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In den Weltmeeren findet rund die Hälfte der jährlichen globalen Kohlenstofffixierung statt, davon ein großer Anteil in küstennahen Regionen. Hier kommt es zu wiederkehrenden saisonalen Algenblüten, die durch eine zeitlich begrenzte explosionsartige Vermehrung von Mikroalgen (hauptsächlich Diatomeen und Coccolithophoren) charakterisiert sind. Vor allem Frühjahrsblüten (März-Mai) haben aufgrund ihrer zeitlichen und räumlichen Vorhersagbarkeit einen hohen Stellenwert als Modellsysteme, anhand deren sich der Kohlenstoffkreislauf der Meere untersuchen lässt.
Mikroalgen produzieren eine große Vielfalt an Makromolekülen, die für die mit ihnen vergesellschafteten Bakterien als Nahrungsgrundlage dienen. Besonders im Fokus stehen hier die für den Kohlenstoffkreislauf relevanten Polysaccharide. Im Gegensatz zu anderen natürlichen Makromolekülen wie DNA oder Proteinen können Polysaccharide aus vielen verschiedenen Monomeren mit unterschiedlichsten Bindungen bestehen. Zusätzlich finden sich an diesen Zuckermonomeren viele Modifikationen wie Acetylierungen, Methylierungen oder Sulfatierungen, die die Komplexität weiter erhöhen. Diese Variabilität bedingt eine hohe strukturelle und funktionale Diversität. So können Polysaccharide Speicherstoffe, Zellwandbestandteile oder Teile der extrazellulären Matrix darstellen.
Komplementär hierzu besitzen Polysaccharid-verwertende Bakterien entsprechend komplexe, enzymatische Abbaumechanismen. Besonders hervorzuheben sind hier die Bakterien des Phylums Bacteroidota, die sich in verschiedensten Nischen auf den Abbau von Polysacchariden spezialisiert haben. Sie finden sich in Bodenproben, als Teil der menschlichen Darmflora, oder eben auch als bedeutende Begleiter von Algenblüten.
Bacteroidota (und in marinen Systemen hauptsächlich die zu ihnen gehörenden Flavobakterien) besitzen zum Abbau diverser Polysaccharide sogenannte Polysaccharide utilization loci (PULs), genomische Inseln, die alle notwendigen Proteine zur Aufnahme und Abbau eines bestimmten Polysaccharids codieren. Hierzu gehören hochspezifische Enzyme (Carbohydrate-active enzymes, CAZymes), transkriptionelle Regulatoren sowie Transportersysteme, die initial gespaltene Oligosaccharide über die Membran in das Bakterium transportieren, wo sie von weiteren Enzymen vollständig abgebaut werden. Diese Co-Lokalisation der benötigten Gene und deren gemeinsame Regulation stellt einen enormen Selektionsvorteil der Bacteroidota dar und ist der Grund, warum sie, ähnlich wie Algen, einer jährlich wiederkehrenden Sukzession folgen, die sich gut untersuchen lässt.Die Forschungsartikel, die Teil dieser Doktorarbeit sind, untersuchen das Zusammenspiel von Polysaccharid-produzierenden Algen mit den Bakterien, die sie abbauen, aber auch darauf basierende Beziehungen der Bakterien untereinander. Die erste Publikation beschäftigt sich mit dem weit verbreiteten Speicherpolysaccharid α-Glucan, für das der Großteil der blütenbegleitenden Bakterien einen spezifischen aktiven PUL besitzt. Eine Untersuchung der in der Blüte vorhandenen Algenarten bestätigte, dass die Blüte von β-Glucan-produzierenden Algen dominiert wird. Da Bakterien aber selbst α-Glucane als Speicherpolysaccharide verwenden, konnte gezeigt werden, dass nicht die Algen selbst, sondern die Bakterien Hauptproduzent dieser Polysaccharide während einer Phytoplanktonblüte sind. Bakterielle Proteine, die dem Abbau von Algen-β-Glucan und dem daraus folgenden Aufbau von bakteriellem α-Glucan dienen, waren in Umweltproben und in Laborkulturen unter ähnlichen Bedingungen abundant. Die Untersuchung von extrahiertem bakteriellem Polysaccharid bewies, dass dieses nicht nur α-Glucan enthält, sondern dass dieses Polysaccharid auch in der Lage war, α-Glucan PULs mariner Bakterien zu induzieren. Hier zeigte sich ein innerhalb des marinen Kohlenstoffkreislaufs bisher wenig berücksichtigter Kreislauf, indem Bakterien Polysaccharide anderer Bakterien nutzen, die z.B. durch Viren lysiert wurden.
Die anderen zwei Artikel dieser Arbeit befassen sich mit dem Abbau von Zellwandpolysacchariden durch blütenassoziierte Modellbakterien. In einer der Studien wird detailliert der Abbau eines β-Mannans (ein Polysaccharid das hauptsächlich aus dem Monosaccharid Mannose besteht) durch ein Bakterium des Genus Muricauda beschrieben. Die PUL-Struktur dieses Bakteriums kam in mehreren anderen Phytoplanktonblüten-assoziierten Bakterien vor. Diese Beobachtung wies darauf hin, dass es sich hier um ein Mannan mit zusätzlichen Galactose- und Glucose-Substitutionen handelte. Proteom-Untersuchungen bestätigten, dass das Bakterium derartige Substrate unter Induktion des β-Mannan-PULs nutzen können. β-Mannan konnte durch Antikörpermarkierung in Blütenproben sowie spezifischen Mikroalgenarten (Chaetoceros, Coscinodiscus) nachgewiesen werden. Die in dieser Publikation charakterisieren β-Mannan-PUL-codierten Enzyme waren in der Lage, dieses Signal zu löschen, was bewies, dass Muricauda sp. Mannan-basierte Zellwandpolysaccharide bestimmter Arten von Mikroalgen abbauen kann.
Die dritte Studie geht näher auf den Abbau von Xylanen (bestehend aus Xylose) durch ein blütenassoziiertes Bakterium des Genus Flavimarina ein. In diesem Bakterium wurden anhand der enthaltenen Xylanasen zwei putative Xylan-PULs annotiert. Wachstumsexperimente und Proteom-Untersuchungen zeigten, dass einer dieser PULs hauptsächlich bei Wachstum auf Glucoronoxylan induziert wird, während der andere PUL aufArabinoxylane stärker reagierte. Untersuchung der PUL-CAZymes bestätigte diese Ergebnisse durch Charakterisierung mehrerer Xylanasen sowie Glucoronidasen und Arabinofuranosidasen. Zusätzlich codierten beide PULs für Esterasen, die eine Modifikation der natürlichen Substrate durch Acetylierungen oder Methylierungen nahelegen. Da all diese Merkmale von terrestrischen Xylanen geteilt werden und in Blütenproben aus Küstennahen Regionen Xylane nachgewiesen wurden, ist es möglich, dass Bakterien aus solchen Regionen sowohl Xylane terrestrischen Ursprungs (z.B. durch Flusseinspeisung) sowie marinen Ursprungs abbauen können.
Diese Arbeit war Teil eines vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten interdisziplinären Forschungsnetzwerks (#1HealthPREVENT) und stellte eine einmalige peri-operative antibiotische (Penicillin/Gentamicin (P/G)) Prophylaxe (PAP) im Zuge eines operativen Eingriffs nach diagnostizierter Kolik beim Pferd der bislang üblichen fünf-Tage-Antibiose gegenüber, mit dem Ziel den Einfluss der PAP auf die Häufigkeit von (engl.) Extended Spectrum β-Lactamase produzierenden Escherichia coli (ESBL-EC) und die Veränderungen im enteralen Mikrobiom der Pferde zu untersuchen und zur Verbesserung des sorgfältigen Einsatzes von Antibiotika in der Veterinärmedizin beizutragen. Die per Los jeweils einer der zwei Gruppen („single shot“ Gruppe (SSG); „5 days“ Gruppe (5DG)) zugeordneten Pferde wurden dafür jeweils an drei verschiedenen Zeitpunkten (Klinikaufnahme (t0), Tag 3 (t1) und Tag 10 (t2) postoperativ) beprobt (Kotproben und Nüsternabstriche). Zusätzlich zur Gruppe der hospitalisierten Pferde wurde auch eine nicht-hospitalisierte Kontrollgruppe ohne klinische Auffälligkeiten einbezogen. Alle Proben wurden hinsichtlich positiver ESBL-EC untersucht und die identifizierten Isolate phänotypisch (durchgeführt vom Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen, Freie Universität Berlin) und genotypisch charakterisiert. Unabhängig vom P/G PAP-Schema stieg für die Pferde die Wahrscheinlichkeit von t0 zu t1 sowie von t0 zu t2 an, positiv für ESBL-EC zu sein. Die Ganzgenom-Sequenzierung der Isolate ergab außerdem eine enge räumliche und zeitliche Beziehung zwischen Isolaten mit gemeinsamen Sequenztypen, was auf eine lokale Ausbreitung hindeutete. Die 16S rRNA-Gen Sequenzierung der Kotproben (durchgeführt vom Institut für Klinische Molekularbiologie der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel) zur Untersuchung der Veränderungen im enteralen Mikrobiom zeigte nach der bioinformatischen Aufbereitung (durchgeführt von Silver Anthony Wolf, Robert Koch-Institut) und Fach-übergreifenden Analyse eine Beeinträchtigung in der Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota (Alpha-Diversität) für Pferde mit akuter Kolik im Vergleich zur Kontrollgruppe, welche jedoch nicht signifikant war. Die mikrobielle Gesamtkomposition der untersuchten Proben (Beta-Diversität) wies vor allem für die 5DG an t1 erhebliche Einschränkungen auf, was höchstwahrscheinlich auf die fortlaufende Verabreichung von Antibiotika zurückzuführen war. In beiden Studiengruppen wurde zudem an t1 eine erhöhte Abundanz von Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia, festgestellt. Insgesamt wiesen die Ergebnisse dieser Arbeit einen starken Einfluss des Krankenhausaufenthaltes an sich auf, vor allem auf die ESBL-EC-Isolationsraten, wodurch möglicherweise Unterschiede zwischen den verschiedenen PAP-Behandlungen überdeckt wurden. Trotzdem stellen die in dieser Studie gesammelten Ergebnisse und gewonnenen Erkenntnisse einen ersten wichtigen Schritt in der Etablierung von Antibiotic Stewardship-Programmen in Pferdekliniken dar und könnten somit einen langfristigen Einfluss auf die lokale Verbreitung von ESBL-EC haben.
In the search for alternative treatment options for infections with multi-resistant germs,
traditionally used medicinal plants are currently being examined more intensively. In this study,
the antimicrobial and anti-biofilm activities of 14 herbal drugs were investigated. Nine of the tested
drugs were traditionally used in Europe for treatment of local infections. For comparison, another
five drugs monographed in the European Pharmacopoeia were used. Additionally, the total tannin
and flavonoid contents of all tested drugs were analyzed. HPLC fingerprints were recorded to ob-
tain further insights into the components of the extracts. The aim of the study was to identify herbal
drugs that might be useable for treatment of infectious diseases, even with multidrug resistant E.
coli, and to correlate the antimicrobial activity with the total content of tannins and flavonoids. The
agar diffusion test and anti-biofilm assay were used to evaluate the antimicrobial potential of dif-
ferent extracts from the plants. Colorimetric methods (from European Pharmacopeia) were used for
determination of total tannins and flavonoids. The direct antimicrobial activity of most of the tested
extracts was low to moderate. The anti-biofilm activity was found to be down to 10 µg mL −1 for
some extracts. Tannin contents between 2.2% and 10.4% of dry weight and total flavonoid contents
between 0.1% and 1.6% were found. Correlation analysis indicates that the antimicrobial and the
anti-biofilm activity is significantly (p < 0.05) dependent on tannin content, but not on flavonoid
content. The data analysis revealed that tannin-rich herbal drugs inhibit pathogens in different
ways. Thus, some of the tested herbal drugs might be useable for local infections with multi-re-
sistant biofilm-forming pathogens. For some of the tested drugs, this is the first report about anti-
biofilm activity, as well as total tannin and flavonoid content.
Bacteria are an integral part of modern biotechnology. They are used to make a variety of products, such as foods, drugs, as well as a multitude of chemicals. In order to increase their production rates molecular biotechnology offers many tuning points, starting from the selection of an applicable host, over its geno- and phenotypical characterization, followed by genetic manipulations for an optimized metabolism and stabilisation of production processes. This work comprises the optimization of Bacillus subtilis as an expression system. It describes the steps taken for selection and genomic characterization of the B. subtilis wild type strain ATCC 6051, the subsequent optimizations of the strain in respect to growth and productivity, as well as the characterization of its behaviour in a variety of cultivation conditions. The B. subtilis strain most commonly found in laboratories around the world is the first sequenced Gram-positive organism B. subtilis 168. Zeigler et al. showed that strain 168 is not a real wild type. Instead it was created through random mutagenesis with X-rays and selected for transformability. This strain has been used as the basis for popular B. subtilis strains in heterologous gene expression such as the extracellular protease deficient WB strains. Growth experiments showed the real wild type strain ATCC 6051 to be superior to its mutated ancestor 168, making it a solid basis for the construction of an optimized B. subtilis expression system. In order to gain a full understanding of the genomic and corresponding physiological differences between the two systems, B. subtilis ATCC 6051 was sequenced and compared to the genome of B. Subtilis 168. Several variations on geno- and phenotypic level could be revealed, that resulted in particular from genes involved in natural competency, the metabolism of amino acids and chemotaxis. This genomically well characterized B. subtilis ATCC 6051 was improved in respect to its application as an expression host. Improvements were achieved through the inactivation of both sporulation and reduction of autolysis, leading to a more robust behaviour during the overproduction and secretion of a reporter enzyme. A positive effect on the activity of an acetoin induced promoter by the addition of second copies for its transcription factors SigmaL and AcoR could be observed. Anaerobic zones and areas with excess glucose caused by insufficient mixing are common conditions in large scale bioprocesses and lead to oscillating conditions for the cells. In turn, this oscillation provokes an excretion of so called overflow metabolites, which can negatively affect the bacterial productivity. Detailed scientific characterizations of industrial scale processes under such oscillating conditions are scarce due to the high costs and logistics involved. A B. Subtilis sporulation mutant was thus examined in respect to its extra- and intracellular metabolites in a scale-down, two-compartment reactor giving hints about conditions the host is exposed to and how it reacts. To improve tolerance thresholds and utilization capacity for such metabolites in B. subtilis, the glyoxylate cycle was transferred from its close relative Bacillus licheniformis into the genome of B. subtilis. This feature enabled our B. subtilis ACE mutant to grow on acetate. The improved strain showed higher tolerance towards excess glucose in a fed-batch as well as higher productivity during the expression of a reporter enzyme in comparison to the wild type. The ACE strain and B. licheniformis showed an increased formation of glycolate during growth with the glyoxylate cycle. This with regard to bacteria undescribed metabolite seems to play a role as a by-product of the glyoxylate cycle. Summarizing, this thesis deals with the characterization and optimization of B. subtilis for growth on overflow metabolites, enhancements of the acoA-expression system and the influence of sporulation and lysis mutants on its activity. Complementary, the host was begun to be characterized in respect to its behaviour in industrial scale processes.