Doctoral Thesis
In Europa veröffentlicht die ESMO (European Society for Medical Oncology) in regelmĂ€Ăigen AbstĂ€nden, zuletzt 2014, Leitlinien zur Diagnose, Behandlung und Nachbeobachtung von Patienten mit GIST. Bislang gibt es nur wenige Untersuchungen darĂŒber, wie und in welchem Umfang diese Empfehlungen in der alltĂ€glichen Versorgungssituation von Patienten umgesetzt werden. Aufgrund des lĂ€ndlichen Charakters und der dezentralen Versorgungsstruktur in Vorpommern ist zu vermuten, dass die Leitlinien, vor allem die dezentral stattfindende Nachsorge betreffend, nur partiell umgesetzt werden. Ziel der Arbeit war daher einerseits eine Charakterisierung des Patientenkollektives mit GIST in einem Krankenhaus der Maximalversorgung in Vorpommern, andererseits der Erwerb eingehenderer Erkenntnisse in der leitliniengerechten Umsetzung zu Diagnostik und Therapie der Patienten. Hierzu wurde ein Kollektiv von 104 Patienten (51,9% MĂ€nner, Durchschnittsalter: 66,7±11,9 Jahre) mit histopathologisch gesichertem GIST retrospektiv untersucht. Der Zeitraum erstreckte sich von 1993 bis Januar 2011. Im Vergleich mit der aktuellen Literatur zeigte sich unser Patientenkollektiv vergleichbar sowohl bzgl. Inzidenz, Geschlechtsverteilung, Erkrankungsalter, Symptomen und Lokalisation, histopathologischen Merkmalen des Tumors und Verteilung der Risikogruppen sowie dem Auftreten von weiteren malignen Tumoren. Die GIST-Inzidenz in Vorpommern betrug 1,1/100 000 Einwohner. 32% der Patienten hatten keine Beschwerden aufgrund des GIST. Bei den symptomatischen Patienten dominierte die gastrointestinale Blutung mit 55,8% betroffener Patienten. Die hĂ€ufigsten Tumorlokalisationen waren mit 68,9% der Magen, mit 16,5% der DĂŒnndarm und mit 4,9% der Ăsophagus. Extragastrale GIST traten in 6,8% der FĂ€lle auf. Die durchschnittliche TumorgröĂe betrug 5,0±3,9 cm. 91,9% der GIST zeigten sich CD117 positiv. DOG-1 als neuerer Diagnosemarker wurde bei nur 3 Patienten bestimmt. Eine Mutationsanalyse wurde bei 5,8% der Patienten durchgefĂŒhrt; 66,7% zeigten eine Mutation im PDGFRα-Gen, 33,3% im KIT-Gen Exon 11. Die GIST wurden den Risikogruppen nach Fletcher zugeteilt. Die HĂ€ufigkeit betrug 12,9% in der Niedrigst-, 32,3% in der Niedrig-, 29,0% in der IntermediĂ€r- und 25,8% in der Hochrisikogruppe. 85 Patienten wurden am PrimĂ€rtumor operiert (85,4% R0-Resektion, 6,7% R1-Resektion, 2,2% R2-Resektion, 3,4% Tumorruptur). Bei 3 Patienten lagen bei Erstdiagnose bereits Metastasen in der Leber und bei 2 Patienten multiple Metastasen vor. Allen dieser Patienten wurde eine adjuvante Therapie empfohlen. Von Metastasen oder Rezidiven im Verlauf waren 11 Patienten betroffen. Diese traten nach durchschnittlich 3,6 Jahren vor allem in der Leber (36,4%) oder lokal mit Lebermetastasen (27,3%) auf. 63,6% dieser Patienten wurden adjuvant behandelt. Eine adjuvante Therapie mit Imatinib wurde bei 11 von 18 Patienten (61,1%) aus der Hoch- und bei 2 von 23 Patienten (8,7%) aus der IntermediĂ€rrisikogruppe durchgefĂŒhrt. 36,4% der Patienten der Hochrisikogruppen erhielten eine Nachsorge. Der erste Nachsorgetermin fand im Durchschnitt nach 30,9 Monaten, der letzte nach 47,1 Monaten statt. 30,8% der Patienten hatten mindestens einen malignen weiteren Tumor (26,3% kolorektales Karzinom, 18,4% Mammakarzinom, 15,8% Magenkarzinom, 15,8% Prostatakarzinom). Die 5-Jahres-Gesamt-Ăberlebensrate lag bei 38,5%. Es lĂ€sst sich feststellen, dass fĂŒr eine leitliniengerechte Diagnostik mehr Bestimmungen von DOG-1 und PDGFRα bei CD117-NegativitĂ€t nötig sowie die hĂ€ufigere DurchfĂŒhrung von Mutationsanalysen empfehlenswert sind. Bei Patienten mit GIST höherer Risikogruppen besteht der Datenlage nach Verbesserungsbedarf bzgl. der Einleitung einer adjuvanten Therapie und v.a. der Nachsorge in Bezug auf die Dauer und zeitlichen AbstĂ€nde.
Im Jahr 2002 wurde bei einer stark mental retardierten Patientin im Rahmen einer Genanalyse ein Strangbruch am kurzen Arm des dritten Chromosoms festgestellt. Das davon betroffene Gen codiert fĂŒr ein bis dahin unbekanntes Protein, welches als srGAP3 / MEGAP / WRP benannt wurde. Es gehört zur Familie der Rho-GTPasen aktivierenden Proteine. Diese Rho-GTPasen nehmen ĂŒber verschiedene Signaltransduktionsketten Einfluss auf die Wegfindung, Differenzierung und VerknĂŒpfung von Neuronen wĂ€hrend ihrer Entwicklung.
Mit Hilfe eines Knockoutmausmodells konnten in vorangegangenen Forschungsarbeiten starke VerĂ€nderungen der Gehirnarchitektur, sowie Schichtverdickungen im Bereich des Hippocampusâ festgestellt werden. Die Beziehung von srGAP3 zu den Rho-Proteinen und den damit entstehenden Einfluss auf die neuronale Entwicklung lieĂ den Hippocampus als Region der adulten Neurogenese in den Fokus der Forschungsarbeit rĂŒcken.
Die durchgefĂŒhrten Untersuchungen erfolgten im srGAP3-Knockoutmausmodell mittels Kleintier-MRT, Golgi-ImprĂ€gnierung und immunhistochemischen FĂ€rbungen (gegen Doublecortin und Phosphohiston 3).
In den Ergebnissen konnte durch den srGAP3-Knockout zwar eine Volumenzunahme des Hippocampusâ, jedoch weder eine signifikante VerĂ€nderung der Neuronenanzahl, der NeuronenmorphiditĂ€t, noch der Spinedichte oder der SpinelĂ€nge im Hippocampus festgestellt werden.
Als ErklĂ€rung der prĂ€sentierten Ergebnisse und möglicher neuer Forschungsansatz wĂ€re die These einer Zunahme an kortikalen Neuronen, welche in den Hippocampus projizieren, denkbar. Dieser Anstieg könnte sowohl eine faserbedingte Volumenzunahme, die gleichzeitig fehlenden neurostrukturellen VerĂ€nderungen im Hippocampus, als auch die milden verhaltensbiologischen AuffĂ€lligkeiten in den bisher durchgefĂŒhrten Tests erklĂ€ren. Die Untersuchung der Tiere in komplexeren Verhaltenstests könnte dahingehend wegweisend sein.
Ziel der Arbeit war die Untersuchung der lokalen und systemischen EntzĂŒndungsreaktionen nach intramuskulĂ€rer Implantation von Niedertemperatur-Plasmapolymer-modifizierten TitanplĂ€ttchen (Ti) im Tiermodell Ratte. Ausgangspunkt dafĂŒr waren vorherige Zellkultur-Untersuchungen zu Ti-Proben mit einer positiv geladenen Schicht aus plasma-polymerisiertem Allylamin (PPAAm) beziehungsweise einer negativ geladenen Schicht aus plasma-polymerisierter AcrylsĂ€ure (PPAAc). Diese In-vitro-Studien ergaben fĂŒr eine Beschichtung mit PPAAm positive Effekte auf das Wachstum von Osteoblasten sowie fĂŒr eine Beschichtung mit PPAAc auf die osteogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen. FĂŒr die darauf aufbauenden in dieser Arbeit durchgefĂŒhrten In-vivo-Untersuchungen war es zunĂ€chst notwendig, eine Methode zur quantitativen histologischen Untersuchung der lokalen Gewebsreaktionen nach Implantation von Ti-Proben zu etablieren. Deren Evaluierung zeigte eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und damit die Eignung des Bildanalyse-Verfahrens fĂŒr die weiteren Untersuchungen. AnschlieĂend erfolgten unter Anwendung dieser Methode morphometrische immunhistochemische Untersuchungen der lokalen EntzĂŒndungsantwort nach intramuskulĂ€rer Implantation von PPAAc- und PPAAm-beschichteten Ti-PlĂ€ttchen. Hierzu wurden in einer ersten Studie fĂŒr beide Beschichtungen die Gesamt-Monozyten und -Makrophagen sowie die MHC-Klasse-II-positiven antigen-prĂ€sentierenden Zellen im Periimplantatgewebe nach 56 Tagen Implantationsdauer im Vergleich zu unbeschichteten Kontrollproben untersucht. Dabei ergab sich fĂŒr die PPAAc-beschichteten Ti-PlĂ€ttchen im Vergleich zu PPAAm-beschichteten Implantaten und Kontrollen eine verstĂ€rkte chronische EntzĂŒndungsreaktion. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden in einer anschlieĂenden zweiten Studie fĂŒr drei verschiedene PPAAm-Beschichtungen, die sich hinsichtlich der Plasmaprozessparameter im Duty cycle unterschieden, die Gewebsreaktionen im Kurz- und Langzeitverlauf analysiert. DafĂŒr erfolgte eine Untersuchung der Gesamt-Monozyten und -Makrophagen, der gewebsstĂ€ndigen Makrophagen, der T Lymphozyten und der MHC-Klasse-II-positiven antigen-prĂ€sentierenden Zellen 7, 14 und 56 Tage nach Implantation fĂŒr diese drei PPAAm-Varianten im Vergleich zu Kontrollen. Im Ergebnis waren die lokalen Gewebsreaktionen fĂŒr die zwei PPAAm-Varianten mit dem höheren Duty cycle im Langzeitverlauf schwĂ€cher ausgeprĂ€gt als fĂŒr die PPAAm-Schicht mit dem geringen Duty cycle und die Kontrollen. Dieses Ergebnis stand im Einklang mit entsprechenden Unterschieden in den physikochemischen Schichteigenschaften wie zum Beispiel der Schichtdicke, der Aminogruppendichte und der Proteinadsorption. DarĂŒber hinaus wurden das Serumprofil und die Korrelationen der pro-inflammatorischen Zytokine IL-2 und IFNÎł sowie der anti-inflammatorischen Zytokine IL-4 und IL-10 vor sowie wöchentlich fĂŒr 56 Tage nach Implantation von PPAAc-und PPAAm-beschichteten Implantaten sowie Kontrollen analysiert. Diese Untersuchungen ergaben fĂŒr die PPAAc-Gruppe in der SpĂ€tphase einen gegensĂ€tzlichen Verlauf von IL-4 und IL-10 sowie abweichende Korrelationen des IL-10 mit den anderen untersuchten Zytokinen, wĂ€hrend in der PPAAm-Gruppe die systemischen Reaktionen und die Korrelationen zwischen den untersuchten Zytokinen mit den Befunden in der Kontrollgruppe vergleichbar waren. Die Gesamtbetrachtung der in dieser Arbeit erhobenen In-vivo-Ergebnisse mit den vorherigen In-Vitro-Befunden zeigt, dass eine positiv geladene PPAAm-Beschichtung einen vielversprechenden Ansatz zur Erzeugung von zelladhĂ€siven ImplantatoberflĂ€chen mit dem Ziel einer Verbesserung des Einwachsens von Ti-Implantaten darstellt. DarĂŒber hinaus konnte fĂŒr die PPAAm-Beschichtung gezeigt werden, dass Variationen in den Plasmaprozessparametern zu Unterschieden in den physikochemischen Eigenschaften und den daraus resultierenden In-vivo-Gewebsreaktionen fĂŒhren. Die Ergebnisse der Arbeit wurden in vier wissenschaftlichen Fachzeitschriften veröffentlicht (Walschus et al. 2011 J Microsc 242:94â99; Schröder et al. 2010 J Adh Sci Technol 24:1191â1205; Hoene et al. 2010 Acta Biomater 6:676â683; Walschus et al. 2012 J Mater Sci Mater Med 23:1299â1307).
Der Einfluss von Leptin und Resistin auf die postnatale Entwicklung des Nebenhodenepithels der Ratte
(2007)
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Nachweis von Leptin und Resistin mittels immunhistochemischer Methoden. Im Vordergrund stand dabei die Frage einer positiven Leptin- und Resistinreaktion im periepididymalen Fettgewebe zum Zeitpunkt der Ausdifferenzierung des Nebenhodenepithels sowie einer gleichzeitigen positiven Rezeptorreaktion im Hypothalamus. Dazu erfolgte der immunhistochemische Nachweis von Leptin, Resistin, Ob- R und Insulinrezeptor im Bereich des Nebenhodens, des Hypothalamus, des Pankreas und der Lunge mĂ€nnlicher Ratten im Alter von 35- 65 d. p. p. Die Untersuchungen ergaben eine positive Reaktion der Hormone und Rezeptoren in allen Organen, auĂer beim Nachweis von Resistin im Bereich des Hypothalamus. Es fanden sich nur gerinfĂŒgige IntensitĂ€tsunterschiede zwischen dem 35. und 65. d. p. p., ein zeitlicher Peak der Hormonkonzentration zum Zeitpunkt der Ausdifferenzierung des Nebenhodenepithels war nicht erkennbar. Somit ist eine regulatorische Funktion von Leptin und Resistin bezĂŒglich der mĂ€nnlichen Reproduktion zwar anzunehmen, jedoch ist diese sicher nicht von herausragender Bedeutung.
Die Neurotrophine (Nerve Growth Factor, Brain-derived Neurotrophic Factor, Neurotrophin-3 und Neurotrophin-4/5) zĂ€hlen zu den wichtigsten Wachstumsfaktoren des Nervensystems und sind von groĂer Bedeutung fĂŒr Gehirnentwicklung und neuronale PlastizitĂ€t. Sie vermitteln ihr Wirkungen ĂŒber zwei Rezeptorsysteme: Trk-Rezeptoren binden Neurotrophine spezifisch und mit hoher AffinitĂ€t. Sie aktivieren anti-apoptotische, wachstums- und differenzierungsfördernde Signalwege. Der niedrigaffine p75-Neurotrophinrezeptor (p75) hingegen kann Rezeptorkomplexe mit verschiedenen Ko-Rezeptoren und einer Vielzahl von Liganden bilden. Das Spektrum seiner möglichen Effekte ist beachtlich, wobei pro-apoptotische und wachstumshemmende Wirkungen ĂŒberwiegen. Interessanterweise kommt es bei einer Reihe von pathologischen Prozessen zu einer vermehrten Expression von p75, etwa bei Morbus Alzheimer, Amyotropher Lateralsklerose, Chorea Huntington und nach Gehirnverletzungen. Inhibitoren der pro-apoptotischen und wachstumshemmenden Wirkung bergen Potenzial fĂŒr die Therapie dieser Krankheitsbilder. Transgene p75-Knockout-Modelle sind ein wichtiges Instrument fĂŒr ein besseres VerstĂ€ndnis des Rezeptors. Aus den bisher vorliegenden Daten zu Morphologie und Verhalten solcher MĂ€use ergibt sich jedoch ein widersprĂŒchliches Bild. Im gesunden adulten Nervensystem wird p75 insbesondere durch cholinerge Neurone des basalen Vorderhirns (BFCN) exprimiert. In mehreren Studien wurde bei p75-defizienten MausstĂ€mmen eine Hypertrophie der BFCN und der cholinergen Innervation des Hippocampus beobachtet. FĂŒr ein weiteres wichtiges Zielgebiet von BFCN-Projektionen, die basolaterale Amygdala (BLA), liegen bisher jedoch keine Daten vor. Ein Ziel dieser Arbeit war daher die Erfassung der cholinergen Innervationsdichte dieses Kerngebiets bei jungen und gealterten p75-Knockout-Tieren und Vergleich mit den entsprechenden Wildtyp-Kontrollen. In allen Altersgruppen war bei p75-Defizienz eine erhöhte Faserdichte nachweisbar. Im Hippocampus unterliegen die cholinergen Neuriten bei Knockout-Tieren einer verstĂ€rkten Degeneration im Alter. Dieser Effekt trat in der BLA nicht auf. Da im adulten Hippocampus p75 physiologischerweise exprimiert wird, in der adulten Amygdala jedoch nicht, weist dies auf eine trophische Wirkung des Rezeptors fĂŒr hippocampale cholinerge Neurone hin, die vermutlich in Assoziation mit Trk-Rezeptoren vermittelt werden. Eine Testung höherer Verhaltensfunktionen bei p75-Defizienz erbringt Hinweise auf die funktionellen Auswirkungen der morphologischen VerĂ€nderungen. Bisherige Studien zeigen Abweichungen bei lokomotorischer AktivitĂ€t, Angstverhalten und rĂ€umlichem Lernen, sind jedoch im Detail widersprĂŒchlich. Geringe KohortengröĂen und ungenaue Angaben zur TestdurchfĂŒhrung schrĂ€nken die Aussagekraft teilweise ein. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher die PrĂŒfung dieser Verhaltensfunktionen bei p75-Defizienz mittels standardisierter Testmodelle unter Verwendung gröĂerer Testkohorten. Im Open Field-Versuch wiesen Knockout-Tiere eine erhöhte motorische AktivitĂ€t auf. Im Holeboard-Versuch zeigte sich jedoch keine begleitende Zunahme zielgerichteter Exploration. In der Dark/Light Box fiel ein signifikanter Gruppenunterschied im Einfluss der zirkadianen Rhythmik auf das Verhalten in diesem Testmodell auf. Dies erschwert die Testinterpretation, trĂ€gt jedoch auch zur ErklĂ€rung der Diskrepanzen in der Literatur bei. Im Morris Water Maze zeigten Knockout-Tiere deutliche Defizite beim rĂ€umlichen Lernen. Als Ursache der VerhaltensauffĂ€lligkeiten kommen VerĂ€nderungen des cholinergen Systems, der neuronalen PlastizitĂ€t und der zirkadianen Rhythmik in Betracht. Zudem sind VerĂ€nderungen weiterer Transmittersysteme wahrscheinlich. Die Untersuchung dieser Systeme und die DurchfĂŒhrung spezialisierter Verhaltenstests sind interessante Ansatzpunkte fĂŒr zukĂŒnftige Studien.