie) evaluiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) TAC-operierter Mäuse vom postoperativen Tag 4 zu 14 verschlechtert, bis Tag 42 auf einem konstanten Niveau hält und bis Tag 56 nochmals stark absinkt. Im Gegensatz dazu zeigten Sham-operierte Mäuse über den gesamten Zeitraum eine stabile LVEF. Ein vergleichbarer stufenartiger Verlauf konnte bei den Parametern der linksventrikulären Masse und den endsystolischen bzw. enddiastolischen Volumina beobachtet werden. Zusätzlich konnte durch histologische Untersuchungen zu den verschiedenen postoperativen Zeitpunkten eine verstärkte Fibrosierung des Herzgewebes nach der TAC-OP aufgezeigt werden. Für die longitudinalen Transkriptom- und Proteomuntersuchungen wurden die Herzen (jeweils linke und rechte Ventrikel) nach den MRT-Messungen entnommen, gruppen- und zeitpunktspezifisch gepoolt und einer Microarray- bzw. massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Auf Transkriptomebene zeigten sich vor allem an den Tagen 4 und 56 starke TAC-induzierte Veränderungen im Expressionsmuster, wohingegen der Zeitraum zwischen 14 und 42 Tagen weniger differenziell exprimierte Gene aufwies. Der Verlauf der Erkrankung konnte anhand bereits bekannter Hypertrophie- und HI-marker sehr gut charakterisiert werden. So zeigten Nppa (ANP) und Nppb (BNP) im linken Ventrikel bereits kurz nach Aortenstenose stark erhöhte Expressionslevel, die über die gesamte Versuchsdauer erhalten blieben. Weiterhin wurde die Expression von Genen reguliert, die an kardialen Remodelingprozessen maßgeblich beteiligt sind, wie beispielsweise Acta1 (a-Aktin), Myh7 (b-Myosin Heavy Chain) und Postn (Periostin). Im Vergleich beider Ventrikel zeigte der rechte Ventrikel bezüglich der Anzahl der regulierten Gene als auch bei der Expression HI-assoziierter Gene eine verzögerte und weniger stark ausgeprägte Reaktion. In den linken Ventrikeln wurden vor allem die Gene reguliert, deren Genprodukte der extrazelluären Matrix angehören. Eine Validierung der Microarray-Ergebnisse mittels realtime-PCR konnte die Richtigkeit der Analysemethode sehr präzise bestätigen. Da diese anhand ausgewählter Gene auf Einzeltierebene durchgeführt wurde, konnte zusätzlich auf Korrelation zwischen mRNA-Expression und den kardialen Funktionsparametern getestet werden. Wie erwartet spiegelten die Epressionslevel der HI-assozierten Markergene Nppa (ANP), Nppb (BNP) und Myh7 (b-Myosin Heavy Chain) die progressive Verschlechterung der Herzfunktion wider. Zusätzlich konnten durch die Validierung und Korrelationsanalysen weitere interessante Kandidatengene, wie beispielsweise Sfrp2 (Secreted frizzled-related protein 2) und Wisp2 (WNT1-inducible signaling pathway protein 2) für weiterführende Studien identifiziert werden. Auch auf Proteomebene konnten vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Auch hier zeigte der linke Ventrikel eine deutlich ausgeprägtere Reaktion auf die Drucküberlastung, der rechte Ventrikel antwortete deutlich schwächer und verzögert. Änderungen im Proteinmuster nach TAC waren in den linken Ventrikeln vor allem an den Tagen 14, 21 und 28 stark ausgeprägt. Ingenuity Pathway Analysen der veränderten Proteine weisen auf Veränderungen im Kalzium-, Rho A- und PKA-Signaling vor allem zu den frühen Zeitpunkten hin, wohingegen zu späteren Zeitpunkten hauptsächlich metabolische Prozesse betroffen waren.
Compared to other human pathogens, S. aureus outstands with a remarkably broad spectrum of deseases: from minor skin infections over endocarditis, pneumoniae, and osteomyelitis, to septic shock. The prerequisite is an arsenal of adaptation strategies, encoded in the core and variable genome. It includes the coordinated expression of adhesins and toxins, evasion of the immune system, response to stress and starvation, adaptation of the metabolism, formation of biofilms and capsules, antibiotic resistance, and persistence on the skin, in nasal epithelial cells, and even in the inner of macrophages after phagocytosis. All these adaptation strategies enable S. aureus to colonize a diversity of niches within the human host. The inevitable requirement is the ability to activate the appropriate adaptation strategy at the right time and at the right place. S. aureus overcomes this challenge with a sophisticated regulatory network. This PhD thesis covers a broad spectrum of transcriptional regulators, involved in S. aureus pathogenesis: (1) the quorum sensing system Agr (regulation of early- and late stage virulence factors), (2) the Sar family (regulation of early- and late stage virulence factors), (3) SaeRS (regulation of accessory exotoxins and adhesins), (4) CodY (response to amino acid starvation, including extracellular proteases), (5) Sigma B (general stress response, including virulence factors), (6) Rex (anaerobic energy metabolism), (7) CtsR and HrcA (protein quality control), (8) PerR and Fur (oxidative stress response), and (9) antibiotic resistance. Traditionally, Proteomics constitute the long-lasting reputation of the Institute. In fact, the majority of investigations presented in this PhD thesis was initialized by proteomic analyses as the ultimate starting point. From the first day, a major goal of this PhD thesis was to add regulator-promoter interaction studies to the methodical spectrum. In particular, to complement transcriptomic and proteomic results by answering the logical follow-up question: Which regulator is responsible for the observed changes in gene expression and protein synthesis after application of a specific stimulus?
The first chapter provides specific analyses for three major regulators: Rex, CodY, and SarA. Publications were achieved for Rex (Hecker et al., 2009; Pagels et al., 2010). Results were mainly achieved by establishing regulator-promoter interaction methods (in particular EMSA and “footprinting”). Additionally, this chapter describes method development of a novel easy-to-apply method, named REPA (restriction endonuclease protection assay).
The second chapter presents method development for the genome-wide identification of regulator-promoter interactions, named “global footprinting”. This approach combines two already well-established methods: (A) Purification of a recombinant Strep-tagged regulator via Strep-tag affinity chromatography. The modification in “global footprinting” is to incubate the regulator with fragmented genomic S. aureus DNA, resulting in co-purification and enrichment of DNA streches with specific regulator binding sites. (B) Identification and quantification of these DNA streches via “next generation sequencing” (NGS). Using this combined approach, this PhD thesis was able to localize the most affine promoter binding site for the regulator Rex precisely down to one single base pair across the whole S. aureus genome.
The third chapter describes the assembly of a data library, collecting the majority of DNA microarray data and regulator-promoter interaction studies from the worldwide literature. This data library summarizes more than 50,000 regulatory events and more than 2,000 regulator binding sites. As published in the perspectives in Fuchs et al. (2018), this data library can be incorporated into the free-accessible online data base “Aureowiki” (provided and maintained by the Department of Functional Genomics, University of Greifswald). The major effort is the consolidation of these “big data” via in silico cluster analysis, comparing 282 different experimental conditions at once. The major finding of this analysis is the identification of seven functional and regulatory gene clusters in S. aureus pathogenesis that are conserved across S. aureus strain diversity. These findings allowed the creation of a prediction tool, to provide novel experimental starting points for the worldwide S. aureus research community. This prediction tool was successfully applied on several topics, and partially published: functional and regulatory prediction for a set of 20 selected lipoproteins as potential virulence factors (Graf et al., 2018), and prediciton of protein complexes (Liang et al., 2016).
Alltogether, this PhD thesis provides new insights into the molecular mechanisms of three pathogenesis-relevant regulators: Rex, CodY, and SarA. It describes the development of three novel experimental methods for wet and dry lab applications that can be used on research topics beyond S. aureus: REPA, “global footprinting”, and cluster analysis. Finally, cluster analysis identifies seven conserved fuctional and regulatory gene clusters, involved in S. aureus pathogenesis. This cluster anaysis is used as a prediction tool to provide novel experimental starting points, and to predict the physiological mode of action of newly discovered anti-staphylococcal agents.
Staphylococcus aureus is a pathogenic bacterium infecting the human host. It’s multifaced adaptation to various environmental conditions is mediated by a tight regulation of the virulence factors influencing the host’s immune system. In this thesis two regulators of gene expression were analysed: (i) the global influence of the two-component system SaePQRS and (ii) the regulation of superantigen gene expression by the alternative sigma factor σB. At the outset of this thesis, single target genes induced by SaeRS were known (hla, hlb, cap5, fnbA, coa). In order to get a general idea of the Sae-regulon, the influence of SaePQRS on gene-expression was analysed in two strain backgrounds by proteomics and transcriptomics aproaches. Recapitulatory, expression of at least 18 secreted and two covalently cell-wall bound proteins was decreased following inactivation of the Sae-system. Sae-dependently expressed were, amongst others, well decribed virulence factors like the y-hemolysins HlgA, HlgB, HlgC, LukM and LukF, the innate immune system modulating proteins Efb, CHIPS and SCIN-B as well as the enterotoxin SEB. SaeR acts as an activator of its target genes. Some proteins were detected in increased amounts in the extracellular proteome of the Sae-deficient strain. However, these changes did not occur at the transcriptional level. The expression of virulence factors is determined by other global regulators. No influence of SaePQRS on the transcription of five substancial regulators, namely the Agr-system and its effector molecule RNAIII, the alternative sigma factor σB, the two-component system ArlRS and the DNA-binding protein SarA, could be shown. In the second part of this thesis the issue was broached to the regulation of gene-expression of a subgroup of virulence factors, the superantigens (SAgs) of S. aureus by SaePQRS and σB. In contrast to their well described molecule structure and function, the regulation of their gene expression was largely unknown. Six different S. aureus strains (two laboratory strains and four clinical isolates) encoding one to seven SAg-genes each, were used for analysis of a total of twelve SAgs regarding their transcription and mitogenic activity. The transcriptional units were characterized using Northern-Blotting. The expression of SAgs could be correlated to the respective growth phase. While egc-SAgs were expressed mainly at low optical densities, seb was induced during late growth phase. In contrast, the transcription of sea, seh, sek, tst and sep remained constant and growth-phase independent. The transcriptional dataset was verified using T-cell proliferation assays. The expression of seh, tst and the egc-operon was dependent on σB. A potential σB-dependent promotor could be identified preceeding seo, the first gene of the egc-operon. In contrast, the expression of seb was increased in sigB-deficient background. This might be due to indirect effects. Expression of seb required SaePQRS. Transcriptional datasets were verified by Immuno-Blotting and T-cell-proliferation assays. In conclusion, the same mutation in sigB but in different strain backgrounds could result in opposite phenotypes with respect to their mitogenic activity. Besides well characterized virulence factors, some secreted proteins with so far unknown function belong to the Sae-regulon. Given that the influence of SaePQRS was restricted to virulence factors and induced especially modulators of the innate immune system, it can be assumed, that these proteins potentially play a role in virulence of S. aureus. In the third part of this thesis, one of these potential new virulence factors, namely SACOL0908, was analysed in detail. In cooperation with the group of Prof. Stehle, Tübingen, the crystal structure was solved. The protein folding of SACOL0908 is new with only minor similarities to described protein structures. Recombinantly expressed SACOL0908 binds to granulocytes. These cells belong to the innate immune system, incorporate bacteria by phagocytosis and kill them. The receptor for SACOL0908 on the surface of granulocytes could not be identified using immunoprecipitation, antibody-blocking assays and functional assays in cooperation with the group of Prof. Peschel, Tübingen. The gene encoding SACOL0908 was deleted in two S. aureus strain backgrounds (COL and Newman). These mutants are currently in use to characterize their phenotype in mouse-infection studies.