Die gleichzeitige Gabe von Arzneimitteln kann durch Inhibition oder Induktion von intestinalen Transportproteinen bzw. metabolischen Enzymen unerwünschte Arzneimittelinteraktionen verursachen. Bewirkt wird der induktive Effekt durch die Aktivierung von nukleären Rezeptoren wie PXR. Aktuell sind keine in vitro-Modelle verfügbar, die die Interaktion auf intestinaler Ebene infolge von Induktionsprozessen prognostizieren können. Für intestinale Absorptions- und inhibitorische Arzneistofftransportstudien werden bisher die häufig genutzten Caco-2-Zellen verwendet, da sie enterozytenartige Eigenschaften besitzen. Allerdings gibt es einige Unklarheiten, die das Caco-2-Modell betreffen, wie bspw. der optimale Zeitraum der Zellkultivierung, das fragliche Vorhandensein von nukleären Rezeptoren und die umstrittene Repräsentanz von Colon-Karzinomzellen für den intestinalen, jejunalen Arzneimitteltransport.
Ziel dieser Arbeit war es somit, die Eignung der präklinisch genutzten Caco-2-Zellen als in vitro-Modell für Transporter-bedingte Arzneimittelinteraktion und intestinalen Arzneimitteltransport zu untersuchen. Hierzu wurde die Expression klinisch relevanter intestinaler Arzneistofftransporter, Metabolisierungsenzyme und nukleärer Rezeptoren in Caco-2-Zellen auf Gen- und Proteineben mittels real time-RT PCR (TaqMan®-Prinzip) und LC-MS/MS-basiertem targeted proteomics bestimmt und mit der Expression in humanem Jejunum verglichen. Ferner wurde die Expression der erwähnten Determinanten in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit und nach Induktion mit den prototypischen Induktoren Carbamazepin, Efavirenz, Hyperforin, Hypericin und Rifampicin untersucht. Zuletzt wurde der Einfluss der Induktoren auf die Funktion des Transporters ABCB1, anhand eines bidirektionalen Transportassays mit den radioaktivmarkierten ABCB1-Substraten [3H]-Digoxin und [3H]-Talinolol, ermittelt.
Die Expression der Transporter und nukleären Rezeptoren auf Gen- und Proteinebene in Caco-2-Zellen unterschieden sich deutlich zu der von jejunalem Gewebe. Für die Transporter ABCB1, ABCC2, OATP1A2, OATP2B1, PETP1 und das Enzym UGT1A1 konnte eine signifikante Zunahme der mRNA-Expression mit der Dauer der Kultivierungszeit festgestellt werden, die auf Proteinebene nicht gezeigt werden konnte. Die Induktoren Carbamazepin, Hyperforin, Hypericin und Rifampicin wiesen einen Effekt auf die mRNA-Expression, nicht aber auf die Proteinmenge der Transporter auf. In Übereinstimmung zu den Befunden der fehlenden Transporterinduktion konnte kein Effekt der Induktoren auf die Funktion von ABCB1 beobachtet werden.
Caco-2-Zellen sind daher nicht als in vitro-Modell geeignet um Arzneimittel-interaktionen prognostizieren zu können, die durch die Induktion von Transportern entstehen.
Die Duchenne Muskeldystrophie stellt eine X-chromosomal rezessiv vererbte, schwere Form der Muskeldystrophie dar. Die Ursache ist eine Mutation im Dystrophingen und die Folgen äußern sich in Muskelschwäche, Muskelfasernekrosen und einer verstärkten Fibrosierung. Der genaue Pathomechanismus ist noch nicht abschließend geklärt. Durch Muskelbiopsien von DMD Patienten und mit Hilfe des homologen Tiermodells, der mdx-Maus, konnte herausgefunden werden, dass der intrazelluläre Kalziumgehalt der Dystrophin-defizienten Muskelfasern erhöht ist. Einen möglichen Therapieansatz könnte die Blockierung von Kationenkanälen der Muskelfasermembran, die den pathologischen Kalziumeinstrom ermöglichen, darstellen. In vorangegangenen Arbeiten werden die TRP-Kanäle (Transient Receptor Potential channels) für den pathologischen Kalziumeinstrom mitverantwortlich gemacht. In der vorliegenden Arbeit wurde der Fokus in erster Linie auf einen Vertreter der TRP-Kanal-Superfamilie, den TRPV4, gelegt. Zu diesem Zweck wurde die TRPV4-Knock out Maus näher untersucht. Zunächst führte man eine Standardhistologie mit Hilfe von HE, Sirius RED und ATPase-Färbung durch. Sowohl die Faserkaliberbestimmung als auch die Messung des Bindegewebsanteils zeigten keine Unterschiede zum Wildtypen. Eine anschließende Genstudie mittels RT-PCR ermöglichte die Quantifizierung der mRNA Expression von 22 TRP-Kanälen in der murinen Skelettmuskulatur. Dabei sollte in dieser Arbeit unter anderem die Frage einer möglichen Gegenregulation anderer-Kanäle auf Grund des TRPV4-Mangels in der TRPV4-KO Maus geklärt werden. Des Weiteren wurde auch ein Vergleich der mRNA Kanal-Expression zwischen schnellen (EDL) und langsamen (SOL) Muskel vorgenommen. Die Untersuchungen zeigten, dass von den 22 analysierten TRP-Kanälen 16 auf mRNA Ebene exprimiert werden. Dabei wiesen TRPV2 und TRPV3 eine erhöhte mRNA Expression in der TRPV4-KO Mutante im Vergleich zum Wildtyp auf. Signifikant war dieser Unterschied für TRPV2 im M. soleus und für TRPV3 in allen drei untersuchten Skelettmuskeln (TA, EDL, SOL). Dies könnte für eine Gegenregulation dieser 2 TRP-Kanäle in TRPV4-defizienten Muskelfasern sprechen. Des Weiteren wurde eine signifikant verstärkte mRNA Expression von TRPM3, M4, M6, M8, V2, V4, und V6 im langsam zuckenden M. soleus im Vergleich zum schnell zuckenden EDL beobachtet. Dies trifft sowohl für die TRPV4-KO als auch für die WT Mäuse zu und könnte für eine stärkere Expression dieser TRP-Kanäle in den langsamen TYP 1 Fasern des M. soleus sprechen. Aus den vorliegenden Ergebnissen geht hervor, dass im Falle des Verlustes eines TRP-Kanals höchstwahrscheinlich andere Vertreter dieser Kanalfamilie in der Lage sind durch eine verstärkte Expression den Mangel zu kompensieren. Dies gilt es im Rahmen einer möglichen Therapie der Duchenne Muskeldystrophie, zum Beispiel mit Hilfe von TRP-Kanalblockern, zu beachten.
Hintergrund: LOX-1, ein Rezeptor für oxidiertes Low-Density Lipoprotein, wird von Endothelzellen, Makrophagen, vaskulären glatten Muskelzellen und anderen Zellen exprimiert. Seine Expression kann durch oxidiertes LDL (oxLDL), Angiotensin II, inflammatorische Zytokine (zum Beispiel Tumornekrose-Faktor alpha), Scherkräfte am Endothel und andere Faktoren induziert werden. LOX-1 ist bei der Entstehung von oxidativem Stress und der endothelialen Dysfunktion beteiligt und trägt vermutlich zur Instabilität von atherosklerotischen Plaques bei, was bei Patienten mit einer koronaren Herzkrankheit zum akuten Koronarsyndrom führen kann. Material und Methoden: Untersucht wurden Atherektomieproben von 37 Patienten (Alter 62,5 ± 9,7 Jahre, Body-Mass-Index 28,6 ± 5,3 kg/m2), die sich zwischen Juli 2001 und April 2005 wegen Brustschmerzen/Angina pectoris einer medizinisch indizierten Koronarangiographie mit in gleicher Sitzung durchgeführter Direktionaler koronarer Atherektomie (DCA) in der Klinik für Innere Medizin B der Universitätsmedizin Greifswald unterzogen hatten. Die in der DCA gewonnenen Atherektomieproben wurden sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren, am Kryotom (Leica C19) ohne aufzutauen geschnitten (Schnittdicke 5 Mikrometer) und mit Hämatoxylin/Eosin (H.E.), Ölrot O (für Lipide), Elastica-van Gieson (für Kollagen) und von-Kossa (für Verkalkungen) gefärbt. Die LOX-1 Expression wurde durch ein Immunfluoreszenz-Verfahren mit einem polyklonalen Kaninchenantikörper, der gegen die Aminosäuren 143 bis 273 des humanen LOX-1 Proteins gerichtet war, und einem FITC-markierten Sekundärantikörper nach dem ELISA-Prinzip (Enzyme-linked immunosorbent Assay) nachgewiesen. Die digitalen Aufnahmen wurden mit Corel PHOTO-PAINT 12, Scion Image und SigmaPlot 11 analysiert. Die LOX-1 Signalintensitäten wurden mit dem in der Koronarangiographie ermittelten Stenosegrad der betreffenden Plaques, dem Lipidgehalt in der Plaque und anderen Patientenparametern (z.B. Vorliegen eines akuten Koronarsyndroms) verglichen. Zur statistischen Analyse wurde der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman bestimmt und der Mann-Whitney-Rank-Test durchgeführt. Ergebnisse: Die LOX-1 Expression korrelierte mit dem Lipidgehalt der humanen koronaren Atherektomieproben, jedoch im Mittel statistisch nicht signifikant (p=0,056). Im Trend war die LOX-1 Expression in den Proben von Patienten mit einem akuten Koronarsyndrom (n=11), bei Männern (n=26) und Rauchern (n=15) höher und in Patienten, die HMG-CoA-Reduktase-Hemmer einnahmen (zum Beispiel Simvastatin), niedriger (n=16). Keine Korrelationen fanden sich zwischen LOX-1 Expression und Stenosegrad, Plaquelokalisation, Alter, Body-Mass-Index, Arterieller Hypertonie (n=31), Diabetes mellitus Typ II (n=9) und Dyslipoproteinämie (n=32). Schlussfolgerungen: Die LOX-1 Expression in atherosklerotischen Plaques ist positiv mit dem Lipidgehalt der Plaques assoziiert und ist im Trend höher in Patienten mit einem akuten Koronarsyndrom. Eine hohe LOX-1 Expression in atherosklerotischen Plaques könnte zu deren Instabilität somit zum Auftreten eines akuten Koronarsyndroms beitragen. Die Senkung des LDL-Angebots in der Arterienwand und Wege zur Plaquestabilisierung bei manifester Atherosklerose bleiben wichtigste Therapieziele.
Der klinische Erfolg einer Arzneimitteltherapie wird maßgeblich durch pharmakokinetische Eigenschaften eines Arzneistoffes bestimmt. Dieser ist unter anderem vom Transport und der Verteilung des Arzneistoffes in die Zielkompartimente abhängig. Während der Einfluss intestinal exprimierter Transportproteine auf die Absorption eines Arzneistoffes nach oraler Gabe bereits umfassend untersucht wurde, ist die Beteiligung dieser Proteine bei der Verteilung von Xenobiotika in die jeweiligen Wirkkompartimente ist bisher weniger umfassend untersucht. Ein Beispiel ist die pulmonale Penetration eines oral verabreichten Arzneistoffes. Es gibt erste Hinweise, die auf eine Beteiligung von Transportproteinen an der Akkumulation von beispielsweise Makrolidantibiotika in der Lunge schließen lassen. Ziel dieser Arbeit war, die Expression von für den Arzneimitteltransport wichtigen Proteinen in unterschiedlichen Kompartimenten der Lunge und gleichzeitig den Einfluss dieser auf die Verteilung von Arzneistoffen in die pulmonale Epithelialflüssigkeit und die bronchoalveolären Lavagezellen zu untersuchen. Die klinisch indizierte Kombinationstherapie eines Makrolides mit Rifampicin zur Eradikation von Rhodococcus equi in Fohlen bietet eine geeignete Grundlage dafür. Zur Auswertung pharmakokinetischer Untersuchungen entwickelten und validierten wir eine Flüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS)-Methode. Diese ermöglichte die Quantifizierung von Clarithromycin, 14-Hydroxyclarithromycin, Rifampicin und dessen Hauptmetaboliten 25-O-Desacetylrifampicin sowohl in den Proben der tierexperimentellen Studien als auch in den Zelllysaten der in vitro-Untersuchungen. In zwei Interaktionsstudien an gesunden Fohlen sollte der Einfluss einer chronischen Komedikation von Rifampicin, einem Induktor der Genexpression von ABC-Transportern, auf die Verteilung der Makrolide Tulathromycin bzw. Clarithromycin in die pulmonalen Kompartimente untersucht werden. Hierbei stellten wir nach Rifampicingabe eine deutliche Abnahme der Akkumulation beider Makrolide in den pulmonalen Kompartimenten fest. Die mittels TaqMan®-Methoden durchgeführten Genexpressionsuntersuchungen ergaben den unerwarteten Befund einer fehlenden Induktion der mRNA von ABCB1 und ABCC2 durch Rifampicin. Für Clarithromycin ist bekannt, dass es ein Substrat von ABCB1 und ABCC2 ist. In in vitro-Transportstudien an überexprimierenden Zellmodellen sowie Vesikeln transfizierter Zellen zeigten wir, dass Tulathromycin keine Affinität zu den genannten Transportproteinen besitzt. Somit konnten die pulmonalen Auswärtstransporter nicht ursächlich sein für den Verlust an Makrolidkonzentration an ihrem Wirkort. Gleichzeitig sank die orale Bioverfügbarkeit von Clarithromycin signifikant um mehr als 90% wohingegen die Bioverfügbarkeit von Tulathromycin nur um 25% sank. Dieser drastische Verlust an Bioverfügbarkeit von Clarithromycin konnte weder allein mit einem gesteigerten intestinalen Efflux noch durch den gesteigerten hepatischen Metabolismus des CYP3A4-Substrates erklärt werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine Beteiligung anderer intestinaler Aufnahmemechanismen hin. Die anschließend durchgeführte Studie zur Untersuchung der akuten Interaktion von Clarithromycin und Rifampicin erbrachte ähnliche Ergebnisse bezogen auf die pulmonalen Kompartimente. Die orale Absorption war jedoch um „nur“ 70% reduziert. Den Unterschied von etwa 20% in der Veränderung der oralen Absorption von Clarithromycin verglichen zur chronischen Therapie konnten wir mit der nach akuter Komedikation ausbleibenden Induktion von ABCB1, ABCC2 und dem Biotransformationsenzym CYP3A4 begründen. Auffallend waren die verdoppelten Verhältnisse der Konzentration von Clarithromycin in der Epithelialflüssigkeit verglichen zum Plasma sowohl nach chronischer als auch nach akuter Komedikation. Die weiteren Transportuntersuchungen an transfizierten Zellen zeigten einen inhibitorischen Einfluss von Clarithromycin auf alle Vertreter der organic anion transporting polypeptide (OATP-) Familie (OATP1B > OATP1B1 > OATP1A2 > OATP2B1). In den direkten Akkumulationsversuchen stellte sich Clarithromycin jedoch nicht als Substrat der genannten Transportproteine dar. Wir konnten somit verdeutlichen, dass die klinisch indizierte Kombinationstherapie aus Makroliden und Rifampicin zur Elimination des pathogenen R. equi mit einer drastischen Absorptionsminderung von Clarithromycin verbunden ist und die Akkumulation im pulmonalen Zielkompartiment deutlich beeinträchtigt ist. Dennoch werden in der pulmonalen Epithelialflüssigkeit und den bronchoalveolären Lavagezellen therapeutisch ausreichend hohe Konzentrationen erreicht. Wir konnten im Vergleich der akuten und der chronischen Interaktion der Antibiotika die Beteiligung von intestinalen Transportmechanismen, die durch Rifampicin modulierbar sind, nachweisen. Die detaillierte Aufklärung der beteiligten Transportproteine bietet Ansatzpunkte für zukünftige Forschungsarbeiten.
Einfluss der Kochsalzaufnahme auf die renale Genexpression von Komponenten des Endothelinsystems
(2011)
In der vorliegenden Studie wurde das renale Endothelinsystem auf Genexpressions- und Peptidebene bei Variation der diätetischen Kochsalzaufnahme in physiologisch relevanten Größenordnungen bei der Sprague-Dawley-Ratte ubtersucht. Das Ziel war eine systematische Darstellung der Veränderungen der wichtigsten Komponenten des Endothelinsystems mit einer differenzierten Betrachtung von Nierenrinde und Nierenmark. Dazu wurde in einer ersten experimentellen Serie der Kochsalzgehalt der zugeführten Nahrung zwischen 0,15% und 1,80% variiert. Um den Einfluss des Renin-Angiotensin-Systems auf kochsalzinduzierte Veränderungen des renalen Endothelinsystems zu untersuchen, wurde ein Teil der Tiere mit dem AT1-Rezeptorblocker Losartan behandelt. Es wurden simultan Herzfrequenz, arterieller Blutdruck und die renale Na+-Bilanz bei den Tieren gemessen und am Ende des Experimentes die Nieren gewonnen. Anschließend erfolgten die Bestimmung der mRNA-Gehalte von Prä-pro-ET-1, des ETA- und ETB-Rezeptors sowie des renalen immunreaktiven ET-1-Gehaltes. Zur besseren Lokalisierung und Präzisierung der gefundenen Veränderungen schlossen wir eine zweite experimentelle Serie an, in der eine feinere Präparation des Nierenmarks in äußere und innere Medulla, eine weitere Verringerung des Kochsalzgehaltes der Niedrigsalzgruppe (0,05%) sowie eine Erweiterung der Genexpressionsuntersuchungen um das Endothelin-Converting-Enzym-1 (ECE-1) erfolgte. Die Ergebnisse der Studie lassen sich wie folgt zusammenfassen: Die Variation der Salzdiät beeinflusste weder den arteriellen Blutdruck noch die Herzfrequenz der Tiere. Hinsichtlich der Genexpression war eine Niedrigsalzdiät von 0,15% NaCl mit einem Anstieg der mRNA-Expression von Prä-pro-ET-1 (51%), des ETA- (81%) und ETB- Rezeptors (33%) sowie mit einem erhöhten immunreaktiven ET-1-Gehalt (110%) im gesamten Nierenmark assoziiert. In der weiterführenden Untersuchung unter 0.05% NaCl konnte dieser Effekt auf der Genexpressionsebene in der äußeren Medulla reproduziert werden, allerdings in milderer Ausprägung (Prä-pro- ET-1 37%, ETA 20%, ETB n. sign., ECE-1 16%). Diese Diäteffekte ließen sich durch eine selektive AT1-Rezeptorblockade mittels Losartan teilweise bzw. vollständig aufheben. Der renale Cortex blieb durch Variation der Kochsalzaufnahme sowohl hinsichtlich der mRNA-Expression der einzelnen Komponenten des Endothelinsystems als auch hinsichtlich des immunreaktiven ET-1-Gehaltes weitgehend unbeeinflusst. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass vorwiegend das medulläre Endothelinsystem sowohl auf Transkript- als auch auf Peptidebene auf moderate Veränderungen der nutritiven Kochsalzaufnahme reagiert. Die signifikanten Veränderungen auf Genexpressionsebene betreffen dabei Prä-pro-ET-1 und den ETA-Rezeptor insbesondere in der äußeren Medulla unter Niedrigsalzdiät. Diese Alterationen werden zumindest partiell durch AT1-Rezeptoren vermittelt.
Die bedeutende Rolle eines insulinomimetischen Stoffwechsel- und Signalmilieus in glykogenotischen hepatozellulären Präneoplasien konnte in zwei etablierten Rattenmodellen der Zirrhose-unabhängigen Hepatokarzinogenese unlängst belegt werden. Trotz des Einwirkens unterschiedlicher Karzinogene verläuft dieser Prozess sowohl im Modell der niedrigdosierten intrahepatischen Pankreasinseltransplantation in diabetischen Ratten als auch im chemischen Modell mit nicht-diabetischen Ratten nach N-Nitrosomorpholin (NNM)-Exposition nach der typischen glykogenotisch-basophilen Entwicklungssequenz mit ausgeprägten Ähnlichkeiten bezüglich Morphologie und molekularbiologischen Veränderungen. Welche Bedeutung insulinomimetische Mechanismen während der weiteren Karzinogenese in diesen Modellen noch haben und welche zusätzlichen pathogenetischen Faktoren hinzukommen, ist bisher weitgehend unbekannt und soll durch eine globale Genexpressionsanalyse näher beleuchtet werden. Dazu wurden verschiedene morphologische Karzinogenesestadien von Ratten aus dem Inseltransplantations- und NNM-Modell mit Hilfe der komparativen cDNA-Mikroarray-Technik auf intraindividuelle Expressionsveränderungen mehrerer tausend Gene untersucht. Neben glykogenotischen Präneoplasien, weiter fortgeschrittenen gemischtzelligen Präneoplasien und hepatozellulären Karzinomen (HCC) aus dem Transplantationsmodell Streptozotocin (Stz)-diabetischer Ratten sowie glykogenotischen Präneoplasien und HCC aus dem NNM-Modell befand sich auch eine Gruppe autoimmun-diabetischer Ratten mit glykogenotischen Präneoplasien nach Inseltransplantation unter den Versuchstieren. Mit Hilfe dieser Versuchsgruppe sollten potentiell relevante Unterschiede der Expressionsveränderungen zwischen den glykogenotischen Präneoplasien der verwandten Transplantationsmodelle aufgedeckt werden, welche auf die einmalige Stz-Applikation im klassischen Transplantationsmodell zurückzuführen sein könnten. Die Expressionveränderungen betreffen in beiden Modellen mehrere hundert Gene aus zahlreichen zellulären Prozessen, wobei insgesamt (2512 versus 1717) und bei Gegenüberstellung der korrespondierenden Stadien im klassischen Inseltransplantationsmodell stets mehr Gene alteriert sind als im NNM-Modell. Am geringsten ist die Zahl alterierter Gene in den glykogenotischen Präneoplasien der autoimmun-diabetischen Ratten. Die in allen Versuchsgruppen prozentual am stärksten von den Expressionsveränderungen betroffenen Gene stammen von intrazellulären Signalmediatoren, Transkriptionsregulatoren und Membranrezeptoren. Aus dem Bereich des Grundstoffmetabolismus sind Lipid- und Kohlenhydratstoffwechsel am stärksten betroffen. Insgesamt gibt es bezüglich der alterierten Zellprozesse keine wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsgruppen. Die Expressionsveränderungen nehmen bis zur Vervierfachung im Karzinomstadium im Verlauf der Karzinogenese in beiden Modellen zu (kumulativer Effekt). Unter den alterierten Genen finden sich neben solchen des Glukose-Turnovers und der Insulin-Signaltransduktion zahlreiche weitere Karzinogenese-assoziierte Gene, darunter lipogene Mediatoren, mehrere Wachstumsfaktoren (ErbB-, FGF- und Annexin-Familie), Mediatoren der Angiogenese, Apoptoseregulation und der intrazellulären Signaltransduktion, onkogene Transkriptionsfaktoren, DNA-Reparaturgene sowie einige bekannte Protoonko- und Tumorsuppressorgene. Die Expressionsveränderungen sprechen auch für eine Rolle von insulinomimetischen Mechanismen in der späten experimentellen Hepatokarzinogenese, wobei diese eher durch andere Karzinogenese-assoziierte Phänomene als durch direkte Insulinrezeptor-Signalübertragung aufrechterhalten werden könnten. So ließen sich einige Expressionsveränderungen des Glukosestoffwechsels zum Beispiel mit Hilfe des Warburgeffekts oder als Hypoxie-induziert erklären. Darüber hinaus liefern vorliegende Ergebnisse Anhaltspunkte für weitere pathogenetisch relevante Mechanismen während der Karzinogeneseprogression in den untersuchten Modellen. Dazu gehören unter anderem der wachstumsfördernde Einfluss von überexprimierten Wachstumsfaktoren der ErbB-Familie und lipogenen Mediatoren aber auch die Dysregulation des intrazellulären Signalkaskadennetzwerks und des programmierten Zelltods. Die Alteration derselben zellulären Prozesse im Transplantations- und NNM-Modell bestätigt eine große Übereinstimmung im Verlauf der Karzinogenese in beiden Modellen auf Transkriptionsebene. Insgesamt sind die Alterationen im Stz-Modell stärker ausgeprägt. Sowohl die Anzeichen für mögliche vorübergehende Stz-induzierte Genexpressionsveränderungen in den klarzelligen Präneoplasien als auch Ursache und tatsächliche kausalpathogenetische Bedeutung der hier nachgewiesenen Expressionsveränderungen müssen durch weitere Untersuchungen validiert und gezielter analysiert werden.
Auf den inneren und äußeren Oberflächen des Menschen existieren zahlreiche Mikrohabitate mit limitiertem Sauerstoffangebot. Vor allem während infektiöser Vorgänge kann aufgrund einwandernder Neutrophile die Sauerstoffkonzentration im menschlichen Gewebe auf unter 1% sinken. Eine rasche Anpassung an das vorherrschende Sauerstofflevel und die Nutzung effizienter alternativer Atmungsformen oder des Gärungsstoffwechsels sind deshalb entscheidend für das mikrobielle Überleben im menschlichen Wirt. In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurde die anaerobe Genexpression von Staphylococcus aureus sowie die zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismen näher untersucht. Die sich in vier Teile gliedernde Arbeit befasst sich zunächst mit einer eingehenden Beschreibung der anaeroben Adaptation und Physiologie von S. aureus auf Ebene des Transkriptoms, der Proteinsynthese und des extrazellulären Metaboloms. Die Identifikation eines konservierten Sequenzmotivs (inverted repeat) vor zahlreichen anaerob induzierten Genen war Ausgangspunkt für die Untersuchung der entsprechenden regulatorischen Vorgänge im zweiten Teil dieser Arbeit. Diese führten letztlich in Kooperation mit Arbeitsgruppen aus den USA, Schweden und Deutschland (AG R. Proctor, Universität Wisconsin; AG C. von Wachenfeldt, Universität Lund; AG C. von Eiff, Universität Münster; AG M. Lalk, Universität Greifswald) zu der Identifikation des Rex Proteins (SACOL2035) als zentraler Regulator der anaeroben Genexpression in S. aureus. Neben der Rex-abhängigen Expressionskontrolle wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Friedrich Götz (Universität Tübingen) auch der Einfluss des Zwei-Komponenten¬systems NreBC auf die Genexpression in S. aureus näher untersucht. Auf Ebene des Transkriptoms, Proteoms und Metaboloms konnte so die essentielle Bedeutung des NreBC-Systems für die Expression der dissimilatorischen Nitrat- und Nitritreduktasen in S. aureus nachgewiesen werden. Der dritte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Einordnung des anaeroben Proteinsynthese¬musters (Proteomsignatur) in den Kontext zahlreicher anderer stressinduzierter Proteomsignaturen von S. aureus. Die aus diesem komplexen Vergleich gewonnenen Ergebnisse geben detaillierte Einblicke in die Spezifitäten und Gemeinsam¬keiten der Proteinsynthese von S. aureus als Reaktion auf oxidativen Stress (H2O2, Diamid und Paraquat), nitrosativen Stress (NO), Sauerstofflimitation in An- und Abwesenheit von Nitrat, Hitzestress (48°C) sowie subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen (Puromycin, Mupirocin). Für die Bereitstellung der entsprechenden Daten wurde im Rahmen dieser Arbeit zudem ein mySQL-basiertes System entwickelt, das die Visualisierung der Daten mit komplexen Abfrage- und Filtermöglichkeiten verknüpft (http://www.aureolib.de). Im letzten Teil gibt diese Arbeit schließlich einen Überblick über die Leistungen und Möglichkeiten der Proteomanalyse hinsichtlich physiologischer und infektionsrelevanter Fragestellungen. Besondere Beachtung findet hier die Aufklärung und Struktur des bereits erwähnten Rex Modulons.
WOKW-Ratten entwickeln ein komplettes und ein der humanen Erkrankung ähnliches Metabolisches Syndrom mit Adipositas, Hyperinsulinämie sowie Hyperleptinämie, Dyslipidämie und verminderter Glukosetoleranz. In der vorliegenden Arbeit wurden kongene Ratten durch Kreuzung zwischen kranken WOKW und krankheitsresistenten DA-Ratten generiert, die als DA.3aW (Chr. 3; D3Mgh5-D3Rat1), DA.3bW (Chr. 3; D3Mit10-D3Rat189), DA.5W (Chr. 5; D5Mgh6-D5Mit5), DA.10W (Chr. 10; D10Mgh2-D10Rat4) und DA.16W (Chr. 16; D16Rat88-D16Wox7) bezeichnet wurden. Diese kongenen Stämme wurden zunächst longitudinal hinsichtlich einzelner Faktoren des Metabolischen Syndroms untersucht. Die phänotypische Charakterisierung zeigte, dass die kongenen Ratten Facetten des Metabolischen Syndroms entwickeln und somit Gene in den kongenen WOKW-Bereichen auf den Chromosomen 3, 5, 10 und 16 der Ratte den Adipositas Index, die Körpermasse, die Seruminsulin- und Serumleptinwerte sowie die Serumlipide in Abhängigkeit des Chromosoms und des Geschlechts der Ratten beeinflussen. Zur Identifikation möglicher Kandidatengene wurde die mRNA-Expression einzelner Gene, die innerhalb der kongenen Bereiche liegen, mittels qRT-PCR in Fettgewebe, Leber, Hypothalamus und teilweise auch in der Niere untersucht. Basierend auf der Tatsache, dass DA.3aW phänotypisch besonders von DA abweicht, lag der Fokus der Genexpressionsanalysen auf Genen, die innerhalb des kongenen Bereiches auf dem distalen Chromosom 3 (D3Mgh5-D3Rat1) kartieren. Interessanterweise konnte eine signifikant geringere mRNA-Expression von Pck1 in Leber und Niere von DA.3aW sowie WOKW im Vergleich mit DA nachgewiesen werden. In der daran anknüpfenden Sequenzierung konnte ein SNP in der codierenden Sequenz von Pck1 (4384T/C) dokumentiert werden. WOKW sowie DA.3aW, Ratten die ein komplettes bzw. Facetten des MetS entwickeln, sind Träger des C-Allels. Somit könnte dieser SNP das Risiko an Facetten des MetS zu erkranken, in Ratten beeinflussen. Außerdem konnten Snta1, Pofut1, Dlgap4 und Pltp, die auch in der kongenen Region in DA.3aW liegen, als mögliche Kandidatengene identifiziert werden. Auch die auf dem Chromosom 10 liegenden Gene Acox1, Galr2 und Cygb könnten auf Grund der Expressionsergebnisse in der Entstehung von Hyperleptinämie und Hyperinsulinämie in DA.10W bzw. WOKW involviert sein. Des Weiteren wurde mittels Genexpressionsanalyse festgestellt, dass Gene innerhalb des kongenen Bereiches auf dem Chromosom 5 die Expression von Pparg und Adipoq im Fettgewebe beeinflussen, da die Expression dieser Adipokine in DA.5W-Ratten signifikant erhöht ist im Vergleich mit DA. Außerdem müssen Gene in den kongenen Regionen auf den Chromosomen 5 und 16 für eine veränderte Expression von Fasn, Glut4 und Lpl verantwortlich sein. Zum Schluss konnte ein Zusammenhang zwischen der Anzahl von TTT-Repeats in der 3'UTR von Repin1 und der Proteinmenge nachgewiesen werden. Weicht die Anzahl der TTT-Repeats vom WT-Allel ab, dann ist die Repin1-Konzentration im subkutanen sowie epididymalen Fettgewebe verschiedener Rattenstämme erhöht.
Die at-line Expressionsanalyse von Bioprozess-relevanten Markergenen auf der Grundlage von elektrischen Biochip-Verfahren ist eine viel versprechende Strategie für eine prozessbegleitende Beurteilung der Zellphysiologie des Produktionswirtes. Eine derartige direkte Methode für die Bestimmung des physiologischen Status würde zu einer umfassenderen Überwachung und Kontrolle von industriellen Fermentationsprozessen beitragen. Die Expressionsanalyse der Markergene mit den verwendeten elektrischen Biochips beruht auf dem Nachweis der entsprechenden mRNA über eine Sandwich-Hybridisierung und der elektrochemischen Detektion der Hybride. Hierbei sind sowohl Bead-basierte als auch Array-basierte Formate möglich. Der Bead-basierte mRNA-Nachweis nutzt paramagnetische Partikel (Beads) für die Immobilisierung von Gen-spezifischen Fängersonden. Während der Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den Beads gebunden. Gleichzeitig hybridisiert eine Detektionssonde in einem anderen Bereich der mRNA und ermöglicht so die Markierung mit einem Enzym. Dieses setzt para-Aminophenol (pAP) frei, das an den Elektroden des Biochips über zyklische Oxidations- und Reduktionsprozesse (Redox-Recycling) amperometrisch detektiert wird. Der resultierende elektrische Strom dient als Maß für die mRNA-Menge in der Probe. Die Array-basierte mRNA-Detektion nutzt elektrische Biochips mit 16 individuell auslesbaren Elektrodenpositionen. In diesem Format werden die Fängersonden direkt auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert. Durch die Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den jeweiligen Elektrodenpositionen gebunden. Die Detektion erfolgt positionsspezifisch über das Enzym-kontrollierte Redox-Recycling von pAP. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag vor allem auf der Verkürzung, Optimierung und Automation der Bead-basierten mRNA-Detektion. Durch erste Optimierungen einzelner Protokollschritte der Bead-basierten Sandwich-Hybridisierung konnte eine Verkürzung des Protokolls von ursprünglich 4 h auf unter 3 h erzielt werden. Der Übergang zu einer Sandwich-Hybridisierung in Lösung führte vor allem zu einer verbesserten Handhabbarkeit und Reproduzierbarkeit des Protokolls. Die Neuanordnung der Sondenbindestellen auf der Ziel-mRNA und die Einführung einer zweiten Detektionssonde resultierten in signifikanten Steigerungen der Hybridisierungssignale. Dies ermöglichte eine Verkürzung der Detektionszeit auf ca. 75 min. Durch weitere Optimierungen einzelner Aspekte des Protokolls konnte schließlich eine mRNA-Detektionszeit von ca. 45 min realisiert werden. Somit wurde das Protokoll für die Bead-basierte mRNA-Detektion mit dem elektrischen Biochip, ausgehend von isolierter Gesamt-RNA, von ursprünglich 4 h auf 45 min verkürzt. Gleichzeitig konnte die Sensitivität des Protokolls um das etwa Fünffache gesteigert werden. Die Automatisierung mithilfe eines Pipettierroboters erlaubte eine parallele Bearbeitung und die automatische, sequentielle Detektion von 8 Proben innerhalb von ca. 1 h. Weiterhin wurde die Array-basierte mRNA-Detektion etabliert und teilweise optimiert. Dies ermöglichte eine parallele, elektrochemische Detektion von derzeit 4 verschiedenen mRNAs in einer Probe isolierter Gesamt-RNA innerhalb von 20 min. Allerdings sind vor der automatischen Messung noch zusätzliche Schritte für die manuelle Bearbeitung der RNA-Proben (ca. 25 min) erforderlich. Die Anwendbarkeit der entwickelten Protokolle wurde jeweils am Beispiel von ausgewählten Markergenen des industriell bedeutsamen Wirtes Bacillus licheniformis getestet. Die mithilfe der elektrischen Biochip gemessenen Expressionsprofile der Markergene korrelierten mit den mittels real-time RT-PCR bestimmten mRNA-Mengen. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation die Grundlage für eine Bioprozess-begleitende mRNA-Analytik, basierend auf elektrischen Biochips, geschaffen werden.
Die Duchenne Muskeldystrophie und sein Mausmodell, die mdx-Maus, sind durch eine Kalzium-induzierte Muskelschädigung gekennzeichnet. Der grundlegende Effekt scheint ein erhöhter sarkolemmaler Einstrom von Kalziumionen durch Kationenkanäle zu sein. Um die möglicherweise verantwortlichen Kationenkanäle zu identifizieren, analysierten wir die Expression von 22 Mitgliedern der Transient Rezeptor Potential Kationenkanalfamilie sowie 8 Mitglieder der DEG/ENaC-Familie. Von den TRP-Transkripten waren TRPC3, TRPC6, TRPV4, TRPM4 und TRPM7 die am stärksten exprimierten Isoformen im Skelettmuskel. Die mRNAs der Mitglieder der DEG/ENaC Familie wurden im Skelettmuskel nur auf geringfügigem Level nachgewiesen. Im Vergleich zu Kontrolltieren waren die Expressionen der dominierenden TRP-Kanäle in mdx-Muskeln durchschnittlich reduziert, besonders TRPC6 und TRPM7. TRPC5, TRPM1 und TRPA1 waren im Skelettmuskel nur gering exprimiert, aber ihre Expressionen waren im mdx-Muskel signifikant erhöht. Die in-situ Hybridisierung und Immunfluoreszensfärbung von Muskelquerschnitten zeigte die Expression der mRNA und des Proteins von den dominerenden TRPs im Sarkolemm von Muskelfasern. Für TRPC6 wurde dieses Bild deutlich beobachtet. Zwei andere Proteine, nämlich TRPV4 und TRPM7, zeigten vorzugsweise eine perinukleäre Lokalisation, während das Sarkolemm nur schwach gefärbt war. TRPC3 wurde begrenzt in der Nähe des Sarkolemms gefunden, während es in den regenerierenden Muskelfasern der mdx-Muskeln nur in zytoplasmatischen Spots detektiert wurde. Daraus schlussfolgern wir, dass möglicherweise TRP-Ionenkanäle für den beobachteten Ruhekalziumeinstrom in mdx-Muskelfasern verantwortlich sind. Eine veränderte Expression der Isoformen wirkt möglicherweise am dystrophischen Prozess in mdx-Muskelfaser mit.
