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Zerebrale kavernöse Malformationen (CCMs) sind Gefäßfehlbildungen im Gehirn oder Rückenmark und können sich klinisch aufgrund einer erhöhten Blutungsbereitschaft mit Kopfschmerzen, Gefühls- und Sprachstörungen bis hin zu Krampfanfällen äußern. Sie treten sporadisch oder im Rahmen einer autosomal-dominant erblichen Form auf. Kausale Sequenzveränderungen sind dabei in den drei Genen CCM1, CCM2 und CCM3 bekannt. Die Detektionsrate für pathogene Varianten ist mit bis zu 60 % für sporadische Fälle und mit weit über 90 % für familiäre Fälle sehr hoch. Während Genpanel-Analysen sehr verlässlich Einzelnukleotidveränderungen, kleine Insertions- und Deletionsvarianten sowie Kopienzahlveränderungen detektieren können, werden komplexe Strukturvarianten oder Veränderungen in nicht-kodierenden Regionen kaum erfasst. Diese rücken jedoch für die bisher genetisch unaufgeklärten Fälle immer mehr in den Fokus des Interesses. Diese Arbeit adressiert daher zum einen die Identifizierung neuer Strukturvarianten und deren funktionale Interpretation im Kontext der CCM-Erkrankung.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist der erstmalige Nachweis einer interchromosomalen Insertion bei einem CCM-Patienten gelungen. Die unbalancierte Insertion genomischen Materials von Chromosom 1 in die kodierende Region des CCM2-Gens konnte durch die Verbindung von bioinformatischen Auswertestrategien der Next Generation Sequencing-Genpanel-Daten, molekularzytogenetischen Analysen und einer molekularen Bruchpunktkartierung genau charakterisiert werden. Die Identifikation einer weiteren Strukturvariante, einer Deletion des Transkriptionsstarts von CCM1, verdeutlichte die Herausforderungen bei der Bewertung von Veränderungen in nicht-kodierenden Genbereichen. Für eine eindeutige Klassifikation der Variante wurden daher funktionale Analysen durchgeführt, die auf einer CRISPR/Cas9-vermittelten Nachbildung der Deletion in iPSCs und der anschließenden Differenzierung in Endothelzellen beruhte. Damit konnte gezeigt werden, dass die Deletion zu einem Verlust der CCM1 mRNA- und Proteinexpression führt. Zudem wurde in den differenzierten Endothelzellen eine für die CCM-Pathogenese charakteristische Deregulation von KLF2, THBS1, NOS3 und HEY2 beobachtet. Schließlich war es auf Basis dieser in vitro-Analysen möglich, die Variante entsprechend den ACMG-Richtlinien als wahrscheinlich pathogen zu bewerten und somit die molekulare CCM-Diagnose zu sichern.
Die Verbindung des CRISPR/Cas9-Systems mit iPSCs ist nicht nur für die Variantenbewertung von großem Nutzen, sondern bietet auch das Potential zum besseren Verständnis von Krankheitsmechanismen. Ein weiterer Fokus der vorliegenden Arbeit lag daher auf der Etablierung und Verwendung iPSC-basierter Zellkulturmodelle für die CCM-Modellierung. Zunächst ist es gelungen, mehrere iPSC-Linien mit einer kompletten CRISPR/Cas9-vermittelten CCM1-, CCM2- oder CCM3-Inaktivierung zu generieren. Diese wurden anschließend für die Differenzierung in hBMEC-ähnliche Zellen und innovative dreidimensionale vaskuläre Organoide verwendet. In diesen Systemen konnte beispielsweise eindrücklich eine tumorähnliche Proliferation CCM3-defizienter Endothelzellen nachvollzogen werden, die nur in Kontakt mit Wildtyp-Zellen auftrat. RNA-Sequenzierungen in einem CCM1-basierten Knockout-Modell konnten darüber hinaus die Rolle von CCM1 als Endothel-spezifisches Suppressorgen stärken. Die im Rahmen der Arbeit etablierten Systeme werden zukünftig für weitere Fragestellungen der CCM-Pathogenese wie der endothelialen Barrierestörung eingesetzt und stellen darüber hinaus sehr gut geeignete Plattformen für die effektive Entwicklung dringend benötigter therapeutischer Ansätze dar.
Herpesviruses are enveloped DNA viruses which are dependent on two fusion steps for efficient replication in the host cell. First, they have to fuse their envelope with the cellular plasma membrane or with the vesicle membrane after endocytic uptake to enter the host cell and second, they have to export the newly generated nucleocapsids from the site of assembly to the cytoplasm by fusion of the primary virion envelope with the outer nuclear membrane (ONM). The main goal of this project was to provide a better understanding of how herpesvirus capsids exit the nucleus. On the one hand this thesis aimed at finding cellular proteins involved in nuclear egress (Paper I), while on the other the focus was on further characterization of the viral nuclear egress complex (NEC, Paper II) and its interaction with the capsid (Paper III).
It is the hallmark of viruses, including herpesviruses, to hijack host cell proteins for their efficient replication. Some of those interactions are well characterized, while others might not yet have been discovered. In the last step of the nuclear egress, where the primary virion membrane fuses with the ONM, most likely a cellular machinery is involved. The presented work focused on Torsin, the only known AAA+ ATPase localizing in the endoplasmic reticulum and the perinuclear space (PNS). For this, the effect of overexpression of WT and mutant proteins, as well as CRISPR/Cas9 generated knock-out cell lines, on PrV replication was analyzed. Neither single overexpression nor single knockouts of TorA or TorB had any significant effects on virus titers. However, infection of TorA/B double knockout cells revealed reduced viral titers and an accumulation of primary virions in the PNS at early infection times, indicating a delay in nuclear egress.
The process of nuclear egress has been intensively investigated without revealing all its details. To address some of the missing aspects we generated monoclonal antibodies (mAbs) against the NEC and its components (pUL31 and pUL34) for a better visualization of the process in transfected as well as infected cells. These mAbs provide a useful tool for future analyses.
The publication of the NEC crystal structure formed the basis for intensive research on the molecular details of the NEC formation and its interaction with the nucleocapsid. Recently, our lab showed that lysine (K) at position 242 in the membrane-distal part of pUL31 is crucial for incorporation of the nucleocapsid into budding vesicles. Replacing K by alanine (A) resulted in accumulations of vesicles in the PNS, while mature capsids were not incorporated. To test whether this is due to electrostatic interference or structural restrictions we substituted K242 by different aa to determine the requirements for nucleocapsid uptake into the nascent primary particles. To analyze whether the defect of pUL31-K242A can be compensated by second-site mutations, PrV-UL31-K242A was passaged and mutations in revertants were analyzed. Different mutations have been identified compensating for the K242A defect. A considerable number of mutations indicates that the NEC is much more flexible than previously thought. Further, we gained information that the K at position 242 is not directly involved in capsid interaction, while it is more likely involved in rearrangements within the NEC coat.