Doctoral Thesis
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Today the process of improving technology and software allows to create, save and explore massive data sets in little time. "Big Data" are everywhere such as in social networks, meteorology, customers’ behaviour – and in biology. The Omics research field, standing for the organism-wide data exploration and analysis, is an example of biological research that has to deal with "Big Data" challenges. Possible challenges are for instance effcient storage and cataloguing of the data sets and finally the qualitative analysis and exploration of the information. In the last decade largescale genome-wide association studies and high-throughput techniques became more effcient, more profitable and less expensive. As a consequence of this rapid development, it is easier to gather massive amounts of genomic and proteomic data. However, these data need to get evaluated, analysed and explored. Typical questions that arise in this context include: which genes are active under sever al physical states, which proteins and metabolites are available, which organisms or cell types are similar or different in their enzymes’or genes’ behaviour. For this reason and because a scientist of any "Big Data" research field wants to see the data, there is an increasing need of clear, intuitively understandable and recognizable visualization to explore the data and confirm thesis. One way to get an overview of the data sets is to cluster it. Taxonomic trees and functional classification schemes are hierarchical structures used by biologists to organize the available biological knowledge in a systematic and computer readable way (such as KEGG, GO and FUNCAT). For example, proteins and genes could be clustered according to their function in an organism. These hierarchies tend to be rather complex, and many comprise thousands of biological entities. One approach for a space-filling visualization of these hierarchical structured data sets is a treemap. Existing algorithms for producing treemaps struggle with large data sets and have several other problems. This thesis addresses some of these problems and is structured as follows. After a short review of the basic concepts from graph theory some commonly used types of treemaps and a classification of treemaps according to information visualization aspects is presented in the first chapter of this thesis. The second chapter of this thesis provides several methods to improve treemap constructions. In certain applications the researcher wants to know, how the entities in a hierarchical structure are related to each other (such as enzymes in a metabolic pathway). Therefore in the 3 third chapter of this thesis, the focus is on the construction of a suitable layout overlaying an existing treemap. This gives rise to optimization problems on geometric graphs. In addition, from a practical point of view, options for enhancing the display of the computed layout are explored to help the user perform typical tasks in this context more effciently. One important aspect of the problems on geometric graphs considered in the third chapter of the thesis is that crossings of edges in a network structure are to be minimized while certain other properties such as connectedness are maintained. Motivated by this, in the fourth chapter of this thesis, related combinatorial and computational problems are explored from a more theoretical point of view. In particular some light is shed on properties of crossing-free spanning trees in geometric graphs.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Synthese von Fettsäureestern aus Pflanzenölen mit Methanol bzw. Ethanol in Gegenwart von Wasser durch die Lipase CAL-A zu optimieren, wobei insbesondere die Bildung von freien Fettsäuren minimiert werden sollte. Zunächst wurde ein Hochdurchsatztest zur Bestimmung der Acyltransferaseaktivität der CAL-A etabliert, welcher auf der Abnahme des Alkoholgehalts in Umesterungsreaktionen basiert. Dabei zeigte sich eine gute Übereinstimmung zwischen den Umsätzen, die mit GC und dem Oxidase-Assay ermittelt wurden, wobei die Umsätze nicht zu gering sein sollten da sonst größere Schwankungen im Oxidase-Assay möglich sind. Durch das rationale Design anhand der gelösten Struktur der CAL-A konnten vier Mutagenesepositionen identifiziert werden: Thr118, Asp122, Thr221 und Glu370. Durch den Austausch der Aminosäurereste an diesen Positionen gegen hydrophobere Aminosäuren wurden 28 CAL-A Varianten generiert. Diese wurden für eine initiales, qualitatives Screening eingesetzt, indem drei CAL-A Varianten eine ähnliche bzw. erhöhte Esterbildung im Vergleich zum Wildtyp zu haben schienen. Die drei Varianten Thr118Ile, Asp122Leu und Thr221Ala wurden daraufhin für weitere Untersuchungen in P. pastoris im Bioreaktor hergestellt und in Biokatalysen verwendet. Eine erhöhte Esterbildung für die Varianten Thr118Ile und Thr221Ala ließ sich jedoch nicht bestätigen, allerdings zeigte sich, dass die CAL-A Variante Asp122Leu deutlich weniger freie Säure bildete als der CAL-A WT. In der anschließenden Charakterisierung von CAL-A Asp122Leu zeigte sich, dass diese Variante wie CAL-A WT auch thermostabil ist und dass beide Enzyme das gleiche pH- und Temperaturoptimum haben. Des Weiteren wurden CAL-A WT und Asp122Leu adsorptiv auf Lewatit VP OC 1600 immobilisiert und in Biokatalysen eingesetzt, in denen CAL-A Asp122Leu erneut deutlich weniger freie Säure bildete. Darüber hinaus wurde auch der Einfluss der Reaktionsbedingungen auf die Acyltransferaseaktivität der CAL-A untersucht. Es wurden dazu Biokatalysen mit Ethanol oder Methanol durchgeführt, in denen der Wassergehalt (5% oder 10% bezogen auf die Einwaage an Öl) und die Reaktionstemperatur (30°C, 40°C oder 50°C) variiert wurden. Die Biokatalysen mit Methanol zeigten dabei generell einen hohen Umsatz zwischen 85-95%, während die Biokatalysen mit Ethanol nur zu geringeren Umsätzen führten (55-85%). Allerdings zeigte sich in einem Langzeitstabilitätstest mit einer Biokatalysedauer von 97 h auch, dass Methanol das verwendete CAL-A Immobilisat stärker inaktiviert als Ethanol. Ebenso musste bei einem Wassergehalt von nur 5% die Methanolzugabe schrittweise erfolgen, um eine Inaktivierung des CAL-A Immobilisats zu verhindern. Somit konnte eine Optimierung der CAL A katalysierten Umesterungsreaktionen sowohl durch das Protein-Engineering des Biokatalysators als auch durch die Anpassung der Prozessbedingngen erreicht werden. Dabei wurden Erkenntnisse gewonnen, die auch zur Beurteilung der industriellen Anwendbarkeit eines solchen Prozesses beitragen können.
This thesis investigates the biocatalytic synthesis of amines and amino alcohols. The applicability and economic feasibility of biocatalysis for chiral amine synthesis is reviewed and the findings were compared to established chemical processes using relevant process parameters (TON, TOF and STY). This review clearly showcases the potential of biocatalysis for the synthesis of chiral amines and provides a valuable guide for synthetic chemists who want to benefit from these new opportunities. Next, biocatalysis is applied for the synthesis of an amino alcohol with two stereocentres: A novel route for the synthesis of all four stereoisomers of 4-amino-1-phenylpentane-2-ol is presented. Enzymes were applied to install both stereocentres successively, which allowed the selective synthesis with high yields and optical purities. A small scale preparative asymmetric transamination yielded one amino alcohol stereoisomer selectively. The approach presented in this thesis provides a valuable option for the synthesis of this compound class as it is highly selective, step efficient and circumvents the need for protecting groups as well as transition-metal catalysis. The substrate scope of an (S)-selective amine transaminase (ATA) was altered in order to expand the applicability for amino alcohol synthesis. Protein engineering was conducted to enlarge the small binding pocket. Small scale preparative synthesis of the 1,2-amino alcohol (R)-phenylglycinol exemplifies the applicability of the evolved variants for the asymmetric synthesis of this compound. The designed variants expand the collection of ATAs that are suitable for the synthesis of amino alcohols with bulkier substituents. To deepen the understanding of ATAs further, a class III TA family wide analysis (which includes (S)-selective ATAs) is presented. After comparing the active site architectures and performing literature research amino acids were identified that correlate with the reaction- and substrate specificity of the enzymes within this family. This information is compiled in a sequence-function matrix, which allows the prediction of the main activity of biochemically uncharacterised enzymes from their sequence. These insights provide a better understanding of the activity determining residues in (S)-ATAs and class III TAs in general.
Der gesamte Zellmetabolismus besteht aus einem effektiven System an Enzymkaskaden, um das Leben zu ermöglichen. Hier werden Stoffe ohne Abtrennung oder Aufarbeitung über verschiedene Intermediate selektiv zum Produkt umgesetzt. Die Ersparnis an Zeit, Kosten und Abfall durch den Wegfall von Reinigungen der Zwischenprodukte und der direkte Umsatz von toxischen oder instabilen Intermediaten zum Produkt machen Kaskadenreaktionen zu einem aktuellen und interessanten Anwendungsbereich der Biotechnologie. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte erfolgreich eine in vivo Enzymkaskade aus drei Oxidoreduktasen etabliert, untersucht und mit Fusionsproteinen verbessert werden. Zur Etablierung der in vivo Enzymkaskade aus Alkoholdehydrogenase, Enoatreduktase und Baeyer-Villiger-Monooxygenase im Rahmen eines DFG-Projekts (Bo1862/6-1) in Zusammenarbeit mit der Technischen Universität Wien wurde zunächst nach den geeigneten Enzyme gesucht. Mit einer Alkoholdehydrogenase aus Laktobacillus kefir und einer Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus ruber konnte eine Oxidation von chiralen Cyclohexenol-Derivaten und Carveolen zu den entsprechenden prochiralen Ketonen erfolgen. Im Rahmen der Suche nach geeigneten Enzymen für die Kaskade wurde von drei neuen Enoatreduktasen aus Pseudomonas putida ATCC 17453 das Substratspektrum untersucht. Die xenobiotische Reduktase A (XenA), die xenobiotische Reduktase B (XenB) und die N-Ethylmaleimid-Reduktase (NemA) akzeptierten sowohl aliphatische als auch cyclische Ketone und Aldehyde. Sehr gute Umsätze konnten mit Imiden und Carvonen nachgewiesen werden. Besonders die XenA und XenB zeigten mit über 99 % Enantiomerenüberschuss in der Bildung von Dihydrocarvonen exzellente Stereoselektivitäten. In der Enzymkaskade setzten dann die XenB oder das Old yellow enzyme (OYEI) die α,β-ungesättigen Ketone selektiv zu den chiralen Ketonen um. Diese wurde dann von der Cyclohexanon-monooxygenase (CHMO) aus Acinetobacter species in die gewünschten chirale Laktone umgesetzt. Nach erfolgreichen Klonierungen konnten alle vier Enzymkombinationen der Enzymkaskade löslich und aktiv in einem E. coli-Stamm kultiviert werden. Mit der Kombination verschiedener nicht-natürlich verbundener Biokatalysatoren konnten in vivo Cyclohexenol und einfach Methyl-substituierte Cyclohexenol-Derivate selektiv zu chiralen Laktonen umgesetzt werden. Wir konnten durch Auswahlmöglichkeiten zwischen verschiedenen Alkoholdehydrogenasen und Enoat-reduktasen modular agieren und so zum Beispiel innerhalb von 20 Stunden die Reaktion von 4 Methyl-2-cyclohexenol zu 100 % in das optisch reine Lakton in E. coli katalysieren. Auch die für die Polymerindustrie interessanten Dihydrochalconlaktone konnten mit sehr guten Umsätzen und mit über 99 %ee hergestellt werden. Nach der erfolgreichen Etablierung der Enzymkaskade wurde die Umsatzgeschwindigkeit mit Hilfe von Fusionsproteinen noch einmal gesteigert. Dafür wurde die Auswirkung von verschiedenen Linkern und die Abfolge der Enzymdomänen im Fusionsprotein aus XenB-Domäne und CHMO-Domäne untersucht. Mit dem Fusionsproteine CHMO_G_XenB konnte nach einer Stabilisierung der CHMO-Domäne ein sehr guter Biokatalysator hergestellt werden. Anwendungen in der in vivo Enzymkaskade zeigten schnellere Umsätze für Cyclohexenol und Carveol. Ein aktives Fusionsprotein aus Alkoholdehydrogenase, XenB und CHMO konnte nicht etabliert werden, da beide Alkoholdehydrogenasen aus der Enzymkaskade bei der Fusionierung inaktiviert wurden. Auch wenn kein aktives Fusionsprotein aus drei verschiedenen Enzymdomänen hergestellt werden konnte, ist mit der erstmaligen Fusion einer Enoatreduktase und einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase die neue in vivo Enzymkaskade verbessert worden. Somit konnte in dieser Doktorarbeit die erfolgreiche Anwendung von einer modularen in vivo Enzymkaskaden für die Herstellung chiraler Laktone für die Polymerchemie gezeigt werden.