Doctoral Thesis
Podozyten, die hochspezialisierten viszeralen Epithelzellen des Glomerulus, bedecken die Außenseite der glomerulären Kapillaren und sind für die Filtration des Blutes in der Niere essentiell. Eine Schädigung der Podozyten geht mit dem Verlust ihrer komplexen dreidimensionalen Struktur, dem sogenannten Fußfortsatz-Effacement einher. Effacement und Detachment, das Ablösen der Podozyten von der glomerulären Basalmembran, führen zur Ausscheidung von hochmolekularen Proteinen mit dem Urin und in vielen Fällen zu einer nicht heilbaren chronischen Nierenerkrankung (CKD). In der Vergangenheit wurde anhand von Zellkulturstudien und Versuchen an Ratten und Mäusen die These aufgestellt, dass Podozyten entlang der glomerulären Basalmembran wandern können. Da diese Experimente jedoch bisher nicht eindeutig belegen konnten, dass es sich bei den beobachteten Zellen tatsächlich um vollständig differenzierte Podozyten handelte und diese Fragestellung für das Verständnis der Pathogenese chronischer Nierenerkrankungen und damit für die Entwicklung neuer Therapieverfahren von wesentlicher Bedeutung ist, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Verfahren entwickelt, Fluoreszenz-markierte Podozyten in vivo in lebenden Zebrafischlarven zu beobachten. Dazu wurde zunächst durch Kreuzung ein transgener Zebrafischstamm generiert, dessen Larven vollständig transparent sind und das grün-fluoreszierende Protein unter Kontrolle des wt1a-Promoters in Podozyten exprimieren. Mit der 2-Photonenmikroskopie konnten nun in Langzeitaufnahmen einzelne Podozyten in fünf bis sechs Tage alten Zebrafischlarven beobachtet werden. Hierbei zeigte sich eindeutig, dass Podozyten über Zeiträume von bis zu 23 Stunden nicht wandern. Da mit dieser Technik auch einzelne Primärfortsätze der Podozyten beobachtet werden können, konnte erstmals gezeigt werden, dass sich auch diese nicht signifikant innerhalb eines Beobachtungszeitraums von bis zu 23 Stunden bewegten. Als Nachweis, dass mit dieser Beobachtungsmethode dynamische Podozyten nachgewiesen werden können, wurde die Bewegung einzelner Zellen während der Bildung des Glomerulus über einen Zeitraum von 3 Tagen verfolgt. Um ferner auszuschließen, dass Podozytenfortsätze sehr schnelle, oszillierende Bewegungen vollführen, wurden einzelne Podozyten in sehr kurzen Intervallen aufgenommen und das Bewegungsmuster analysiert. Auch hier zeigten sich keine dynamischen Eigenschaften der Podozyten im lebenden Organismus. Somit kann davon ausgegangen werden, dass Podozyten unter physiologischen Bedingungen in lebenden Zebrafischlarven kein dynamisches Verhalten zeigen, sondern als statische Zellen anzusehen sind.
The global prevalence of kidney diseases has been steadily rising over the last decades. Today, around 10% of the world population suffers from relevant chronic kidney disease. Podocytes are highly specialized and terminally differentiated cells residing in the filtering units of the kidneys, the so-called glomeruli. With their interdigitating foot-processes, these cells are a crucial part of the renal filtration barrier. As podocytes are post-mitotic, injury or loss of these cells results in an impairment of the filtration barrier with subsequent loss of global kidney function. Therefore, the question whether a relevant amount of podocytes can be regenerated and if this regeneration can be influenced is crucial for future therapeutic developments. As in vivo microscopic imaging of podocytes in higher animals like mice or rats is rather challenging, larval zebrafish have been applied as an animal model for podocyte development and kidney filtration. 48 hours post fertilization, zebrafish larvae develop a single filtering glomerulus with a similar morphology and molecular construction to that in mammals. For evaluation of podocyte morphology and filtration, we used transgenic zebrafish strains in which podocytes were labeled with fluorescence proteins. Additionally, podocytes expressed the bacterial enzyme nitroreductase fused to the fluorescence protein mCherry. In this model, application of the antibiotic metronidazole leads to podocyte-specific cell death. Through cross-breeding we established strains that additionally express an eGFP-labeled protein in the blood plasma. Using in vivo two-photon microscopy, we could image podocyte-loss induced impairments of the glomerular filtration barrier. Additionally, we tracked characteristic morphological changes of podocyte morphology including podocyte foot process effacement, development of sub-podocyte pseudocysts and finally detachment of whole cells from the glomerular basement membrane. These changes have been before described histologically in different animal models as well as in patient biopsies. Using the in vivo microscopy approach, we could clearly describe the temporal sequence of these alterations. Finally, we also tracked individual, non-detached podocytes over up to 24 hours, and found that these cells were non-migratory. These results show that early podocyte-regeneration through immigration of intra- or extraglomerular cells is unlikely within the first 24 hours of acute glomerular injury.
Palladin, ein Aktin-assoziiertes Protein, beeinflusst die Morphologie, Migration, Adhäsion und Polarität von Zellen maßgeblich. Zudem wurde bereits in klinischen Studien gezeigt, dass ein Zusammenhang zwischen der Expression von Palladin und der Metastasierungsfähigkeit von Tumoren besteht. Das Studium der Funktion von Palladin in vivo ist aufgrund der bereits intrauterinen Letalität eines Palladin-Knockouts in der Maus nicht möglich. Daher wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit der Zebrafisch als Modellorganismus für die Untersuchung der Funktion von Palladin verwendet. Durch Mikroinjektion von sogenannten Morpholinos in die befruchteten Zebrafischeier konnte Palladin herunterreguliert werden. Mittels Western Blot und RT-PCR wurde diese Abnahme von Palladin bestätigt. In Analogie zur Maus führte der Kockdown von Palladin zu einem letalen Phänotyp zum Zeitpunkt 11-18 hpf, das auf schwere Entwicklungsschäden zurück zu führen ist. Um Zebrafischlarven mit einem Palladin Knockdown dennoch histologisch genauer untersuchen zu können, wurde ein sogenannter Mosaikphänotyp erzeugt. Hierbei zeigte sich, dass die Ausbildung geordneter Aktin-Filamente in den Myotomen gestört war. Mit Hilfe der in vivo Mikroskopie konnte ferner an lebenden Palladin-Knockdown Zebrafischlarven zum Zeitpunkt 6 und 8.5 hpf erstmals gezeigt werden, dass der Verlust von Palladin zu einer veränderten Migration von Zellen und zur Instabilität von Zell-Zell bzw. Zell-Matrix Kontakten führt. Durch eine Gene Array Analyse der Palladin-Knockdown Larven (10 hpf) konnte gezeigt werden, dass 1335 von 8200 Proteinen in Abhängigkeit der Palladin-Expression signifikant in ihrer Regulation verändert waren. Dabei sind unter den hoch- bzw. herunterregulierten Proteinen auch solche Proteine vertreten, die einen entscheidenden Einfluss auf das Aktin-Zytoskelett und auf Zell-Matrix- bzw. Zell-Zell-Kontakte haben. Zusammenfassend zeigte sich, dass der Zebrafisch ein ideales Tiermodel ist, um die Rolle von Palladin in vivo zu untersuchen.
