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Die Bedeutung der endothelialen Mechanotransduktion für vaskuläre Implantate: Das Apelin/APJ-System.
(2014)
Bei der Behandlung atherosklerotischer Gefäße mit vaskulären Implantaten spielt nicht nur die endotheliale Dysfunktion eine wichtige Rolle. Auch die Fähigkeit des Implantatmaterials, sich an die Gefäßwand anzupassen und dessen Biokompatibilität, sind von großer Bedeutung. Die Entwicklung von wirkstofffreisetzenden Stents (DES) konnte die Risiken nach Stentimplantation signifikant reduzieren. Jedoch gibt es Hinweise darauf, dass diese polymerbeschichteten DES Ursache für die Entstehung von Stent Thrombosen (ST) sein können - eine potentiell tödliche Komplikation. Die mechanischen Eigenschaften eines Materials, das in ein Gefäß eingebracht wird, können einen großen Einfluss auf die umliegenden Zellen haben. Die Bedeutung einer solchen Veränderung in der Umgebung einer Zelle und der Einfluss auf deren mechanische Eigenschaften und biologische Funktionen wird immer häufiger als Ursache für die Entstehung von In-Stent-Restenose (ISR) und ST diskutiert. Das Endothel dient als einzigartige Barriere zwischen dem fließenden Blut und der Gefäßwand, wodurch es permanent mechanischen Reizen ausgesetzt ist. Mechanosensitive Strukturen auf der Zelloberfläche übersetzen diese Stimuli in biochemische Signale. Die anschließende Translation in downstream Effekte moduliert die Zellfunktion. Zu dem mechanosensorischen Komplex um PECAM-1 gehören auch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), welche an der flussabhängigen Regulation der NO-Freisetzung beteiligt sind. Im kardiovaskulären System werden der GPCR APJ und sein spezifischer Ligand Apelin vor allem von Endothelzellen und endokardialen Zellen exprimiert. Die Apelin-Isoformen Apelin-12 und Apelin-13 wurden in diesem Zusammenhang bisher als bioaktiv beschrieben. Obwohl das apelinerge System in vielen vaskulären Endothelzellen exprimiert wird, wurde es bisher nicht als Überträger mechanischer Reize in Betracht gezogen. In diesem Kontext ist das Ziel der vorliegenden Arbeit, zunächst die physiologische Rolle des Apelin/APJ-Systems als Mechanotransducer in humanen Endothelzellen in einem in vitro Zellperfusionsystem zu charakterisieren. Weiterhin soll der Einfluss von Stentpolymeren auf die Zellfunktion und die endotheliale Mechanotransduktion untersucht werden.
Oral drug delivery is the preferred route of administration for the majority of drugs. Solid dosage forms arewell-accepted because of ease of administration, accurate dosing and high degree of patient compliance. The orodispersible technology platform has attracted increasing interest. Fast disintegrating in the mouth before swallowing, orodispersible dosage forms like orodispersible tablets (ODTs) address the need for patient-compliant medicines. ODTs represent a convenient alternative to conventional tablets or capsules. ODTs are an interesting approach when a rapid onset of therapeutic action is important. So far, ODTs have often been considered as an innovative variant of conventional oral solid dosage forms. Still, the development of ODT formulations is typically assisted by compendial in vitro test methods. However, the techniques described in international pharmacopoeias are non-specific for ODTs. After administration, the dispersion of an ODT in the mouth may provide effects which might influence the absorption of the drug. The performance of ODTs is more comparable to solutions/suspensions than to traditional tablets. To better guide the development of a new ODT formulation, this lack needs to be addressed. It is the aim of this work to design more specific in vitro test methods helping to improve understanding ODT formulations. To reflect the physiological conditions experienced by an ODT after administration, particular attention was given to the mouth where the ODT disperses and releases the drug before swallowing. In vitro biorelevant test setups simulating in vivo conditions were designed. An electronic tongue system was used to assess taste properties of ODTs. These test methods were applied in different stages of the ODT formulation development. Diclofenac being a poorly soluble and weakly acidic NSAID which is a standard medication for acute painful inflammatory conditions was used as a drug model. Three forms, i.e. the free acid and its sodium/potassium salt, were investigated for the formulation of palatable and fast acting ODTs. In Chapter 1, the development of biorelevant test setup reflecting the physiological conditions experienced by ODTs is described in detail. The newly-designed in vitro models successfully discriminated the different diclofenac forms in successive in vitro compartments simulating the mouth, the stomach and the small intestine. It was possible to identify peculiar dissolution profiles with diclofenac salts. Characterizing in-depth the diclofenac free acid and salt particles provided a better understanding of the peculiar dissolution profiles. Critical behaviors of diclofenac salts on their way from the mouth to the stomach and passing different pH conditions were extensively evaluated. Reasons for pH-dependent API precipitation and particle agglomeration were studied in detail. In pre-formulation studies, the proposed biorelevant test setups succeeded in helping to early identify critical pharmaceutical properties for diclofenac salts and to select diclofenac free acid as the most appropriate drug form providing the most stable in vitro performance. In Chapter 2, the electronic tongue method as an in vitro taste assessment tool for ODTs is proposed. Using the TS-5000Z taste sensing system (Insent Inc., Japan), the method was able to differentiate between the taste/aftertaste qualities and intensities of the three diclofenac candidates. The electronic tongue was also successfully used to differentiate different ODT formulations. The results obtained proved that valuable information can be gained. By this means, the taste perception of the diclofenac drug candidates were classified and rank against each other. For manufacturing taste-masked ODTs, diclofenac free acid, could be selected easily. The electronic tongue found out to be a precious tool in assisting the development of a new ODT product and finding the most appropriate multi-component formulation. Both proposed methods successfully showed their discriminative ability and also their utility in pre-formulation studies of ODTs. In the previous chapters, it was indeed possible to early select diclofenac free acid as the most suitable drug candidate for the targeted product profile. In Chapter 3, said methods were further used to guide the development of the taste masked diclofenac ODT formulation. This study highlights the importance of considering in vitro the physiological aspects which may have an impact on the in vivo performance of ODT dosage forms. The contact of ODTs with the mouth should be simulated in vitro for a better understanding of the in vivo behavior. With feasible biorelevant in vitro dissolution methods, an optimized correlation of in vitro and in vivo results may be achieved. The proposed in vitro test methods may provide data of predictive value and may support the rational development of ODT formulations.
Die Verlängerung des Aufenthalts einer Arzneiform im Magen kann enorme Vorteile insbesondere für Arzneistoffe mit einem Absorptionsfenster im oberen Dünndarm oder schlechter Bioverfügbarkeit bieten. Bei gleichzeitig kontrollierter Freisetzung eines enthaltenen Wirkstoffs können Plasmaspitzen und Fluktuationen im Blutplasma vermieden werden. Ziel der Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung solcher potentiell gastroretentiver Darreichungsformen in vitro und in vivo. Der Hauptteil der Arbeit umfasste die Entwicklung einer neuartigen Arzneiform, die bei nüchterner und postprandialer Gabe eine zuverlässige Gastroretention über mehrere Stunden zeigen und den Wirkstoff kontrolliert im Magen freigeben sollte. Das System bestand aus einer wirkstoffhaltigen Kerntablette und einem den Kern umgebenden, quellenden Mantel, welcher durch Expansion die angestrebte Gastroretention ermöglichen sollte. Im Rahmen der Formulierungsentwicklung erwies sich die Mischung aus einem hoch- und niedrigmolekularen Polyethylenoxid als geeignet für die Kontrolle der Wirkstofffreisetzung aus dem Kern. Die Ergänzung wasserlöslicher, osmotischer Hilfsstoffe ermöglichte eine weitgehend pH-unabhängige und vollständige Wirkstofffreigabe. In vitro-Quellungsstudien mit den entwickelten Manteltabletten ergaben eine schnelle und ausgeprägte Größenzunahme bei Testung in einfachen Freisetzungsmedien. Zur Prüfung des tatsächlichen gastroretentiven Potentials der entwickelten Manteltabletten mit dem Diuretikum Furosemid wurde eine Magnetic Marker Monitoring (MMM)-Studie durchgeführt. Das MMM basiert auf der magnetischen Markierung einer Arzneiform und der Bestimmung ihrer Lokalisation im Gastrointestinaltrakt mittels empfindlicher Sensoren. Nach Nüchterneinnahme wurden die Manteltabletten innerhalb von 38 ± 12 min aus dem Magen der Probanden entleert. Bei Applikation der Manteltabletten nach Einnahme einer hochkalorischen, standardisierten Mahlzeit konnte eine durchschnittliche Gastroretentionszeit von 8 ± 3 h erzielt werden. Die AUC(0-24 h) konnte im Studienarm mit Nahrung im Vergleich zur Nüchterneinnahme von 89 ± 56 ng·h/mL auf 708 ± 304 ng·h/mL gesteigert werden. Weiterhin wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein neuartiges mechanisches Antrummodell entwickelt, mit dem der Einfluss antraler Kontraktionswellen auf die Tendenz zur Entleerung von Objekten untersucht wurde. Große, starre Objekte wie eine Glaskugel wurden aufgrund ihrer geringen Reibung vor der Welle hergeschoben und aus dem Modell entleert. Auch die reibungsverminderte Oberfläche eines Cryogel-Schaums erhöhte die Tendenz zur Entleerung aus dem Modell. Vielversprechend war dagegen die unter allen variablen Testbedingungen beobachtete Gastroretention eines Trichobezoars. Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass weiterhin eine große Herausforderung in der Entwicklung von Arzneiformen besteht, die eine nachweisliche Gastroretention beim Menschen in Abwesenheit von Nahrung zeigen.
In der modernen Augenheilkunde werden Injektionen und Implantate in periokulare Regionen oder direkt in den Glaskörper injiziert. Bei der Entwicklung neuer ophthalmologischer Implantate und Injektionen ist die In vitro-Testung der Wirkstofffreigabe und -verteilung von großer Bedeutung. Dabei stellen viele Testmethoden die In vivo-Situation nicht ausreichend dar. Einerseits bilden die Gewebe des Auges wie beispielsweise die Konjunktiva oder die Sklera Barrieren für den Transport des Arzneistoffes zum Wirkort. Andererseits ist der Einfluss der Gefäßsysteme von Konjunktiva und Choroidea auf die Verteilung und Elimination des Arzneistoffes zu berücksichtigen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Gewebe des Auges hinsichtlich ihrer Permeabilitätseigenschaften untersucht. Als Ergebnis wurden die Permeabilitätskoeffizienten von Ciprofloxacin, Lidocain, Timolol und Dexamethason für die Sklera, Konjunktiva, Kornea, den Retina-Choroidea-Komplex sowie für Kombinationen der aufgezählten Gewebe des Schweineauges erhalten. Als weitere Tiermodelle finden Gewebe von Rinder- und vor allem Kaninchenaugen in der ophthalmologischen Forschung Anwendung. Aus diesem Grund wurden die Permeabilitätsstudien um die Membranen dieser zwei Spezies erweitert. Der Interspezies-Vergleich zeigte sehr große Unterschiede in den Permeabilitäten der Wirkstoffe durch die Gewebe auf, sodass die direkte Übertragbarkeit von Ergebnissen zwischen den Tieren und auf den Menschen nicht gewährleistet ist. Um die Barriere-Eigenschaften der Augengewebe in ein In vitro-Modell zu integrieren wurden synthetische Membranen, die mit den Permeabilitätseigenschaften der Gewebe des Schweineauges übereinstimmen, identifiziert. Diese Membranen wurden zur Simulation der natürlichen Gewebe des Auges in den Mittelteil der neu entwickelten Zwei-Kanal-Durchflusszelle eingespannt. Die Zwei-Kanal-Durchflusszelle besteht aus drei Teilen, wobei die zwei äußeren Akzeptor-Kompartimente je einen Flusskanal, der mit Ringer-Puffer perfundiert wird, enthalten. Durch Etablierung physiologischer Flussraten entlang der korrespondierenden Membranen wurde der konjunktivale und choroidale Blutfluss und somit die Permeabilitäten der Gewebe als auch der Einfluss der Blutgefäße zusammen in einem In vitro-Modell berücksichtigt. Um den Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit in den Flusskanälen und des osmotischen Verhältnis zwischen Probe und Perfusionsmedium auf die Wirkstoffverteilung im System zu untersuchen, wurde eines der zwei Akzeptor-Kompartimente durch eine für Puffer und Wirkstoff undurchlässige Scheibe dicht verschlossen, sodass der Stofftransport nur in eine Richtung sattfinden konnte. Die Ergebnisse zeigten einen bedeutenden Einfluss dieser beiden Parameter auf die Wirkstoffverteilung. Bei Zuschaltung des zweiten perfundierten Akzeptor-Kompartiments der Zwei-Kanal-Durchflusszelle treten zwischen den Kompartimenten vermutlich Kräfte wie zum Beispiel Querströmungen und hydrostatische Druckgefälle auf. Basierend auf den erhaltenen Verteilungskurven der Wirkstoffe in der Zwei-Kanal-Durchflusszelle kann reine konzentrationsgesteuerte Diffusion durch die Membranen als alleiniger Transportmechanismus ausgeschlossen werden. Die beschriebenen Effekte müssen vor der Etablierung der Zwei-Kanal-Durchflusszelle als biorelevante In vitro-Methode für die Charakterisierung von periokularen Injektionen und Implantaten in weiteren Arbeiten durch Änderungen des Modelldesigns behoben werden. Neben den peripheren Geweben des Auges dient der Glaskörper als Applikationsort für Injektionen makromolekularer Arzneistoffe und Implantate, die den inkorporierten Arzneistoff über einen längeren Zeitraum freigeben. Die intravitreale Freisetzung und Verteilung des Wirkstoffes ist für den therapeutischen Effekt von entscheidender Bedeutung. Um diese Prozesse in vitro zu charakterisieren wurde das Glaskörper-Modell entwickelt. Die Form und das Volumen des kugelförmigen Glaskorpus sind an die Geometrie des menschlichen Glaskörpers angepasst. Als Substitut für den natürlichen Glaskörper wurde ein Polyacrylamid-Gel modifiziert, sodass dieses in ausgewählten physiko-chemischen Eigenschaften dem natürlichen Glaskörper entspricht. Nach der Applikation des Wirkstoffes direkt in den Glaskörper muss dieser durch passive oder aktive Transportprozesse an den Wirkort im hinteren Augenabschnitt gelangen. Dabei wird die Wirkstoffverteilung im Glaskörper durch die Augenbewegung maßgeblich beeinflusst. Die Simulation verschiedener Augenbewegungen wurde mit der Entwicklung des Eye Movement Systems in ein In vitro-Modell umgesetzt. Das System ist in der Lage Geschwindigkeiten und Amplituden von langsamen bis schnellen Folgebewegungen, Sakkaden und Mikrosakkaden des Auges nachzuahmen. In die zentrale Halterung des Eye Movement Systems kann das Glaskörper-Modell integriert werden. Die Kombination aus Eye Movement System und Glaskörper-Modell bietet die Möglichkeit den Einfluss der verschiedenen Augenbewegungen auf das Freisetzungs- und Verteilungsverhalten von intravitrealen Injektionen und Implantaten zu untersuchen. Nach erfolgreicher Inbetriebnahme der beiden Systeme wurden Verteilungsstudien mit Modellarzneistoffen verschiedener Molekularmassen durchgeführt. Die Ergebnisse der Studien zeigten, dass das Molekulargewicht im vollständig mit Gel gefüllten Glaskörper-Modell Einfluss auf die Geschwindigkeit der vermuteten Umverteilungsprozesse im Glaskörper-Substitut hat. Mit zunehmendem Anteil der flüssigen Phase im Glaskörper-Modell unterschieden sich die erhaltenen Verteilungen zwischen den Versuchen mit und ohne Bewegung deutlich. Bei der Simulation der hinteren Glaskörperablösung besitzt die Bewegung des Modells einen essentiellen Effekt auf die Konvektions- und Umverteilungsprozesse im Glaskörper-Modell. Durch das Ersetzen prozentualer Anteile des Gels durch Ringer-Puffer konnten Bedingungen der hinteren Glaskörperablösung simuliert werden. Die Simulation des Alterungsprozesses bewirkte eine Zunahme der Konvektion im Glaskörper-Modell. Als Folge resultierte eine deutlich schnellere Umverteilung der injizierten Modellarzneistoffe. Die hintere Glaskörperablösung besitzt demzufolge einen großen Einfluss auf die Verteilung und darf in In vivo- und In vitro-Studien nicht vernachlässigt werden. Mit der Zwei-Kanal-Durchflusszelle und der Kombination aus Eye Movement System und Glaskörper-Modell sind Konzepte für die Charakterisierung von periokularen und intravitrealen Arzneiformen entwickelt worden. In den Modellen wurde besonderer Wert auf die Anlehnung an die In vivo-Situation gelegt. Durch die Berücksichtigung der okularen Blutflüsse, die Simulation der Permeabilitätseigenschaften bestimmter Gewebe des Auges durch entsprechende synthetische Membranen, die Etablierung verschiedener Arten der Augenbewegung und der Simulation des Glaskörpers durch das Polyacrylamid-Gel wurden biorelevante Voraussetzungen geschaffen, die bisher in keinen anderen In vitro- Modellen zu finden sind. Vor der Etablierung der Zwei-Kammer-Durchflusszelle sind weitere Maßnahmen zur Unterbindung der physikalischen Störfaktoren nötig. Der theoretische Ansatz der Zwei-Kammer-Durchflusszelle konnte noch nicht in die Praxis umgesetzt werden. Unter Verwendung des Eye Movement Systems und des Glaskörper-Modells wird eine kostengünstige, einfache und schnelle Charakterisierung neuartiger intravitrealer Injektionen und Implantate unter In vitro- Bedingungen möglich. Die methodische Etablierung des Eye Movement Systems ist erfolgt. Durch weitere Modifikationen kann das System in Zukunft noch näher an die In vivo-Situation herangeführt werden.
Heparin is an anticoagulant drug. It is important in the treatment of deep vein thrombosis,pulmonary embolism and during surgeries. Heparin-induced thrombocytopenia (HIT) is a severe adverse reaction caused by the formation of ultralarge complexes of platelet factor 4 (PF4) with unfractionated heparin (UFH). It can lead to limb loss or fatal events like stroke, myocardial infarction or pulmonary embolism. HIT has an incidence of about 3% in patients receiving anticoagulative heparin treatment. PF4 is a tetrameric protein, released from the α-granules of platelets upon activation. PF4 is known to form antigenic complexes with UFH accompanied by structural changes of PF4. In this thesis, the size and size distribution of PF4 and PF4/heparin complexes were analyzed using asymmetrical flow field-flow-fractionation (AF4), photon correlation spectroscopy (PCS) and atomic force microscopy (AFM). PF4 tends to form auto-aggregates and to adsorb to different surfaces, including regenerated cellulose, polyethersulfone, quartz and glass. The aggregates are less pronounced in solutions at isotonic NaCl concentration. Arginine and Tween 20 were identified as possible ingredients to hinder the auto-aggregation of PF4. Also, it is shown by combining circular dichroism (CD) spectroscopy, atomic force microscopy (AFM) and isothermal titration calorimetry (ITC) with UFH and defined chain length (16-, 8-, 6-, 5-mer) heparins that structural changes (i.e., increase in β-sheets) alone are not sufficient to induce antigenicity. While UFH, 16-, 8-, and 6-mer heparins all induced an increase in the antiparallel β-sheet content to > 30% (as determined by CD spectroscopy), complex antigenicity as measured by anti-PF4/heparin antibody binding in an enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) was only induced by UFH and 16-mer heparin. Fondaparinux (5-mer heparin), which forms in vitro non-antigenic complexes with PF4, did not induce structural changes of PF4. Interestingly, the structural changes induced by antigenic UFH and 16-mer heparin but not by non-antigenic shorter heparins were reversible at higher heparin concentrations. Furthermore, the complexes formed by PF4 with longer heparins were larger than those formed with shorter heparins as shown by atomic force microscopy (AFM). UFH, HO16 and HO08 are able to form ultralarge multimolecular complexes with PF4. ITC data indicated strong electrostatic interactions and energetically unfavorable conformational changes of PF4 with longer heparins, while for the short heparins, favorable conformational changes in the structure of PF4 are induced. This explains the reversibility of the structural changes seen for UFH and HO16 upon addition of an over-saturating amount of heparin. Finally, using differential scanning calorimetry (DSC) the thermal stability of PF4 and PF4/heparin complexes was assessed. Despite its tendency to form auto-aggregates, PF4 is a heat-stable protein. This stability is, length dependently, even increased in complex with heparins. This work shows important differences in the binding between PF4 and heparins of different chain length and might be relevant for the understanding of other biological functions of heparins (e.g., involvement in allergic and inflammatory reactions).
In der vorliegenden Arbeit sollten zwei verschiedene Wirkstoffklassen auf ihre Fähigkeit Apoptose und Autophagozytose zu aktivieren analysiert werden. Dabei wurden 39 Sigma-Rezeptor-Liganden, die an der Universität Münster (Arbeitsgruppe von Prof. Bernhard Wünsch) synthetisiert wurden, zunächst auf ihre antiproliferativen Eigenschaften in acht humanen Krebszelllinien untersucht. Anhand der Struktur-Wirkungs-Beziehungen konnte gezeigt werden, dass sich große, raumfüllende Substituenten an beiden N-Atomen des Piperazin-Grundgerüstes positiv auf die Hemmung des Zellwachstums auswirken. Da die Multiple Myelom Zellinie RPMI 8226 eine hohe Dichte an Sigma-Rezeptoren exprimiert, wurde sie für weitere Versuche herangezogen. Als repräsentative Liganden wurde das Enantiomerenpaar (S)-11 und (R)-11 für weitere Versuche ausgewählt, da es neben einer guten Affinität zu beiden Rezeptor-Subtypen auch antiproliferierende Eigenschaften in der RPMI 8226-Zelllinie zeigte. Die Behandlung führte zur zeitabhängigen Induktion der Apoptose, die mit den typischen Charakteristika wie morphologische Membranausstülpungen, Annexin-V positive Zellen und der Chromatinkondensation einherging. Die Detektion von aktivierter Caspase-3, -8 und -9 im Durchflusszytometer deutete zunächst auf eine Beteiligung beider Signalwege der Apoptose hin. Da im Western Blot keine Caspase-9-Spaltprodukte detektiert werden konnten und auch die Vorinkubation mit den Caspase-Inhibitoren z-VAD-FMK und M50054 keinen Effekt auf die Apoptoserate bewirkte, scheinen die Caspasen im Sigma-Ligand-vermittelten Zelltod eine untergeordnete Rolle einzunehmen. Die frühe Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials verbunden mit der zunehmenden Konzentration des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) im Zytosol der RPMI 8226-Zellen deuten ebenfalls auf eine Caspase-unabhängige Form der Apoptose hin, die besonders für Sigma(2)-Agonisten bereits beschrieben ist. Und auch in diesem Projekt zeigen die Sigma-Liganden zytotoxische Aktivitäten, wenn sie eine Affinität zum Sigma(2)-Rezeptor aufweisen. Neben der Apoptose konnten (S)-11 und (R)-11 auch die Autophagozytose induzieren. Dieser Prozess scheint jedoch der Apoptose nachgeschaltet zu sein und weist darauf hin, dass es sich nicht um einen Schutzmechanismus der Zelle handelt, sondern eher in einer direkten Form des programmierten Zelltodes vom Typ II begründet ist. Dieser ist bisher noch nicht für Sigma-Rezeptor-Liganden beschrieben und könnte einen Vorteil gegenüber anderen Vertretern dieser Wirkstoffklasse darstellen. Eine Gemeinsamkeit von Sigma-Ligand-induzierter Apoptose und Autophagozytose liegt in ihrer Aktivierung durch die Lipidperoxidation. Es wurde ein sehr früher Anstieg von LPO-Produkten detektiert, der sich nur durch das lipophile Antioxidans alpha-Tocopherol beeinflussen ließ. Desweiteren konnte die antiproliferierende Wirkung von (S)- 11 und (R)-11 im MTT-Assay komplett blockiert werden, und auch die Apoptoseraten wurden durch den Radikalfänger signifikant erniedrigt. Die Hemmung der LC3-II-Expression im Western Blot durch alpha-Tocopherol verdeutlicht auch hier die Beteiligung der LPO an der Autophagozytose. Als Vertreter einer weiteren Wirkstoffklasse wurde der phtoaktivierbare Pt(IV)-Komplex FM 165, der in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Peter Sadler (Universität Warwick, UK) synthetisiert wurde, untersucht. Die antiproliferierenden Eigenschaften der photoaktivierbaren Pt(IV)-Verbindung können nicht mit der Apoptose als Zelltodmechanismus begründet werden. In diesem Fall ließen sich keine morphologischen Charakteristika nachweisen und auch die Annexin-V Anfärbung fiel negativ aus. Die weiteren Untersuchungen zeigten jedoch auch die Aktivierung der Autophagozytose durch Expression von LC3-II und p62 im Western Blot. Eine Hemmung lysosomaler Enzyme durch die Protease-Inhibitoren E64d und Pepstatin A führte zu erhöhten LC3-II-Konzentrationen sowie einer p62-Akkumulation. Im Gegensatz zu den Sigma-Rezeptor-Liganden deutet dies eher auf eine vollständige Verlaufsform hin. Da die Autophagozytose bereits nach 6 h-Behandlung mit FM 165 detektiert wurde, ist es nicht ausgeschlossen, dass es sich zunächst um eine zellschützende Funktion handeln könnte. Auch beim FM 165 scheinen oxidative Vorgänge eine wichtige Rolle hinsichtlich der Autophagozytose-Aktivierung zu übernehmen. Nach erfolgter Photoaktivierung der Zellen ließen sich ansteigende ROS Konzentrationen verzeichnen, die nach 2 h deutlich wurden und somit noch vor der Autophagozytose entstehen.