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- VA-Mykorrhiza (2) (remove)
Die Wurzeln der meisten Pflanzenarten leben in enger Assoziation mit Mykorrhizapilzen. Insbesondere die arbuskulĂ€re Mykorrhiza (AM) ist weltweit bei mehr als 80 % aller Pflanzen- und Kulturarten von Bedeutung. Es ist eine Symbiose, bei der die Wirtspflanze den Pilz mit organischem Material (Kohlenhydraten) versorgt, wĂ€hrend im Gegenzug die Hyphen des Pilzes feinste Bodenporen erschlieĂen und dadurch den Einzugsbereich der Wurzeln fĂŒr Wasser und NĂ€hrstoffe (z.B. Phosphat, MikronĂ€hrstoffe) vergröĂern. Phosphat und andere NĂ€hrstoffe werden in den Hyphen angereichert und an die Wirtspflanze abgegeben, was zu deren besserer NĂ€hrstoffversorgung beitrĂ€gt. In der vorliegenden Arbeit wurde der von der Firma AMykor in vivo in groĂen Mengen reproduzierte G. intraradices-Stamm molekularbiologisch eingeordnet und mit anderen Isolaten und kommerziellen Produkten verglichen. Zielregion der verwendeten Primer war die ribosomale DNA (rDNA), welche fĂŒr die RNA der Ribosomen kodiert. FĂŒr die Vergleiche wurde der Bereich der hochvariablen ITS-Region (internal transcribed spacer) genutzt. Dieser âin vivoâ G. intraradices-Stamm konnte erfolgreich in eine monoxenische (in vitro) Kultur ĂŒberfĂŒhrt werden. Die vereinzelten und sterilisierten AMykorâG. intraradices Sporen wurden zusammen mit sterilen, mit Hilfe von Agrobacterium rhizogenes transfizierten, Karottenwurzeln (Daucus carrota L. Belgien) auf NĂ€hrmedium kultiviert. AuĂerdem konnten noch drei weitere Wurzelkulturen etabliert werden, Fragaria x Ananassa (Duch.) (Gatersleben), Helianthus annuus L. (Gatersleben) und Daucus carota (Gatersleben). Im nĂ€chsten Schritt konnten eine asymbiotische, eine symbiotische und zwei subtraktive cDNA-Banken aus asymbiotischem und symbiotischem Myzel (Hyphen und Sporen) erstellt werden. Mit Hilfe der subtraktiven cDNA-Banken lassen sich G. intraradices-Gene isolieren, die speziell im asymbiotischen bzw. im symbiotischen Myzel exprimiert werden. Es konnten Expressed Sequence Tags (EST) identifiziert werden, deren putative Genprodukte eine Rolle bei der Transkription und Translation, dem Zellwachstum und der Entwicklung, dem Metabolismus und der Signaltransduktion spielen. Allerdings zeigten diese Homologievergleiche auch, dass ein Drittel der EST keine oder sehr geringe Ăhnlichkeit zu bekannten Genen aufweist und ihre Funktion damit unbekannt bleibt. Sowohl asymbiotisches, prĂ€symbiotisches und symbiotisches Hyphenmaterial (ERM) als auch mit G. intraradices infiziertes Wurzelmaterial dienten als Ausgangsmaterial fĂŒr die Expressionsanalyse der isolierten Gene. Diese Expressionsanalysen zeigten, dass einige dieser putativen Gene nur im symbiotischen Stadium exprimiert werden. Zum Beispiel konnte ein EST mit Homologie zu einer Diacylglycerol-O-acyltransferase von Umbelopsis ramanniana isoliert werden. Mittels RT-PCR konnte eine Expression nur im ERM nicht aber im asymbiotischen, prĂ€symbiotischen und im symbiotischen Stadium (Sporen, Hyphen und IRM) nachgewiesen werden. Dieses Enzym ist wahrscheinlich auch bei G. intraradices am Lipid-Stoffwechsel beteiligt und katalysiert die Bildung von Triacylglycerin aus Diacylglycerin. Auch ein EST, welches Homologie zu einer FettsĂ€uredioxygenase ppoA von Aspergillus aufweist, konnte mit Hilfe von Datenbankvergleichen gefunden werden. Dieses Gen ist in die Biosynthese des, von der LinolsĂ€ure abgeleiteten Oxylipin psiBα involviert und damit in die Entwicklung des anamorphen und telomorphen Stadiums, wobei eine Deletion des ppoA-Genes zu einer Reduktion der asexuellen und sexuellen Sporen fĂŒhrt. Von G. intraradices und allen anderen Glomus Spezies wurde noch kein sexuelles Stadium beschrieben. So könnte die FettsĂ€uredioxygenase hier an der Sporulation beteiligt sein. Da die Expression nur im ERM nachgewiesen werden konnte, wĂ€re dies durchaus denkbar. FĂŒr das putative G. intraradices Fumaratreduktase-Gen (Gint(Fr)) konnte das vollstĂ€ndige ORF isoliert werden. Die Gint(Fr)-cDNA umfasst ein 1533 Bp groĂes offenes Leseraster, das 511 AminosĂ€uren kodiert. Gint(Fr) weist Homologie zu dem OSM1 Gen von Saccharomyces cerevisiae auf und katalysiert die Reduktion von Fumarat zu Succinat. Nur eine EST-Sequenz konnte als vollstĂ€ndiges ORF aus der cDNA-Bank isoliert werden. Die full-length Gint(Cbp)-cDNA umfasst ein 297 Bp groĂes offenes Leseraster, das 99 AminosĂ€uren kodiert. Ein NCBI-Datenbank-Vergleich zeigte, dass es sich um ein Putativ-Cruciform-DNA-binde-Protein mit Ăhnlichkeit zu dem HMP1 Gen von Ustilago maydis handelt. Dieses Protein ist in die strukturelle Aufrechterhaltung der DNA involviert. Einige der hier isolierten Gene wurden als Sonden fĂŒr eine Filterhybridisierung eingesetzt. Hier war es möglich, mykorrhizierte (mit G. intraradices) von nichtmykorrhizierten Pflanzen zu unterscheiden. Nun kann versucht werden, ĂŒber Quantifizierung der in einer Probe enthaltenen Mykorrhizapilz-DNA eine Aussage ĂŒber den Mykorrhizierungsgrad der Wurzel zu treffen und den Test in der QualitĂ€tskontrolle und âsicherung einzusetzen.
Anorganische Stickstoffformen, wie Nitrat oder Nitrit, dienen in Pflanzen als Quelle fĂŒr die enzymatische Bildung des SignalmolekĂŒls Stickstoffmonoxid (NO). In Wurzeln wird NO an der apoplastischen Seite der Plasmamembran (PM) durch die Nitrit:NO-Reduktase (NI-NOR) gebildet, die fĂŒr Nitrit eine hohe AffinitĂ€t aufweist. Die dafĂŒr benötigten Elektronen stammen aus der Oxidation von Succinat, wobei in vitro auch Elektronen aus reduziertem Cytochrom c akzeptiert werden. Zur fluoreszenzmikroskopischen Lokalisierung der NI-NOR (in planta) innerhalb der Tabakwurzeln (Nicotiana tabacum cv. Samsun) wurden DAF-Farbstoffe (Diaminofluoresceine) eingesetzt, die sich jedoch aufgrund zahlreicher NO-unspezifische Reaktionen zum Nachweis der NI-NOR unter den gegebenen experimentellen Bedingungen nicht eigneten. Die Bestimmung und Quantifizierung der NI-NOR-AktivitĂ€t in vitro, an isolierten PM-Vesikeln, solubilisierten PM-Proteinen und partiell gereinigten PM-Proteinen, erfolgte mittels Chemilumineszenzanalyse. Neben NO wurde unter Anwendung der Membran-Inlet-Massenspektrometrie an PM-Vesikeln auĂerdem die Bildung von N2O und NO2 nachgewiesen. In AbhĂ€ngigkeit von der externen NitraternĂ€hrung der Tabakpflanzen bestand ein Zusammenhang zwischen der NI-NOR-AktivitĂ€t und der Kolonisierungsrate der Wurzeln mit dem vesikulĂ€r-arbuskulĂ€ren Mykorrhizapilz Glomus mosseae, wobei geringe NI-NOR-AktivitĂ€ten unter Stickstoffmangelbedingungen mit hohen Kolonisierungsraten und umgekehrt hohe NI-NOR-AktivitĂ€ten bei optimaler NitraternĂ€hrung mit geringen Kolonisierungsraten korrelierten. Die NI-NOR-AktivitĂ€t wurde konzentrationsabhĂ€ngig und reversibel durch die Anwesenheit von Sauerstoff gehemmt und erreichte bei einer Luftsauerstoffkonzentration von 21 % noch etwa 22 % ihrer ursprĂŒnglichen, unter anoxischen Bedingungen gemessenen AktivitĂ€t. Um die IdentitĂ€t dieses Enzyms ĂŒber massenspektrometrische Analysen zu klĂ€ren, wurde die NI-NOR ausgehend von isolierten PM-Vesikeln aus Tabakwurzeln durch Solubilisierung sowie ĂŒber chromatographische und gelelektrophoretische Trennungsmethoden aufgereinigt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie wurden vor allem verschiedene Aquaporine und KanĂ€le sowie einige noch unbekannte Proteine identifiziert, bei denen es sich möglicherweise um die NI-NOR handeln könnte. Eine Oxidoreduktase, als möglicher Kandidat fĂŒr die NI-NOR, wurde jedoch nicht gefunden.