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Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Etablierung von Methoden zur absoluten und relativen Proteinquantifizierung. In darauf aufbauenden Studien sollten diese Methoden für die Untersuchung physiologisch relevanter Fragestellungen in Bakterien genutzt werden. Zum tieferen Verständnis der Bakterienphysiologie ist es unabdingbar, Mengenänderungen von Proteinen hochaufgelöst darstellen zu können. Relative Proteinquantifizierung erlaubt dabei die Untersuchung von Änderungen der Menge eines Proteins zwischen verschiedenen Proben eines Experiments. Im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit wurden 2D PAGE und gelfreie massenspektrometrische Methoden in einer Studie (Tefon et al. 2011, Artikel I) angewendet, um Oberflächen- und Immunoproteine zweier Vakzinationsstämme des humanpathogenen Bakteriums Bordetella pertussis zu charakterisieren. Die relative Proteinquantifizierung erlaubt zwar Rückschlüsse auf die Mengenänderung eines Proteins zwischen verschiedenen Bedingungen, ermöglicht aber nur bedingt Aussagen über die absolute Menge der Proteine. Gerade absolute Proteinmengen und damit Proteinkonzentrationen sind jedoch Grundvoraussetzung für ein zielorientiertes Verwenden der gewonnenen Daten nicht nur im Kontext der Systembiologie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, in der durch Kombination zweier etablierter Proteomik-Methoden die absolute Quantifizierung für einen großen Teil der cytosolischen Proteine eines Organismus ermöglicht wird. In dieser Methode werden ausgewählte Proteine, deren genaue Konzentration durch gerichtete Massenspektrometrie bestimmt wurde, für die Kalibration von hoch auflösenden 2D Gelen genutzt (Maass et al. 2011, Artikel II). Um das Potential dieses Verfahrens zu verdeutlichen, wurde es für die Analyse der Anpassung von Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus an Glukosehunger angewendet. Dabei konnten für 467 Proteine von B. subtilis in drei Zeitpunkten Proteinkonzentrationen bestimmt werden. Für die Etablierung der Methoden waren verschiedene Vorarbeiten nötig: I) Selektion geeigneter Kalibrationsproteine, II) Selektion geeigneter Standardpeptide und Optimierung der massenspektrometrischen Parameter zu deren absoluten Quantifizierung, III) Selektion eines geeigneten, proteinunspezifischen und hoch sensitiven Gelfarbstoffes, IV) Testung verschiedener Zellaufschlussmethoden und Etablierung einer Methode zur Bestimmung der Zellaufschlusseffizienz, V) Testung verschiedener Proteinbestimmungsmethoden zur genauen Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration im komplexen cytosolischen Extrakt und VI) Optimierung der vollständigen enzymatischen Spaltung aller Proteine vor der massenspektrometrischen Analyse. Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass sich die Kalibration der 2D Gele für die Ermittlung absoluter Daten zwischen Gelen übertragen lässt, was den Aufwand für große Zeitreihenexperimente deutlich reduziert. Die Genauigkeit und der dynamische Bereich 2D-gelbasierter relativer und absoluter Proteinquantifizierung kann durch eine erhöhte Reproduzierbarkeit, Auflösung und Sensitivität der Gele verbessert werden. Die Etablierung von HPE-Gelen führte zu 25 % mehr detektierbaren und damit quantifizierbaren Proteinspots und Proteinen bei deutlich erhöhter Reproduzierbarkeit (Moche et al. 2013, Artikel III). Die zusätzlich höhere Anzahl von Gelen mit quantifizierbarer Qualität verringert außerdem den Zeit- und Kostenaufwand vor allem für komplexe experimentelle Ansätze. Die neue Methode zur gelbasierten absoluten Proteinquantifizierung wurde in einer Folgestudie angewendet, um die Konzentrationen von mehr als 700 Proteinen von B. subtilis während der physiologisch relevanten Anpassung an verschiedene Stressbedingungen, nämlich Glukosehunger und Hitzestress, zu bestimmen (Maaß et al. 2014, Artikel IV). Der Vergleich der beiden Stressbedingungen ermöglicht eine Unterscheidung der generellen von der spezifischen Stressantwort, wobei die Analyse der Daten durch Berechnung der Proteinkosten und der Ressourcenverteilung auf verschiedene metabolische Pfade und regulatorische Einheiten unterstützt wurde. Da die Nutzung von 2D PAGE zur Proteinquantifizierung auf im Gel detektierbare Proteine beschränkt ist, ist es für eine höhere Proteomabdeckung sinnvoll, gelbasierte Methoden mit gelfreien Methoden zu ergänzen. Deshalb wurde eine Methode zur labelfreien MS-basierten absoluten Quantifizierung von Proteinen im großen Maßstab entwickelt und etabliert. In dieser gel- und labelfreien Quantifizierungstechnik wurde datenunabhängige, parallele Fragmentierung aller zeitgleich eluierenden Vorläufermoleküle (LC-MSE) genutzt. Auch für diese Methode der absoluten Proteinquantifizierung bildeten die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Probenaufbereitungsverfahren die Grundlage (Muntel et al. 2014, Artikel V).
Am Institut für Community Medicine wurde ein vielschichtiges zentrales Datenmanagement für epidemiologische Probandenstudien (z.B. „Individualisierte Medizin“ und SHIP) und für Studien in der Patientenversorgung (z.B. GANI_MED) konzipiert und implementiert. Die Komplexität des Datenmanagements resultiert aus Umfang und Heterogenität der akquirierten Daten sowie aus multizentrischen und longitudinalen Studienansätzen. Hinzu kommen umfassende Anforderungen an den Schutz personenbezogener Daten, die modulare Einwilligung der Studienteilnehmer sowie die Sicherstellung einer adäquaten Datenqualität, Verfügbarkeit, Nachhaltigkeit etc. Im Rahmen der Probandenstudien wurde eine hochverfügbare webbasierte EDC-Software (Electronic Data Capture) entwickelt, die mit Hilfe intuitiver eCRFs (electronic Case Report Forms) die datenschutzkonforme und qualitätsgesicherte Datenakquise ermöglicht. Eine Data Dictionary-getriebene eCRF-Generierung erlaubt die effiziente Erzeugung neuer und Wartung bestehender Formulare. Ergänzt wird die EDC-Software durch HL7- und DICOM-Empfängersysteme zur nahtlosen Integration des Datenmanagements in vorhandene klinische Informationssysteme. Im Rahmen von „Individualisierte Medizin“ und SHIP wurden von Juni 2008 bis August 2012 insgesamt 6.753 Probanden untersucht und ca. 1,8 Mio. Datensätze revisionssicher persistiert. Zukünftig könnte das Datenmanagement dazu in der Lage sein, weitere Forschungsdaten aus bereits akquirierten Daten zu generieren, z.B. Organvolumina aus MRT-Bilddaten, und sie automatisiert mit weiteren Merkmalen zu korrelieren. Die Limitationen der webbasierten EDC-Software liegen in der Datenakquise ohne vorhandenen (stabilen) Internet-/Netzwerkzugang. Diese Bedingungen sind jedoch in Studien im Kontext der Patientenversorgung vorzufinden. Um die Datenakquise dennoch zu ermöglichen, wurde eine Java-basierte EDC-Software zur asynchronen dezentralen Datenerfassung und nachgelagerten zentralen Datensynchronisation / integration entwickelt. Die Software ist für den unterbrechungsfreien und flexiblen Einsatz im klinischen Umfeld optimiert. Jedoch geht die Asynchronität einher mit einer ungleich höheren technischen Komplexität und einer erhöhten Fehleranfälligkeit, z.B. aufgrund der Notwendigkeit Client-seitiger Software-Aktualisierungen. In GANI_MED wurden von Mai 2011 bis August 2013 insgesamt 3.141 Patienten untersucht und ca. 140.000 Datensätze revisionssicher in den zentralen Datenbestand integriert. Optimierungspotential bietet der Einsatz neuer HTML5-Features, um zugleich synchrone als auch asynchrone Datenerfassungen zu ermöglichen und von den Vorteilen webbasierter Software zu profitieren.
Durch die vorliegende Arbeit wurde die Relevanz moderner Ansätze in der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung für den Erfolg und die Sicherheit in der Arzneistoffentwicklung aufgezeigt. Neben den theoretischen Grundlagen konnte die praktische Anwendung molekularer Vielfalt mit Hilfe komplementärer Substanzbibliotheken vielfach direkt den resultierenden Nutzen aufzeigen. Dabei galt das Interesse speziell antiproliferativen Zielstrukturen, mit besonderem Schwerpunkt auf der Hemmung der Glutathionperoxidase. Des Weiteren unterstützten in silico-Methoden eine zielgerichtete Arbeitsweise. Durch die Optimierung des GPx 1-Testsystems konnte eine zuverlässige in vitro-Analytik etabliert werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass mit Hilfe der angestellten Untersuchungen die erfolgreiche Entwicklung, Optimierung und Evaluierung mehrerer Leitstrukturen für diverse Zielproteine der Tumortherapie aufgezeigt werden konnte. Es wurden zunächst die Fortschritte auf dem Gebiet der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung über multifunktionale Screeningbibliotheken zusammengefasst und bewertet (Publikation 1). Die vorgestellten Ansätze, wie Halogenbindungen und sp3-Reichtum, fanden in den folgenden Publikationen zu einem Großteil praktische Anwendung. Die Synthese einer umfangreichen Acylhydrazonbibliothek führte zum Ausbau der inhibitorischen Aktiviät gegenüber der bovinen GPx 1 (Publikation 2). Der kombinatorische Syntheseansatz erbrachte eine Vielzahl eng verwandter Analoga, die entgegen der Erwartungen leider kaum Erkenntnisse über SAR erbrachten. Zudem erwiesen sich die angewandten Docking-Studien als irreführend, da keinerlei Korrelation zu den in vitro-Ergebnissen erkennbar war. Dennoch konnte mit den angestellten Untersuchungen ein stabiler Enzymassay etabliert werden, der eine zuverlässige Analyse zukünftiger Produkte unterstützt. Langfristig wäre für Aussagen über quantitative SAR die gezielte Optimierung anhand einer Kristallstrukturanalyse erforderlich. Alternativ wurden bereits erste NMR-Versuche mit Sättigungstransfer-Differenz (STD)-Spektroskopie angestellt, die sich jedoch aufgrund der schlechten Löslichkeit der Acylhydrazone als schwierig erwiesen. Weiterhin wurde Misonidazol als Inhibitor der GPx 1 einer Neubewertung unterzogen (Publikation 3). Während racemisches Misonidazol nach früheren Berichten die Aktivität muriner GPx 1 bei 500 µM signifikant reduzierte, zeigte die in vitro-Testung der reinen Enantiomere gleicher Konzentration an boviner GPx 1 keine inhibitorische Wirkung. Von wissenschaftlichem Nutzen war zudem die Erkenntnis über einen schwachen, aber nachweisbar signifikanten Synergismuseffekt des Racemats verglichen mit den isolierten Enantiomeren. Die ergänzende Beschreibung dieser noch wenig untersuchten Wirkungspotenzierung liefert einen Beitrag zum gesamtheitlichen Verständnis dieses Phänomens. Alle synthetisierten Endstufen sowie ausgewählte Zwischenstufen wurden in einer öffentlich zugänglichen Screeningplattform, dem FMP in Berlin, hinterlegt (Publikation 4). Sie haben als Gemeinsamkeit eine ausgeprägte Reaktionsbereitschaft, wodurch in zukünftigen biologischen Screenings eine gezielte oder auch zufällige Entdeckung neuartiger Interaktionen nicht abwegig ist. Die nukleophilen Verbindungen 1, 2, 4 und 5 könnten mit basischen Aminosäuren, wie dem Histidin der Serinproteasen, oder mit Metalloenzymen wechselwirken, während durch die gezielte Elektrophilie von 3 kovalente reversible Bindungen mit Cysteinresten und deren Selen-Analoga zu erwarten sind. Der Beitrag fragmentbasierter Substanzbibliotheken zur Leitstrukturentwicklung konnte am Beispiel der 4-Amidocyclopentan-1,3-diole gezeigt werden (Publikation 5). Ausgehend von acht trisubstituierten Cyclopentan-Templaten konnte die Synthese von achtzig Produkten mit zum Teil potenter Wirkung gegen mehrere Tumor-Zelllinien beschrieben werden. Die Substanzbibliothek dieser Studie demonstriert den Einsatz moderner Methoden zur Bereitstellung von Werkzeug für offene Fragen der Molekularbiologie aus einem bisher zu wenig bearbeiteten Bereich des chemischen Strukturraums. Mit Hilfe von in silico-Untersuchungen gelang eine gezielte Synthese neuartiger Inhibitoren NAD+-abhängiger Histondeacetylasen (Publikation 6). Die resultierende Klasse N1-substituierter Benzimidazolthione zeichnete sich durch erhöhte physiologische Stabilität gegenüber der Leitstruktur Splitomicin aus. Obgleich eine vollständig selektive Inhibition zwischen den Sirtuinen 1–3 nicht erreicht wurde, gelang durch die Anwendung computergestützter Methoden die Synthese eines potenten Inhibitors mit selektiver Wirkung gegen Sirtuin 1 und 2, dessen Grundgerüst als Leitstruktur weiterer Untersuchungen dienen kann.
In dieser Arbeit wurden die Nasennebenhöhlen der Feuchtnasenprimaten (Strepsirrhini) anhand von Mikro-CT-Aufnahmen untersucht. Das Material umfasste 24 größtenteils adulte Schädel, die in zwei Infraordnungen vorlagen und deren Geschlecht nicht bekannt war. Die Ergebnisse sollen neue Erkenntnisse hinsichtlich der Morphologie der Sinus paranasales der Strepsirrhini sowie der quantitativen Zusammenhänge zwischen der Größe der Nasennebenhöhlen und ausgewählten Schädelmaßen liefern. Alle Strepsirrhini weisen einen paarig angelegten Sinus maxillaris auf. Die Kieferhöhlen sind meist durch Recessus frontales vergrößert und können auch durch Recessus palatinales et zygomatici erweitert sein. Obgleich bei allen Schädeln eine Öffnung des Sinus maxillaris zum mittleren Nasengang besteht, lassen sich bei einigen Strepsirrhini auch Verbindungen zum unteren und oberen Nasengang feststellen. Zum Teil existiert eine enge räumliche Beziehung zwischen den Nasennebenhöhlen, sodass diese ineinander übergehen. Sinus frontalis und Sinus sphenoidalis hingegen sind nur bei einigen Schädeln der Infraordnung Lemuriformes nachweisbar. Die Größe und Ausdehnung der Stirnhöhle sind relativ variabel. Durch Septenbildung findet mitunter eine Aufteilung in mehrere Räume statt. Die rechte und linke Keilbeinhöhle sind meist nur durch ein medianes Septum voneinander getrennt. Beidseitig des Septums sind häufig Siebbeinmuscheln erkennbar. Zur besseren Einordnung der ermittelten Volumina wurde aus dem Gesichtsschädelvolumen und dem Gesamtvolumen jeder Nasennebenhöhle sowie dem Gesamtvolumen aller Nasennebenhöhlen ein Index berechnet. Aus den höheren Werten bei den Familien Indridae, Lemuridae und Daubentoniidae ergibt sich tendenziell ein größeres Volumen der Nasennebenhöhlen in Bezug zum Gesichtsschädelvolumen. Die Korrelationsanalyse zeigt, dass der Sinus maxillaris im Gegensatz zur Stirn- und Keilbeinhöhle die meisten signifikanten Korrelationen, insbesondere mit allen äußeren Schädelmaßen, aufweist. Der statistische Vergleich der Volumina des Sinus maxillaris der Strepsirrhini mit den Daten der Catarrhini und Platyrrhini aus der Literatur ergibt, dass bei Catarrhini und Strepsirrhini hinsichtlich der Schädelgröße ein ähnlicher Zusammenhang besteht. Jedoch stellen sich bei den Platyrrhini signifikante Abweichungen im Vergleich mit den anderen beiden Gruppen heraus, wodurch den Platyrrhini vermutlich eine Sonderstellung zukommt, die auch neue Interpretationen hinsichtlich der Evolution dieser Gruppe zulässt.
This study validates a newly-developed scale of consumer culture at individual-level in purchase-consumption context. Following unipolar approach in measurement, the applicable-reliable scale for consumer culture analyzes plausible effects of the seven cultural dimensions on three selected consumer-behaviors; anticipated regret, and two further purchase behaviors of variety-seeking and Quality-consciousness, comparing both Hedonic and Utilitarian aspect of consumer decisions. The interaction among the three behavioral variables are also studied. Feeling the necessity of cultural investigations in rather-unknown countries, Iran and Germany are focused.Iran is among the culturally undiscovered markets with an ever increasing demand; also German consumers have several unknown aspects in their purchase behaviors. Finally, the role of contextual elements — nationality, demographic profile and task— in consumer purchase behaviors are separately analyzed.
In der modernen Augenheilkunde werden Injektionen und Implantate in periokulare Regionen oder direkt in den Glaskörper injiziert. Bei der Entwicklung neuer ophthalmologischer Implantate und Injektionen ist die In vitro-Testung der Wirkstofffreigabe und -verteilung von großer Bedeutung. Dabei stellen viele Testmethoden die In vivo-Situation nicht ausreichend dar. Einerseits bilden die Gewebe des Auges wie beispielsweise die Konjunktiva oder die Sklera Barrieren für den Transport des Arzneistoffes zum Wirkort. Andererseits ist der Einfluss der Gefäßsysteme von Konjunktiva und Choroidea auf die Verteilung und Elimination des Arzneistoffes zu berücksichtigen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Gewebe des Auges hinsichtlich ihrer Permeabilitätseigenschaften untersucht. Als Ergebnis wurden die Permeabilitätskoeffizienten von Ciprofloxacin, Lidocain, Timolol und Dexamethason für die Sklera, Konjunktiva, Kornea, den Retina-Choroidea-Komplex sowie für Kombinationen der aufgezählten Gewebe des Schweineauges erhalten. Als weitere Tiermodelle finden Gewebe von Rinder- und vor allem Kaninchenaugen in der ophthalmologischen Forschung Anwendung. Aus diesem Grund wurden die Permeabilitätsstudien um die Membranen dieser zwei Spezies erweitert. Der Interspezies-Vergleich zeigte sehr große Unterschiede in den Permeabilitäten der Wirkstoffe durch die Gewebe auf, sodass die direkte Übertragbarkeit von Ergebnissen zwischen den Tieren und auf den Menschen nicht gewährleistet ist. Um die Barriere-Eigenschaften der Augengewebe in ein In vitro-Modell zu integrieren wurden synthetische Membranen, die mit den Permeabilitätseigenschaften der Gewebe des Schweineauges übereinstimmen, identifiziert. Diese Membranen wurden zur Simulation der natürlichen Gewebe des Auges in den Mittelteil der neu entwickelten Zwei-Kanal-Durchflusszelle eingespannt. Die Zwei-Kanal-Durchflusszelle besteht aus drei Teilen, wobei die zwei äußeren Akzeptor-Kompartimente je einen Flusskanal, der mit Ringer-Puffer perfundiert wird, enthalten. Durch Etablierung physiologischer Flussraten entlang der korrespondierenden Membranen wurde der konjunktivale und choroidale Blutfluss und somit die Permeabilitäten der Gewebe als auch der Einfluss der Blutgefäße zusammen in einem In vitro-Modell berücksichtigt. Um den Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit in den Flusskanälen und des osmotischen Verhältnis zwischen Probe und Perfusionsmedium auf die Wirkstoffverteilung im System zu untersuchen, wurde eines der zwei Akzeptor-Kompartimente durch eine für Puffer und Wirkstoff undurchlässige Scheibe dicht verschlossen, sodass der Stofftransport nur in eine Richtung sattfinden konnte. Die Ergebnisse zeigten einen bedeutenden Einfluss dieser beiden Parameter auf die Wirkstoffverteilung. Bei Zuschaltung des zweiten perfundierten Akzeptor-Kompartiments der Zwei-Kanal-Durchflusszelle treten zwischen den Kompartimenten vermutlich Kräfte wie zum Beispiel Querströmungen und hydrostatische Druckgefälle auf. Basierend auf den erhaltenen Verteilungskurven der Wirkstoffe in der Zwei-Kanal-Durchflusszelle kann reine konzentrationsgesteuerte Diffusion durch die Membranen als alleiniger Transportmechanismus ausgeschlossen werden. Die beschriebenen Effekte müssen vor der Etablierung der Zwei-Kanal-Durchflusszelle als biorelevante In vitro-Methode für die Charakterisierung von periokularen Injektionen und Implantaten in weiteren Arbeiten durch Änderungen des Modelldesigns behoben werden. Neben den peripheren Geweben des Auges dient der Glaskörper als Applikationsort für Injektionen makromolekularer Arzneistoffe und Implantate, die den inkorporierten Arzneistoff über einen längeren Zeitraum freigeben. Die intravitreale Freisetzung und Verteilung des Wirkstoffes ist für den therapeutischen Effekt von entscheidender Bedeutung. Um diese Prozesse in vitro zu charakterisieren wurde das Glaskörper-Modell entwickelt. Die Form und das Volumen des kugelförmigen Glaskorpus sind an die Geometrie des menschlichen Glaskörpers angepasst. Als Substitut für den natürlichen Glaskörper wurde ein Polyacrylamid-Gel modifiziert, sodass dieses in ausgewählten physiko-chemischen Eigenschaften dem natürlichen Glaskörper entspricht. Nach der Applikation des Wirkstoffes direkt in den Glaskörper muss dieser durch passive oder aktive Transportprozesse an den Wirkort im hinteren Augenabschnitt gelangen. Dabei wird die Wirkstoffverteilung im Glaskörper durch die Augenbewegung maßgeblich beeinflusst. Die Simulation verschiedener Augenbewegungen wurde mit der Entwicklung des Eye Movement Systems in ein In vitro-Modell umgesetzt. Das System ist in der Lage Geschwindigkeiten und Amplituden von langsamen bis schnellen Folgebewegungen, Sakkaden und Mikrosakkaden des Auges nachzuahmen. In die zentrale Halterung des Eye Movement Systems kann das Glaskörper-Modell integriert werden. Die Kombination aus Eye Movement System und Glaskörper-Modell bietet die Möglichkeit den Einfluss der verschiedenen Augenbewegungen auf das Freisetzungs- und Verteilungsverhalten von intravitrealen Injektionen und Implantaten zu untersuchen. Nach erfolgreicher Inbetriebnahme der beiden Systeme wurden Verteilungsstudien mit Modellarzneistoffen verschiedener Molekularmassen durchgeführt. Die Ergebnisse der Studien zeigten, dass das Molekulargewicht im vollständig mit Gel gefüllten Glaskörper-Modell Einfluss auf die Geschwindigkeit der vermuteten Umverteilungsprozesse im Glaskörper-Substitut hat. Mit zunehmendem Anteil der flüssigen Phase im Glaskörper-Modell unterschieden sich die erhaltenen Verteilungen zwischen den Versuchen mit und ohne Bewegung deutlich. Bei der Simulation der hinteren Glaskörperablösung besitzt die Bewegung des Modells einen essentiellen Effekt auf die Konvektions- und Umverteilungsprozesse im Glaskörper-Modell. Durch das Ersetzen prozentualer Anteile des Gels durch Ringer-Puffer konnten Bedingungen der hinteren Glaskörperablösung simuliert werden. Die Simulation des Alterungsprozesses bewirkte eine Zunahme der Konvektion im Glaskörper-Modell. Als Folge resultierte eine deutlich schnellere Umverteilung der injizierten Modellarzneistoffe. Die hintere Glaskörperablösung besitzt demzufolge einen großen Einfluss auf die Verteilung und darf in In vivo- und In vitro-Studien nicht vernachlässigt werden. Mit der Zwei-Kanal-Durchflusszelle und der Kombination aus Eye Movement System und Glaskörper-Modell sind Konzepte für die Charakterisierung von periokularen und intravitrealen Arzneiformen entwickelt worden. In den Modellen wurde besonderer Wert auf die Anlehnung an die In vivo-Situation gelegt. Durch die Berücksichtigung der okularen Blutflüsse, die Simulation der Permeabilitätseigenschaften bestimmter Gewebe des Auges durch entsprechende synthetische Membranen, die Etablierung verschiedener Arten der Augenbewegung und der Simulation des Glaskörpers durch das Polyacrylamid-Gel wurden biorelevante Voraussetzungen geschaffen, die bisher in keinen anderen In vitro- Modellen zu finden sind. Vor der Etablierung der Zwei-Kammer-Durchflusszelle sind weitere Maßnahmen zur Unterbindung der physikalischen Störfaktoren nötig. Der theoretische Ansatz der Zwei-Kammer-Durchflusszelle konnte noch nicht in die Praxis umgesetzt werden. Unter Verwendung des Eye Movement Systems und des Glaskörper-Modells wird eine kostengünstige, einfache und schnelle Charakterisierung neuartiger intravitrealer Injektionen und Implantate unter In vitro- Bedingungen möglich. Die methodische Etablierung des Eye Movement Systems ist erfolgt. Durch weitere Modifikationen kann das System in Zukunft noch näher an die In vivo-Situation herangeführt werden.
The soil bacterium Bacillus subtilis is capable of surviving most of the ensuing environmental stress conditions. The dynamic nature of the soil habitat is manifested with varying amounts of nutrients, frequent flooding, drying and variation of other growth parameters like temperature, acidity, aeration etc. In order to survive in these conditions, B. subtilis has evolved to employ very complex adaptational responses. These adaptational responses are often multi-faceted; hence comprehensive understanding of the adaptational responses requires generation and integration of data on multi-omics level. Hence, multi-omics based detailed analysis was performed for the molecules involved in the central carbon metabolism (CCM) and proline biosynthesis pathway. In the current study two major stress conditions were extensively investigated: 1) energy limitation/starvation which is achieved by limiting glucose in the growth medium, 2) osmostress resulting from frequent drying out of soil which is simulated by adding 1.2 M NaCl to the growth medium. In addition to osmostress, the naturally available osmoprotectant glycine betaine (GB) was supplemented to understand the simultaneous influence of osmostress and osmoprotection on cellular physiology. To measure absolute protein abundances by mass spectrometry, a targeted approach (SRM –single reaction monitoring) using stable heavy isotope labeled artificial standard proteins known as QconCATs was optimized and implemented in the current study. The SRM technique in combination with QconCAT provided absolute quantitative data with high dynamic range for the 45 targeted CCM proteins. Transcriptome data was obtained from microarray analysis. The resulting data were integrated with the other omics data sets obtained by metabolome and flux analysis. As part of a joint study conducted by the BaCell-SysMO and BaSysBio consortia which aimed for the genome wide mapping of transcription units and previously unannotated RNAs of B. subtilis by means of tiling array hybridizations, mRNA samples from growth at high and low temperatures (51°C and 16°C) and in the presence of 1.2 M NaCl, shake flask experiments during transition from exponential growth to the stationary phase, and high density batch fermentation. Time course analysis of B. subtilis transitioning from exponential to stationary phase was investigated by high cell density fed-batch fermentation (glucose limitation) and batch fermentation (glucose exhaustion) with glucose as a limiting factor. A multi-omics analysis of the CCM for the batch fermentation was performed and the time course data was integrated and visualized. In conclusion, pathway based multi-omics data were generated, integrated and visualized as a prerequisite for systems biology approaches and for a better understanding of the complex adaptational responses of B. subtilis.
Approaches to the Analysis of Proteomics and Transcriptomics Data based on Statistical Methodology
(2014)
Recent developments in genomics and molecular biology led to the generation of an enormous amount of complex data of different origin. This is demonstrated by a number of published results from microarray experiments in Gene Expression Omnibus. The number was growing in exponential pace over the last decade. The challenge of interpreting these vast amounts of data from different technologies led to the development of new methods in the fields of computational biology and bioinformatics. Researchers often want to represent biological phenomena in the most detailed and comprehensive way. However, due to the technological limitations and other factors like limited resources this is not always possible. On one hand, more detailed and comprehensive research generates data of high complexity that is very often difficult to approach analytically, however, giving bioinformatics a chance to draw more precise and deeper conclusions. On the other hand, for low-complexity tasks the data distribution is known and we can fit a mathematical model. Then, to infer from this mathematical model, researchers can use well-known and standard methodologies. In return for using standard methodologies, the biological questions we are answering might not be unveiling the whole complexity of the biological meaning. Nowadays it is a standard that a biological study involves generation of large amounts of data that needs to be analyzed with a statistical inference. Sometimes data challenge researchers with low complexity task that can be performed with standard and popular methodologies as in Proteomic analysis of mouse oocytes reveals 28 candidate factors of the "reprogrammome". There, we established a protocol for proteomics data that involves preprocessing of the raw data and conducting Gene Ontology overrepresentation analysis utilizing hypergeometric distribution. In cases, where the data complexity is high and there are no published frameworks a researcher could follow, randomization can be an approach to exploit. In two studies by The mouse oocyte proteome escapes maternal aging and CellFateScout - a bioinformatics tool for elucidating small molecule signaling pathways that drive cells in a specific direction we showed how randomization can be performed for distinct complex tasks. In The mouse oocyte proteome escapes maternal aging we constructed a random sample of semantic similarity score between oocyte transcriptome and random transcriptome subset of oocyte proteome size. Therefore, we could calculate whether the proteome is representative of the trancriptome. Further, we established a novel framework for Gene Ontology overrepresentation that involves randomization testing. Every Gene Ontology term is tested whether randomly reassigning all gene labels of belonging to or not belonging to this term will decrease the overall expression level in this term. In CellFateScout - a bioinformatics tool for elucidating small molecule signaling pathways that drive cells in a specific direction we validated CellFateScout against other well-known bioinformatics tools. We stated the question whether our plugin is able to predict small molecule effects better in terms of expression signatures. For this, we constructed a protocol that uses randomization testing. We assess here if the small molecule effect described as a (set of) active signaling pathways, as detected by our plugin or other bioinformatics tools, is significantly closer to known small molecule targets than a random path.
Non-thermal atmospheric pressure plasma has drawn more and more attention to the field of wound healing research during the last two decades. It is characterized by a unique composition, which includes amongst others free radicals, ions and electrons. Furthermore, non-thermal plasma exhibits temperatures that are below those inducing thermal cell damage. Next to its well-established anti-bacterial properties, plasma can have lethal as well as stimulating effects on mammalian cells. Therefore, the medical application of non-thermal plasma on chronic wounds seems to be a promising tool to enable healing processes. However, less is known about the plasma-mediated induction of intracellular signaling pathways in human immune cells, which play a leading part in the process of wound recovery and removal of pathogens. Therefore, this thesis examined the cellular effects of a non-thermal atmospheric pressure plasma treatment on human immune cells using the argon plasma jet kinpen 09. Here, the CD4+ T helper cell line Jurkat, the monocyte cell line THP-1 as well as the corresponding primary cells were investigated. First, cell survival and apoptosis induction was assessed in response to non-thermal plasma treatment by growth curves and flow cytometric assays. On the one hand it could be shown that primary cells are more susceptible to plasma treatment than the respective cell lines. On the other hand, monocytes responded less sensitive to plasma exposure than lymphocytes. Furthermore, this thesis outlined the impact of non-thermal plasma treatment on the gene expression level of immune cells. Therefore, DNA microarray analysis was performed with the cell lines Jurkat and THP-1. It became obvious that plasma exposure modulated the expression of several genes in both cell types. Differential expression of distinct target genes was further validated by quantitative PCR in the immune cell lines. Here, elevated gene expression levels of JUN and FOS in Jurkat cells and increased transcription of JUND in THP-1 cells in response to plasma treatment were made visible. JUN, FOS and JUND are components of the transcription factor AP-1, which is involved amongst others in gene expression of IL-8 and HMOX-1. Consequently, transcriptional induction of the inflammatory cytokine IL-8 as well as the enzymes HMOX-1 and GSR was detected in plasma-treated THP-1 cells. In addition, alterations in the protein activation levels were analyzed in plasma-treated Jurkat, THP-1 cells and primary monocytes. Since some of the identified target genes are known to be associated with the MAPK pathways, the regulation of these cascades was further investigated by western blot analysis. In all investigated cell types the pro-proliferative signaling molecules ERK 1/2 and MEK 1/2 as well as the pro-apoptotic signaling proteins p38 MAPK and JNK 1/2 were activated in a plasma treatment time dependent manner. In contrast to Jurkat and primary monocytes, the anti-apoptotic HSP27 was only induced in THP-1 cells in response to plasma exposure. Moreover, modulation of cytokine production and secretion was examined in the different immune cell types and co-cultured THP-1 and HaCaT keratinocytes by ELISA or flow cytometry. While Jurkat cells showed no plasma-mediated regulation of cytokine expression, THP-1 cells revealed an increased IL-8 secretion after long plasma time duration (360 s). Additionally, the intracellular expression levels of IL-6 and IL-8 were modulated in primary monocytes by plasma exposure. While short plasma treatment caused no alteration of the number of cells expressing IL-8 an up-regulation of the intracellular IL-6 level occurred after 30 s of plasma treatment. Long plasma treatment times resulted in a significant decrease of the intracellular IL-8 and IL-6 production levels. Furthermore, co-cultured THP-1 and HaCaT cells as well as mono-cultured THP-1 and HaCaT cells were examined regarding their cytokine secretion profile. Here, cells treated with plasma (180 s) as well as LPS and plasma (180 s and LPS) were compared with untreated cells. IL-6, IL-8 and GM-CSF secretion was induced by both plasma and plasma combined with LPS treatment in mono-cultivated HaCaT cells and co-cultured cells. Though, the highest cytokine secretion levels were reached in the plasma and LPS exposed co-culture. In contrast, mono-cultivated THP-1 cells only showed an increased secretion of IL-6, IL-8 and TNFa after incubation with plasma together with LPS exposed medium. In conclusion, this study revealed for the first time the non-thermal plasma-modulated expression of numerous genes and cytokines and the activation state of various signaling cascades in human immune cells. Thus, it contributes to gain a better understanding of the immune-modulatory impacts of plasma that might promote the wound healing process.
Die dem Leben zugrundeliegenden Prozesse sind hochkomplex. Sie werden zu einem Großteil durch Proteine umgesetzt. Diese spielen eine tragende Rolle für die morphologische Struktur und Vielfalt sowie Spezifität der Fähigkeiten der verschiedenen Zelltypen. Jedoch wirken Proteine nicht isoliert für sich allein sondern indem sie miteinander oder mit anderen Molekülen in der Zelle (DNA, Metabolite, Signalstoffe etc.) wechselwirken. Gerät dieses Geflecht von aufeinander abgestimmten Wechselwirkungen aus dem Gleichgewicht, kann das eine Ursache für Erkrankungen sein. Die Kenntnis über fehlregulierte Interaktionen kann dabei helfen, die betreffende Krankheit besser zu verstehen und gegen sie zu intervenieren. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Identifizierung von solch differentiell regulierten Interaktionen. Im Rahmen der Arbeit wurde eine Methode mit dem Namen ExprEssence entwickelt, welche diejenigen Interaktionen in einem Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk identifiziert, die sich zwischen zwei verglichenen Zuständen (z.B. krank versus gesund) am stärksten unterscheiden. Ziel ist es, das Netzwerk auf die wesentlichen Unterschiede zwischen den zwei untersuchten Zuständen zu reduzieren. Hierzu werden Genexpressions- oder Proteomdaten der beiden Zustände in das bereits bestehende Netzwerk integriert. Aus diesen Daten wird die Stärke/Häufigkeit des Auftretens der einzelnen Interaktionen des Netzwerks geschätzt. Die Interaktionen, deren Interaktionsstärken sich zwischen den betrachteten Zuständen am stärksten unterscheiden, werden beibehalten – die restlichen Interaktionen werden verworfen. Dies ergibt ein verkleinertes Subnetzwerk, das aus jenen Interaktionen besteht, die am stärksten differentiell reguliert sind. Diese Interaktionen und ihre Proteine sind Kandidaten für eine Erklärung der biologischen Unterschiede der betrachteten Zustände auf molekularem Niveau. Die Methode wurde auf verschiedene biologische Fragestellungen angewandt und mit anderen ähnlichen Methoden verglichen. Bei der Untersuchung der Unterschiede zwischen Erfolg und Misserfolg einer chemotherapeutischen Brustkrebstherapie konnte beispielsweise gezeigt werden, dass das mit ExprEssence erstellte Subnetzwerk einen stärkeren Bezug zu den bereits bekannten Therapieerfolg-relevanten Mechanismen aufweist als die Methoden, mit denen ExprEssence verglichen wurde. Weiterhin wurde im Subnetzwerk eine möglicherweise für den Therapieerfolg relevante Interaktion identifiziert, die in diesem Zusammenhang bisher nicht betrachtet wurde. Deren Bedeutung konnte in der experimentellen Nachverfolgung weiter untermauert werden. Einen weiteren Schwerpunkt der Arbeit bildete die Untersuchung des Interaktoms eines spezialisierten Zelltyps der Niere – des Podozyten. Dieser Zelltyp ist essentiell für die Filtrationskompetenz der Niere. Ein Interaktionsnetzwerk mit spezifisch für den Podozyten relevanten Interaktion gib es bisher nicht. Daher wurde ein Podozyten-spezifisches Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk aus wissenschaftlichen Veröffentlichungen zusammengestellt und öffentlich verfügbar gemacht. Genexpressionsdaten vielfältiger Art, beispielsweise von Podozyten in verschiedenen Entwicklungsstadien oder in Zellkultur, wurden in das Netzwerk integriert und mit ExprEssence analysiert. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Dedifferenzierung von in Kultur gehaltenen Podozyten nicht dem Umkehrweg der zuvor durchlaufenen Differenzierung entspricht. Neben ExprEssence wurde weitere Software entwickelt, die die Anwendbarkeit von ExprEssence erweitert – MovieMaker und ExprEsSector. Mit MovieMaker werden die Übergänge zwischen den betrachteten Zuständen nachvollziehbarer visualisiert. ExprEsSector bildet die Vereinigungs- und Schnittmengen-Netzwerke von ExprEssence-Subnetzwerken. So können beispielsweise verschiedenen Krankheiten gemeinsame Veränderungen vom Normalzustand identifiziert werden. Ist für eine Krankheit bereits ein Therapieansatz vorhanden, der auf eine fehlregulierte Interaktion einwirkt, und ist diese Interaktion auch in der anderen Krankheit gleichartig differentiell reguliert, kann geprüft werden, ob diese Therapie auf die zweite Krankheit übertragen werden kann. Neben der Vorstellung und Diskussion der erzielten Ergebnisse, wird auch auf methodisch bedingte Nachteile eingegangen. Es werden Strategien aufgezeigt, wie die negativen Einflüsse möglichst minimiert werden können oder wie sie bei der Bewertung der Ergebnisse zu berücksichtigen sind. In Anbetracht der immer schneller ansteigenden Menge biologischer Daten ist es eine wesentliche Herausforderung geworden, aus diesen die essentiellen Informationen zu extrahieren. Der integrative Ansatz der Verknüpfung von Informationen verschiedener Quellen wurde mit ExprEssence und den Erweiterungen MovieMaker und ExprEsSector in einem Konzept zur Identifizierung zustandsrelevanter molekularer Mechanismen in intuitiv leicht erfassbarer Form umgesetzt.