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Beim Endometriumkarzinom (EC) bieten sich gemÀà aktueller Leitlinie (AWMF) wenige Möglichkeiten einer Chemotherapie. Tumormarker und targeted therapy rĂŒcken daher in den Fokus. In diesem Zuge erlangen molekulare Signalkaskaden und deren Modulatoren einen wachsenden Stellenwert. Die PI3-Kinase/AKT-Signalkaskade mit ihrem Regulator MikroRNA 21 (miR-21) ist in vielen TumorentitĂ€ten von Mutationen betroffen und bietet dabei verschiedene Angriffspunkte. Ziel dieser Arbeit war es, die Signalkaskade im EC darzustellen und die regulatorische Rolle von miR-21 nĂ€her zu charakterisieren.
Um eine möglichst umfassende Aussage bezĂŒglich der TumorentitĂ€t EC zu treffen, wurde je eine Zelllinie vom prognostisch gĂŒnstigen Typ I und ungĂŒnstigen Typ II nach der Klassifikation von Bokhman (1983) ausgewĂ€hlt. Die Zelllinien wurden hinsichtlich der Morphologie und ihrer molekularen Eigenschaften charakterisiert. Mittels Transfektion von pmiR-21 wurde in den EC-Zellen miR 21 ĂŒberexprimiert und die Proteinexpressionen der PI3K/AKT-Signalkaskade nach 6 96 h mittels Gelelektrophorese und anschlieĂendem Western Blot analysiert. In der Zelllinie MFE 296 kam es zu den erwartenden VerĂ€nderungen der Signalkaskade. Die Expression der Phosphatase PTEN wurde inhibiert und der Zellzyklus enthemmt. Die Zelllinie MFE 280 zeigte keine VerĂ€nderungen nach Transfektion. Ursachen sind vermutlich die unterschiedliche PTEN-AktivitĂ€t aufgrund von Mutationen und andere Regulationsmechanismen. miR-21 greift neben der direkten Inhibition von PTEN posttranskriptionell indirekt in die StabilitĂ€t des Proteins ein. p85α, die regulatorische Untereinheit der PI3K, ist ein weiteres Target von miR-21. Neben der Interaktion mit den katalytischen Untereinheiten kann p85α Dimere mit PTEN bilden und dessen Ubiquitinierung reduzieren. Die Wirkmechanismen von miR-21 sind vielfĂ€ltig und die genauen ZusammenhĂ€nge bisher nicht komplett verstanden.
Diese Arbeit stellt die unterschiedliche Gewichtung von miR-21-Modulationen auf die PI3K/AKT-Signalkaskade in den beiden EC-Typen dar. miR-21 kann im EC-Typ-I als Marker fungieren. AuĂerdem wurden einige Möglichkeiten der targeted therapy in der PI3K/AKT-Signalkaskade angedeutet. Um diese Aussage und die therapeutischen Konsequenzen in den klinischen Alltag zu integrieren, bedarf es weiterfĂŒhrender Arbeiten.
Das aus antarktischem Meereis stammende und auch bei geringen Temperaturen schnell wachsende Îł Proteobakterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 (PhTAC125) ist ein Modellorganismus fĂŒr kĂ€lteangepasste Bakterien und Enzyme. ZusĂ€tzlich ist es ein alternativer Expressionswirt fĂŒr die lösliche Ăberproduktion von heterologen Proteinen, die in etablierten Expressionswirten zur Bildung von inclusion bodies neigen. Bisher sind bei PhTAC125 im Rahmen der Erforschung von KĂ€lteanpassungsmechanismen bzw. der Optimierung des kĂ€lteangepassten Expressionssystems nur Teilaspekte der Physiologie, des Stoffwechsels und der Bioprozessoptimierung untersucht worden. Bis zum Beginn dieser Dissertation gab es kaum Experimente, die sich mit der dynamischen und nahezu ganzheitlichen Betrachtung der VerĂ€nderung zellulĂ€rer ZustĂ€nde und des Stoffwechsels von PhTAC125 beschĂ€ftigt haben. DarĂŒber hinaus sind trotz der Fortschritte bei der Etablierung von PhTAC125 als alternativer Expressionswirt die bisher erzielten Biomassekonzentrationen gering. Aus diesem Grund wurden in dieser Dissertation zur Untersuchung des Stoffwechsels die exponentielle Wachstumsphase sowie vergleichende Untersuchungen verschiedener Wachstumsphasen und zellulĂ€rer Kompartimente auf Basis der Proteomanalytik durchgefĂŒhrt. ZusĂ€tzlich konnte mit Hilfe der Fed-Batch-Kultivierungstechnik die Biomassekonzentration im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden deutlich gesteigert werden. Zur Untersuchung der Physiologie und des Stoffwechsels von PhTAC125 wĂ€hrend des exponentiellen Wachstums wurde das Proteom analysiert. Neben den typischen stark exprimierten Kategorien der exponentiellen Wachstumsphase wie Protein- u. Nukleotidbiosynthese, AminosĂ€ure- u. Kohlenstoffmetabolismus, stellten sich vor allem die Proteine des TonB abhĂ€ngigen Transportsystems (TBDT), sowie der Kategorien Entgiftung und Coenzyme fĂŒr PhTAC125 als wichtig heraus. Das TBDT ist wegen seiner hohen Abundanz im Proteom und seiner potentiellen Beteiligung am Transport von Proteinabbauprodukten fĂŒr PhTAC125 Ă€hnlich bedeutend wie die anderen Kategorien mit einer hohen Anzahl stark exprimierter Proteine. Auch die Proteine zum Schutz vor ROS (reactive oxygen species) und die der Biosynthesewege der Coenzyme sind besondere und bedeutende Merkmale von PhTAC125. Der ROS Schutz ist bei kĂ€lteangepassten Bakterien wĂ€hrend des Wachstums bei geringen Temperaturen (†20°C) mit erhöhter Sauerstofflöslichkeit und der damit verbundenen verstĂ€rkten ROS-Bildung essentiell. Die VerfĂŒgbarkeit der meisten Biosynthesewege der Coenzyme im Proteom von PhTAC125 ist ein besonderes Charakteristikum gegenĂŒber vielen anderen Wasser- und Bodenmikroorganismen und kennzeichnet einen potentiellen Wachstumsvorteil. Zur vergleichenden Untersuchung der unterschiedlichen zellulĂ€ren Kompartimente von PhTAC125 wurden 2D-Gelbilder des Cyto- und Periplasmas erstellt und gegenĂŒbergestellt. Das periplasmatische Kompartiment war wesentlich durch Signalpeptid-haltige Proteine des TBDT, Porine und periplasmatische Peptidasen und Chaperone charakterisiert. Die Untersuchung der Proteomsignaturen unter NĂ€hrstofflimitationsbedingungen basierte auf dem Vergleich der spĂ€ten exponentiellen und stationĂ€ren Wachstumsphase mit der exponentiellen Wachstumsphase. Beide Wachstumsphasen waren durch Kategorien mit hoher Anzahl an gering exprimierten Proteinen dominiert. Dabei handelte es sich vor allem um die Kategorien der Nukleotid-, Protein- und RNS-Biosynthese. Diese potentiell reprimierten Kategorien der spĂ€ten exponentiellen und stationĂ€ren Wachstumsphase waren in Verbindung mit der Limitation der meisten AminosĂ€uren ein deutlicher Hinweis auf die stringent response. In diesem Zusammenhang schienen die stĂ€rker exprimierten Proteine (TBDT, Porine, Peptidasen/Protease und PilQ) positiv durch die stringent response eguliert zu sein, um das Ăberleben unter NĂ€hrstofflimitationbedingungen zu garantieren. Bei der Bioprozessoptimierung zur Steigerung der Biomassekonzentration von PhTAC125 wurden zwei verschiedene FB-Strategien durchgefĂŒhrt. Bei der ersten Strategie wurde eine komplexe AminosĂ€urequelle (Casamino Acids) als Substrat eingesetzt und ĂŒber konstante oder exponentielle SubstratzufĂŒtterungsprofile eine optische Dichte (OD) von 30 erreicht. Im Vergleich zu den bisherigen in der Literatur beschriebenen Bioprozessen von PhTAC125 wurde die finale Biomassekonzentration 3 fach erhöht. Bei der zweiten FB-Strategie wurde ein âdefinierteresâ Substrat bestehend aus Glycerol und Glutamat fĂŒr die FĂŒtterungslösung eingesetzt. Mit einer anfĂ€nglichen exponentiellen gefolgt von einer konstanten FĂŒtterungsrate konnte die Biomassekonzentration (OD = 86) gegenĂŒber den veröffentlichen Ergebnissen 8 fach gesteigert werden. Zusammenfassend konnten erste proteombasierte Aussagen zur Physiologie und zum Stoffwechsel von PhTAC125 getroffen und erste Bioprozessstrategien zur gezielten Biomassesteigerung entwickelt werden.
Die Wurzeln der meisten Pflanzenarten leben in enger Assoziation mit Mykorrhizapilzen. Insbesondere die arbuskulĂ€re Mykorrhiza (AM) ist weltweit bei mehr als 80 % aller Pflanzen- und Kulturarten von Bedeutung. Es ist eine Symbiose, bei der die Wirtspflanze den Pilz mit organischem Material (Kohlenhydraten) versorgt, wĂ€hrend im Gegenzug die Hyphen des Pilzes feinste Bodenporen erschlieĂen und dadurch den Einzugsbereich der Wurzeln fĂŒr Wasser und NĂ€hrstoffe (z.B. Phosphat, MikronĂ€hrstoffe) vergröĂern. Phosphat und andere NĂ€hrstoffe werden in den Hyphen angereichert und an die Wirtspflanze abgegeben, was zu deren besserer NĂ€hrstoffversorgung beitrĂ€gt. In der vorliegenden Arbeit wurde der von der Firma AMykor in vivo in groĂen Mengen reproduzierte G. intraradices-Stamm molekularbiologisch eingeordnet und mit anderen Isolaten und kommerziellen Produkten verglichen. Zielregion der verwendeten Primer war die ribosomale DNA (rDNA), welche fĂŒr die RNA der Ribosomen kodiert. FĂŒr die Vergleiche wurde der Bereich der hochvariablen ITS-Region (internal transcribed spacer) genutzt. Dieser âin vivoâ G. intraradices-Stamm konnte erfolgreich in eine monoxenische (in vitro) Kultur ĂŒberfĂŒhrt werden. Die vereinzelten und sterilisierten AMykorâG. intraradices Sporen wurden zusammen mit sterilen, mit Hilfe von Agrobacterium rhizogenes transfizierten, Karottenwurzeln (Daucus carrota L. Belgien) auf NĂ€hrmedium kultiviert. AuĂerdem konnten noch drei weitere Wurzelkulturen etabliert werden, Fragaria x Ananassa (Duch.) (Gatersleben), Helianthus annuus L. (Gatersleben) und Daucus carota (Gatersleben). Im nĂ€chsten Schritt konnten eine asymbiotische, eine symbiotische und zwei subtraktive cDNA-Banken aus asymbiotischem und symbiotischem Myzel (Hyphen und Sporen) erstellt werden. Mit Hilfe der subtraktiven cDNA-Banken lassen sich G. intraradices-Gene isolieren, die speziell im asymbiotischen bzw. im symbiotischen Myzel exprimiert werden. Es konnten Expressed Sequence Tags (EST) identifiziert werden, deren putative Genprodukte eine Rolle bei der Transkription und Translation, dem Zellwachstum und der Entwicklung, dem Metabolismus und der Signaltransduktion spielen. Allerdings zeigten diese Homologievergleiche auch, dass ein Drittel der EST keine oder sehr geringe Ăhnlichkeit zu bekannten Genen aufweist und ihre Funktion damit unbekannt bleibt. Sowohl asymbiotisches, prĂ€symbiotisches und symbiotisches Hyphenmaterial (ERM) als auch mit G. intraradices infiziertes Wurzelmaterial dienten als Ausgangsmaterial fĂŒr die Expressionsanalyse der isolierten Gene. Diese Expressionsanalysen zeigten, dass einige dieser putativen Gene nur im symbiotischen Stadium exprimiert werden. Zum Beispiel konnte ein EST mit Homologie zu einer Diacylglycerol-O-acyltransferase von Umbelopsis ramanniana isoliert werden. Mittels RT-PCR konnte eine Expression nur im ERM nicht aber im asymbiotischen, prĂ€symbiotischen und im symbiotischen Stadium (Sporen, Hyphen und IRM) nachgewiesen werden. Dieses Enzym ist wahrscheinlich auch bei G. intraradices am Lipid-Stoffwechsel beteiligt und katalysiert die Bildung von Triacylglycerin aus Diacylglycerin. Auch ein EST, welches Homologie zu einer FettsĂ€uredioxygenase ppoA von Aspergillus aufweist, konnte mit Hilfe von Datenbankvergleichen gefunden werden. Dieses Gen ist in die Biosynthese des, von der LinolsĂ€ure abgeleiteten Oxylipin psiBα involviert und damit in die Entwicklung des anamorphen und telomorphen Stadiums, wobei eine Deletion des ppoA-Genes zu einer Reduktion der asexuellen und sexuellen Sporen fĂŒhrt. Von G. intraradices und allen anderen Glomus Spezies wurde noch kein sexuelles Stadium beschrieben. So könnte die FettsĂ€uredioxygenase hier an der Sporulation beteiligt sein. Da die Expression nur im ERM nachgewiesen werden konnte, wĂ€re dies durchaus denkbar. FĂŒr das putative G. intraradices Fumaratreduktase-Gen (Gint(Fr)) konnte das vollstĂ€ndige ORF isoliert werden. Die Gint(Fr)-cDNA umfasst ein 1533 Bp groĂes offenes Leseraster, das 511 AminosĂ€uren kodiert. Gint(Fr) weist Homologie zu dem OSM1 Gen von Saccharomyces cerevisiae auf und katalysiert die Reduktion von Fumarat zu Succinat. Nur eine EST-Sequenz konnte als vollstĂ€ndiges ORF aus der cDNA-Bank isoliert werden. Die full-length Gint(Cbp)-cDNA umfasst ein 297 Bp groĂes offenes Leseraster, das 99 AminosĂ€uren kodiert. Ein NCBI-Datenbank-Vergleich zeigte, dass es sich um ein Putativ-Cruciform-DNA-binde-Protein mit Ăhnlichkeit zu dem HMP1 Gen von Ustilago maydis handelt. Dieses Protein ist in die strukturelle Aufrechterhaltung der DNA involviert. Einige der hier isolierten Gene wurden als Sonden fĂŒr eine Filterhybridisierung eingesetzt. Hier war es möglich, mykorrhizierte (mit G. intraradices) von nichtmykorrhizierten Pflanzen zu unterscheiden. Nun kann versucht werden, ĂŒber Quantifizierung der in einer Probe enthaltenen Mykorrhizapilz-DNA eine Aussage ĂŒber den Mykorrhizierungsgrad der Wurzel zu treffen und den Test in der QualitĂ€tskontrolle und âsicherung einzusetzen.
Im Laufe der letzten Jahre hat sich herausgestellt, dass Transportproteine einen entscheidenden Beitrag zur Absorption, Verteilung und Elimination zahlreicher Endo- und Xenobiotika leisten. Vor allem die hepatobiliĂ€re Elimination nimmt eine SchlĂŒsselrolle in systemischen Clearance-Prozessen ein. Vor dem Hintergrund, dass immer mehr hochmolekulare und metabolisch stabile Stoffe Eingang in die Arzneistoffentwicklung finden und diese vorwiegend hepatobiliĂ€r eliminiert werden, wurde es erforderlich, differenziertere Kompartimentmodelle zu entwickeln, um singulĂ€re Substanzeffekte auf zellulĂ€rer Ebene zu untersuchen. Gerade Interaktionen zwischen simultan verabreichten Arzneistoffen können zu erheblichen Nebenwirkungen durch VerĂ€nderung pharmakokinetischer Eliminationsprozesse in Kombination mit erhöhter oder eingeschrĂ€nkter BioverfĂŒgbarkeit fĂŒhren. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, fĂŒr die frĂŒhe Arzneistoffentwicklung ein In vitro-Modell auf Basis des pharmakokinetischen Standardtiermodells der Ratte zu konzipieren, welches eine einfache Analyse hepatobiliĂ€rer Elimination auf indirektem Weg ĂŒber die Interaktion mit fluoreszierenden Modellsubstraten ermöglicht. Die Zielvorgabe wurde umgesetzt, indem auf Basis literaturbeschriebener Methoden ein In vitro-Rattenhepatozytenmodell etabliert wurde. HierfĂŒr war es zunĂ€chst unerlĂ€sslich, geeignete Kultivierungsbedingungen zu identifizieren und zu optimieren. Es konnte gezeigt werden, dass primĂ€re Hepatozyten nur befĂ€higt wurden, sich in vitro zu repolarisieren und eine in vivo-Ă€hnliche Morphologie anzunehmen, wenn sie eingebettet zwischen zwei extrazellulĂ€ren Kollagenmatrices kultiviert wurden. Diese sogenannte Sandwichkultivierung der Zellen und die Supplementierung des Zellkulturmediums mit dem Glukokortikoid Dexamethason erwiesen sich hierfĂŒr als wesentliche Faktoren. Die Hepatozyten reformierten sich folglich innerhalb von 96 Stunden unter Ausbildung eines vollstĂ€ndigen und sehr einheitlichen Gallengangssystems, welches nahezu jeden Hepatozyten umschloss. Nach Etablierung der Zellkultur wurden die sandwichkultivierten Hepatozyten hinsichtlich der Proteinexpression, ausgewĂ€hlte Transportproteine und Cytochrome umfassend, ĂŒber einen Kultivierungszeitraum von 10 Tagen charakterisiert, um die ValiditĂ€t des Zellsystems zu gewĂ€hrleisten. Unter Bei-behaltung der optimierten Kultivierungsbedingungen konnte mit zunehmendem Repolarisierungsstatus der Zellen ein Anstieg der apikalen Transportproteinexpression unter Begleitung einer Erhöhung der molekularen Masse der Transportproteine verzeichnet werden. Als Grund fĂŒr die Molekulargewichtszunahme im Laufe des Redifferenzierungsprozesses der Zellen konnte die posttranslationale N-Glykosylierung am Beispiel der Transportproteine P-gp, Mrp2 und Bcrp identifiziert werden. Verifiziert wurden die Proteinexpressionsdaten, die apikalen Effluxtransporter P-gp, Mrp2, Bsep und Bcrp betreffend, ĂŒber die Bestimmung der funktionellen AktivitĂ€t unter Verwendung fluoreszierender Modellsubstrate ĂŒber einen Kultivierungszeitraum von 8 Tagen. Diese funktionelle AktivitĂ€t der Transportproteine wurde durch das Erscheinen fluoreszierender MolekĂŒle in den Lumina der GallenkanĂ€lchen ersichtlich und nahm mit voranschreitender Maturierung des Gallenkanalnetzwerkes sowie mit VerstĂ€rkung der Transportproteinexpression, gekoppelt mit dem Grad der N-Glykosylierung, zu. Die SelektivitĂ€t der einzelnen Modellsubstrate wurde mittels in der Literatur beschriebener Substrate und Inhibitoren untersucht und bestĂ€tigt. Auf Basis der funktionellen Charakterisierung wurde im Anschluss eine indirekte In vitro-Methode entwickelt, welche die Voraussetzung schuf, Interaktionspotentiale von Arzneistoffen mit Effluxtransportproteinen zu evaluieren. Die Inhibition eines apikalen Transportproteins resultierte dabei prinzipiell in AbhĂ€ngigkeit der eingesetzten Substanzkonzentration in einer Reduktion des eliminierten fluoreszierenden Modellsubstratanteils, was mit einer Zunahme der intrazellulĂ€ren Fluoreszenz korrelierte. So konnte aufgezeigt werden, dass bekannte Inhibitoren und Substrate die Transport-proteinaktivitĂ€t konzentrationsabhĂ€ngig reduzierten, ohne dass der sichtbare Effekt auf toxische Effekte der eingesetzten Substanzen zurĂŒckzufĂŒhren war. Dies konnte mittels des ZelltoxizitĂ€tsmarkers Alamar blue nachgewiesen werden. Clonidin, welches nicht als ABC-Transportersubstrat beschrieben worden ist, interagierte erwartungsgemÀà auch mit keinem der Transportprozesse. Der Einsatz eines derartigen In vitro-Systems in der frĂŒhen Arzneistoffentwicklung könnte helfen, geeignete Arzneistoffkandidaten auszuwĂ€hlen, welche ein geringes Potential aufweisen, mit hepatobiliĂ€ren Effluxsystemen zu interagieren, um die Gefahr schwerer Arzneimittelnebenwirkungen zu minimieren.
