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Der Speichel des medizinischen Blutegels, H. verbana enthält eine Vielzahl von Proteinen und Peptiden mit deren Hilfe das Tier bei seinen Wirten parasitiert. Die bioaktiven Speichelinhaltsstoffe sind in den einzelligen Speicheldrüsenzellen des Tieres lokalisiert und werden während des Saugaktes über die Ausführgänge einer jeden Zelle in die Bisswunde des Wirtes transferiert. Die Proteine ermöglichen es dem Parasiten das Blut des Wirtes optimal aufzunehmen und es bis zu einem Jahr im Speichermagen zu bevorraten. In den letzten Jahrzehnten wurden einige Speichelproteine identifiziert und rekombinant hergestellt. Aufgrund schmerzstillender, gefäßerweiternder, gerinnungshemmender und vermutlich auch thromobolytischer Eigenschaften sind diese Substanzen in der Humanmedizin und -prophylaxe von potenzieller Bedeutung. Seit Jahrhunderten wird die klassische Blutegeltherapie durch das Ansetzen lebender Egel an die Haut des Menschen von Heilpraktikern und Ärzten erfolgreich durchgeführt. Gleichwohl sind die Funktionen der meisten sekretorischen Speichelproteine weiter ungeklärt und die Mechanismen, die zur Freisetzung der Proteine aus den Vorratsbehältern führen, unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte im Zuge der Quantifizierung der Speichelproteine und -peptide von H. medicinalis und H. verbana festgestellt werden, dass es keine globalen Unterschiede im Expressionsmuster beider Arten gibt. Es ist anzunehmen, dass der ohnehin in den letzten Jahren vermutlich zumeist, wenngleich vom Therapeuten unbewusst, eingesetzte H. verbana ähnliche Speichelproteine wie der tatsächlich medizinisch zugelassene H. medicinalis besitzt. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit mit gelfreien und gelbasierten Methoden erstmals das sekretorische Speichelproteom eines einzelnen Blutegels dargestellt. Dieses wird es zukünftig erlauben, Speichelproteine zu identifizieren und auf deren Funktion zu testen. Mit Hilfe der 3D-Rekonstruktion von Speicheldrüsenzellen konnte ermittelt werden, dass ein adulter Blutegel der Art H. verbana etwa 36.960 Speicheldrüsenzellen mit einem mittleren Volumen von 67.048 ± 38.935 µm³ besitzt. Aus den Daten und dem ermittelten Proteingehalt einer Speicheldrüsenzelle wurde geschlussfolgert, dass ein Blutegel über 1,2 ± 0,7 mg Protein in seinen Speicheldrüsenzellen verfügt. Sollte die gesamte Proteinmenge in den Wirt transferiert werden, könnten individuelle Komponenten des Egelspeichels in einem extrazellulären Verteilungsvolumen von 5 l (Mensch) maximale Konzentrationen zwischen 3 und 236 pmol/l erreichen. Gleichwohl ergaben histologische Studien, die eine Reduktion der Speicheldrüsenzellflächen nach der Nahrungsaufnahme anzeigen und auf eine Entleerung der Speicheldrüsen im Zuge des Saugaktes schließen lassen, dass die Zellflächen in gesogenen Tieren gegenüber den Zellflächen in ungesogen Egel nur um etwa 40 % reduziert sind. Die sich ergebene Frage, ob die Entleerung der Drüsenzellen dementsprechend auch nur anteilig erfolgt, kann derzeit aufgrund nur lückenhafter Erkenntnisse zur inneren Struktur der Speichelsekretionszelle noch nicht beantwortet werden. Mit Verweis auf das einzige pharmakokinetisch umfangreich untersuchte Speichelprotein Hirudin (Ki 2,3 pmol/l) kann jedoch gemutmaßt werden, dass selbst unter der Annahme einer nur 40 %igen Speicheldrüsen-Entleerung die in den Wirt transferierte Menge an individuellen Speichelproteinen eines einzelnen Tieres ausreichend hoch sein könnte, um pharmakologisch wirksame Konzentrationen im Organismus zu erreichen. Interessanterweise gelang es in dieser Arbeit erstmals zu zeigen, dass die Neusynthese der Speichelproteine, obgleich die Tiere von dem Nahrungsblut einer Mahlzeit bis zu einem Jahr leben, bereits innerhalb der ersten beiden Wochen nach der Nahrungsaufnahme stattfindet. Die Mechanismen, die zur Freisetzungen des Materials aus den einzelligen Drüsen führen, sind bislang weitestgehend ungeklärt. Innerhalb dieser Arbeit konnten erste Beiträge geleistet werden, indem elektronenmikroskopisch nachgewiesen wurde, dass die Speicheldrüsenzellen Vesikel enthalten, in denen wahrscheinlich die sekretorischen Speichelinhaltsstoffe vorliegen. Zudem wurde gezeigt, dass Na+/K+-ATPase-Moleküle in nur sehr geringer Abundanz in den Drüsenzellen vorkommen, V-ATPase-Moleküle, die sekundäre Ionentransporte energetisieren (Erhöhung der intrazellulären Osmolyt-Konzentration) und zur Freisetzung des sekretorischen Materials (Platzen der Vesikel) führen könnten, jedoch sehr prominent sind.
Die Atemwege sind mögliche Eintrittspforten für Staphylococcus aureus in den menschlichen Organismus. Inhalierte Bakterien oder Bakteriencluster kommen initial vermutlich nicht direkt mit den Epithelzellen der Atemwege in Kontakt, sondern nur mit der aufgelagerten Mukusschicht. Die Mikroorganismen nehmen in dieser Situation möglicherweise über sekretorische lösliche Virulenzfaktoren auf die Funktion der Epithelzellen Einfluss und können dadurch das Infektionsgeschehen für sich günstig beeinflussen. Die Behandlung einer Infektion ist oft schwierig, da viele S. aureus-Stämme resistent gegenüber Antibiotika sind. Es ist daher von großem Interesse, mehr über die vielfältigen Interaktionen dieser Bakterien mit ihren eukaryotischen Wirtszellen in Erfahrung zu bringen. Bisher ist nur wenig über die Reaktionen humaner Atemwegsepithelzellen auf Kontakt mit S. aureus-Sekretionsprodukten bekannt, deswegen wurden in dieser Arbeit die Effekte der löslichen Virulenzfaktoren, Hämolysin A und B, auf die Zellmorphologie, Zytokinsezernierung und Ca2+-Signaltransduktion in verschiedenen humanen Atemwegsepithelzellen (16HBE14o-, S9, A549) genauer charakterisiert. Unter rHla-Einwirkung konnte in konfluenten Zellrasen die Bildung parazellulärer Lücken beobachtet werden, wobei die Stärke der Reaktion zelltypspezifisch war. Für die in vivo-Situation könnte der Verlust des stabilen Zellverbands bedeuten, dass das Bakterium dadurch die Möglichkeit erhielte, in den Wirtsorganismus einzudringen. Die Untersuchungen an primären Nasenepithelzellen unterstützen diese Schlussfolgerung. Hingegen zeigten Hämolysin B und die bakteriellen Zellwandbestandteile Lipoteichonsäure und Peptidoglykan kaum Effekte auf die Morphologie der Zellen. Durch fluorometrische Messung mit Indo1-beladenen Zellen wurde deutlich, dass die rHla-Behandlung und der daraus resultierende Einbau von Hla-Poren in die Membran der Atemwegsepithelzellen zu einem Ca2+-Einstrom in die Zellen führen. Wurden die A549-Zellen mit höheren Hla-Konzentrationen behandelt, war der Ca2+-Einstrom sehr stark und konnte nicht durch den zelleigenen Ca2+-Auswärtstransport kompensiert werden, so dass die intrazelluläre Ca2+-Konzentration [Ca2+]i stetig anstieg. Diese Ca2+-Überladung könnte zur Schädigung der Zellen oder gar zum Absterben einiger Zellen beigetragen haben, was in den Experimenten mit dem Time lapse-Mikroskop beobachtet wurde. Auch die Behandlung der A549-Zellen mit rHlb, durch dessen Sphingomyelinase-Aktivität Spaltprodukte entstehen können, die selbst als Signalmoleküle fungieren, führte zu einer leicht veränderten [Ca2+]i in den A549-Zellen. Ob dieses durch Sphingosin-1-Phosphat erfolgt, das in A549-Zellen tatsächlich ein deutliches Ca2+-Signal erzeugt, oder durch andere Hlb-bedingte Effekte auf die Zellen, wurde nicht abschließend geklärt. Auch der direkte Einfluss der beiden Hämolysine auf die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zyto- und Chemokinen aus den Atemwegsepithelzellen unter rHla und rHlb wurde quantitativ bestimmt. Mit Hilfe von FlowCytomix-Kits konnte ebenfalls gezeigt werden, dass beide Hämolysine die Sekretion von IL-6 und IL-8 aus den Zellen bewirken. Um die physiologischen Vorgänge im respiratorischen Gewebe nach Kontakt mit S. aureus bzw. dessen Virulenzfaktoren zu ergründen, wurden in dieser Arbeit verschiedene endogene Proteinkinasen und Signalmoleküle der Atemwegsepithelzellen pharmakologisch inhibiert und untersucht, wie sich die selektive Hemmung der Signaltransduktion auf die Lückenbildung im Zellrasen unter der Stimulation mit rHla auswirkt. Da die intrazelluläre Konzentration von Ca2+-Ionen für die Steuerung der Salz- und Wassersekretion im respiratorischen Gewebe und somit für die Abwehr potentieller Pathogene wichtig ist, wurden für diese Arbeit einige Schlüsselelemente dieses Systems analysiert. Die Resultate weisen auf eine komplexe Verbindung der Signalwege hin, wobei die Zellantworten häufig Zelltyp-spezifisch waren. Es konnte durch Time lapse-Beobachtungen gezeigt werden, dass Calmodulin, c-Src, Calpaine, die Proteinkinasen A, G, B und C sowie NF-κB den Zellen tendenziell helfen, ihre Zellform unter rHla-Einwirkung zu bewahren. Für Calmodulin, die Ca2+/CaM abhängige Kinase II, ERK1/2, p38 und NF-κB wurde eine Beteiligung an der Erhöhung der Sekretionsraten von IL-8 und IL-6 durch rHla sowie rHlb festgestellt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die untersuchten Signalwege, je nach Intensität der Einwirkung der bakteriellen Faktoren auf die Atemwegsepithelzellen, sowohl zellprotektive als auch Epithel-beeinträchtigende Prozesse beeinflussen, jedenfalls aber in die Produktion von Signalen (Freisetzung von Zyto- und Chemokinen) eingebunden sind, die solcherart Epithelzellen in vivo an das Immunsystem eines Wirts senden.
Herzinsuffizienz ist eine der häufigsten Ursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. Zum jetzigen Zeitpunkt ist die Herztransplantation im fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung der einzige kurative Therapieansatz. Durch den Einsatz von Stammzellen als Therapieoption der Herzinsuffizienz konnten in den letzten Jahren im Rahmen von tierexperimentellen und klinischen Studien zahlreiche vielversprechende Daten gewonnen werden. Ziel der Stammzelltransplantationen ist es, das geschädigte Gewebe zu ersetzen, die Gefäßneubildung zu induzieren und somit die kardiale Funktion aufrechtzuerhalten. Kardialen Stammzellen wird durch die Fähigkeit der Selbsterneuerung, Proliferation und der Differenzierung in spezialisierte Zelltypen ein großes Regenerationspotential zugeschrieben. Weiterhin wurde ein positiver Einfluss von kardialen Stammzellen auf die Gefäßneubildung mittels parakriner Effekte beschrieben. Obwohl durch die Transplantation von kardialen Stammzellen eine Regeneration des geschädigten Gewebes, z.B. nach einem Myokardinfarkt, beobachtet wurde, ist noch wenig über die genauen Wirkungsweisen der eingesetzten Stammzellen bekannt. Zudem bleibt unklar, welchen Einfluss eine Schädigung des Herzens auf die Stammzellen und ihre Funktion hat und welche Faktoren dabei eine Rolle spielen. Die Existenz von residenten kardialen Stammzellen konnte sowohl im tierischen als auch im humanen Herzen nachgewiesen werden. Jedoch ist bis heute nicht geklärt, warum der Pool an residenten kardialen Progenitorzellen nicht merklich zur Regeneration nach einer Schädigung beitragen kann. Die vorliegende Arbeit befasste sich daher mit der Untersuchung der Funktion muriner residenter kardialer Progenitorzellen, die positiv für das Stammzellantigen-1 (Sca-1) sind, unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen. Hierfür wurde der Einfluss des Renin-Angiotensin-Aldosteron Systems (RAAS), welches entscheidend an der Entwicklung einer Herzinsuffizienz beteiligt ist, auf die Funktion Sca-1 positiver Zellen in vitro untersucht. Anschließend wurde der Einfluss pathophysiologischer Aldosteronkonzentrationen, wie sie im Rahmen einer Herzinsuffizienz nachweisbar sind, auf die sekretorische Aktivität der Sca-1 positiven Zellen bestimmt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Komponenten des RAAS die Migrationsrate Sca-1 positiver Zellen dosis- und zeitabhängig beeinflussen, wobei vor allem pathophysiologische Konzentrationen von Aldosteron eine signifikante Steigerung der Migrationsrate der Sca-1 positiven Zellen bewirkten. Des Weiteren konnte eine Mineralokortikoidrezeptor-vermittelte Wirkungsweise des Aldosterons auf die Funktion der Sca-1 positiven Zellen festgestellt werden, welche durch den Einsatz der Aldosteron-Antagonisten Spironolakton und Eplerenon inhibiert wurde. Anhand der an Sca-1 positiven Zellen durchgeführten Sekretomanalysen konnte gezeigt werden, dass sich die sekretorische Aktivität kardialer Progenitorzellen unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen unterscheidet. Pathophysiologische Stimuli führen zu einer erhöhten sekretorischen Aktivität kardialer Progenitorzellen. Die Analyse der sekretierten löslichen Faktoren deutet auf eine Beteiligung Sca-1 positiver Zellen an Reparatur- und Regenerationsprozessen mittels parakriner Mechanismen nach einer Schädigung hin. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass mit dem Mineralokortikoid Aldosteron ein Faktor identifiziert wurde, welcher zur Optimierung der Stammzelltherapie, z.B. im Rahmen einer Herzinsuffizienz, dienen kann. Weiterhin konnte in dieser Arbeit das Verhalten und die Funktion kardialer Progenitorzellen unter pathophysiologischen Bedingungen näher charakterisiert werden und mögliche Mechanismen aufgezeigt werden, über welche kardiale Stammzellen an Regenerationsprozessen beteiligt sein können.
Sowohl für die Leistungsausprägung als auch die Gesundheit landwirtschaftlicher Nutztiere ist die relative Verteilung von Skelettmuskel- und Fettgewebe ein entscheidender Faktor. Entwicklungs- und Wachstumsprozesse werden neben gewebespezifischen Faktoren auch durch Wechselwirkungen zwischen beiden Geweben beeinflusst. Beim Menschen sind das Auftreten von Adipositas und die damit verbundene geringere Ausprägung der Muskulatur und Veränderung metabolischer Prozesse entscheidende Risikofaktoren für die Entwicklung von Krankheiten. Die Aufklärung der Regulation der Entwicklung von Muskel- und Fettgewebe ist daher ein wichtiges Anliegen der Nutztierforschung, aber auch der humanmedizinischen Forschung. Adiponectin und Leptin gehören zu den am besten untersuchten Adipokinen, wobei der Fokus hauptsächlich auf der Regulation der Fettsäureoxidation, des Glucosestoffwechsels und der Insulinsensitivität lag und liegt. Beide Faktoren können sowohl von Fett- als auch Skelettmuskelgewebe synthetisiert und sezerniert werden und somit physiologische Prozesse in beiden Geweben beeinflussen. In wenigen Studien, hauptsächlich durchgeführt am Muskel von Nagern, wurden unterschiedliche Ergebnisse gezeigt, die auf widersprüchliche Effekte (positiv, negativ oder nicht nachweisbar) der Adipokine auf das Muskelwachstum hinweisen. Die Wirkung beider Adipokine auf den Proteinstoffwechsel porciner Muskelzellen wurde bisher noch nicht beschrieben. Ebenso gibt es bislang keinen Nachweis für das Vorhandensein der spezifischen Rezeptorproteine für Adiponectin (ADIPOR1, ADIPOR2) und Leptin (LEPR) im Skelettmuskel des Schweins. Das Ziel der Untersuchungen dieser Arbeit bestand in der Erforschung zellulärer und molekularer Prozesse der Regulation des Wachstums porciner Skelettmuskelzellen durch Adiponectin und Leptin. Es sollten erstmals 1) die direkte Wirkung beider Adipokine auf das Wachstum und die Differenzierung porciner Skelettmuskelzellkulturen und 2) die zugrundeliegenden Regulationsmechanismen unter Beteiligung wichtiger Signalwege des Energie- und Proteinstoffwechsels beschrieben werden. Aufgrund der Genexpression der spezifischen Rezeptoren für Adiponectin kann der porcine Skelettmuskel als Adiponectin-sensitives Gewebe betrachtet werden. Bei den Untersuchungen zeigte sich, dass die Wirkungen von Adiponectin und Leptin auf proliferierende porcine Skelettmuskelzellen von den vorherrschenden Kulturbedingungen abhängig sind. Die Behandlung mit Adiponectin bei der Verwendung von serumfreiem aber Wachstumsfaktor-supplementiertem Medium resultierte in einer verminderten DNA-Syntheserate, welche auf Wechselwirkungen zwischen dem Adipokin und dem im Medium vorhandenen Wachstumsfaktor bFGF zurückzuführen war. Für Leptin konnte unter diesen Bedingungen nur eine kurzzeitige Hemmung der Proliferation porciner Muskelzellen beobachtet werden. Des Weiteren wurde die Wirkung von Adiponectin, aber nicht Leptin, auf die Prolfiferation porciner Myoblasten durch Ölsäure moduliert. Weiterhin zeigte sich, dass die Vitalität adipokinbehandelter Zellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen unter serumfreien, wachstumsfaktor-supplementierten Bedingungen leicht verbessert war. Unter Niedrigserumbedingungen führten beide Adipokine zu einer gesteigerten DNA-Syntheserate, welche bei Leptin mit einer Verminderung der Zellzahl einherging. Im Gegensatz zu serumfreien Kulturbedingungen, unter denen die vorhandenen Wachstumsfaktoren die Zellen offensichtlich vor einem negativen Einfluss der Adipokine schützen, wurde bei der Verwendung von Medium mit niedrigem Serumgehalt eine verminderte Zellvitalität adipokinbehandelter Zellen beobachtet. Ein Einfluss von Adiponectin und Leptin auf den Proteinstoffwechsel differenzierender Kulturen konnte unter den verwendeten Kulturbedingungen nicht gezeigt werden. Weiterhin erhöhten Adiponectin und Leptin zwar den Differenzierungsgrad porciner Myoblasten in Form eines erhöhten Fusionsgrades, aber nicht bezüglich der Aktivität des Markerenzyms Creatinkinase. Die Untersuchungen verschiedener intrazellulärer Schlüsselsignalmoleküle zeigen erste Hinweise auf eine Beteiligung des p44/42 MAPK Signalweges an der Vermittlung der Adipokineffekte, obwohl dessen Aktivierung möglicherweise zu kurz ist, um eine langfristige stimulierende Wirkung auf downstream targets und somit auf physiologische Prozesse zu haben. Die Ergebnisse dieser Arbeit leisten zum einen einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung der Regulation von Wachstums- und Entwicklungsprozessen des Muskel- und Fettgewebes durch wechselseitige Beeinflussung. Zum anderen sind die beim Schwein gewonnenen Erkenntnisse aufgrund der dem Menschen ähnlichen Physiologie durchaus auf die Humanforschung übertragbar und somit ebenfalls für die Erforschung adipositas-assoziierter Erkrankungen beim Menschen relevant.