Staphylococcus (S.) aureus nimmt dem Menschen gegenĂŒber eine ambivalente Rolle ein, da er zum einen hĂ€ufiger Kommensale ist, aber auch zum Pathogen werden kann. Zu den bedeutendsten Gegnern von S. aureus zĂ€hlen die neutrophilen Granulozyten. Sie haben eine kurze Lebensspanne und weisen hochspezialisierte Zelltodstrategien, wie Apoptose oder NETose auf. AuffĂ€lligerweise besitzen S. aureus-Isolate, die Furunkulose auslösen, ĂŒberproportional hĂ€ufig das Gen fĂŒr das Panton-Valentine-Leukozidin (PVL), welches hochspezifisch humane neutrophile Granulozyten lysiert. Zu den Interaktionen zwischen S. aureus und Neutrophilen sind noch viele Fragen ungeklĂ€rt. Die Ziele dieser Arbeit waren deshalb (1) die Charakterisierung der Wirkung von S. aureus auf das Zelltodverhalten von Neutrophilen und (2) der Vergleich dieser Mechanismen bei kommensalen S. aureus-Isolaten und Isolaten von Patienten mit chronisch rekurrenter Furunkulose. Dazu wurde der Zelltod von Neutrophilen mit einem DNA-Freisetzungstest (Sytox-Assay) und mittels ImmunfluoreszenzfĂ€rbung analysiert. AuffĂ€llig waren dabei folgende Beobachtungen: (1) Hohe Konzentrationen der S. aureus-KulturĂŒberstĂ€nde fĂŒhrten zur Nekrose der Neutrophilen. In sublytischen Konzentrationen bewirkten ĂberstĂ€nde der stationĂ€ren Wachstumsphase dagegen eine Verzögerung der natĂŒrlichen Apoptose der Neutrophilen in Kultur, deren FĂ€higkeit zur proinflammatorischen Aktivierung dabei erhalten blieb. Es ist vorstellbar, dass sich S. aureus, von dem inzwischen bekannt wurde, dass er auch intrazellulĂ€r persistieren kann, auf diese Weise in den Neutrophilen eine Ăberlebensnische schafft. Bei Stimulation mit lebenden Bakterienzellen konnten konzentrationsabhĂ€ngig Nekrose, Apoptose und geringfĂŒgig NETose der Neutrophilen beobachtet werden. (2) Der Vergleich von S. aureus-Isolaten aus nasaler Besiedlung und Furunkuloseinfektion zeigte, dass bakterielle ĂberstĂ€nde von Furunkulose-Isolaten, die die PVL-kodierenden Gene besaĂen, eine deutlich stĂ€rkere Lyse der Neutrophilen verursachten. Dieser Effekt war nur dann zu beobachten, wenn die Bakterien tatsĂ€chlich PVL bildeten, wozu sie nur in besonders reichhaltigen Medien in der Lage waren. Dies ist ein starker Hinweis darauf, dass der Zelltod durch PVL verursacht wurde. Mit lebenden Bakterien konnten zwischen beiden Gruppen keine Unterschiede in der Zelltodinduktion der Neutrophilen festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass S. aureus neutrophile Granulozyten auf verschiedene Weise beeinflussen kann: Neben der Induktion von Zelltod können die Bakterien auch Substanzen freisetzen, die die Lebensspanne der Abwehrzellen verlĂ€ngern. AuĂerdem stĂŒtzen die Befunde das Konzept einer zentralen Rolle fĂŒr PVL bei Haut- und Weichteilinfektionen durch S. aureus, das bisher vor allem auf epidemiologischen Befunden basierte.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung eines neu entdeckten Renintranskriptes fĂŒr das Ăberleben kardialer Zellen nach IschĂ€mie-relevanten Bedingungen wie der Glukosedepletion, Anoxie sowie Blockierung der Atmungskette mit Rotenon untersucht. Dabei zeigte sich durch Ăberexpression des zytosolischen Renins eine verbesserte Toleranz der H9c2-Zellen gegenĂŒber den Stressfaktoren, da deren Ăberexpression sich protektiv auf den ATP-Gehalt und den Zelltod auswirkte. Seit der nach vorangegangenem Myokardinfarkt beobachteten selektiven Hochregulierung eines 1999 neuentdeckten alternativen Renintranskriptes, des Exon(1A-9)Renin-Transkriptes, vermutet man seine Funktion im Rahmen ischĂ€mischer Prozesse am Herzen. Das Exon(1A-9)Renin stellt dabei ein verkĂŒrztes Transkript dar, das ein nicht-sekretorisches, zytosolisches Protein kodiert. Weitergehende Untersuchungen in vitro weisen auf eine kardioprotektive Funktion des alternativen Renintranskriptes hin. Ferner belegen ex-vivo-Untersuchungen eine signifikant reduzierte InfarktgröĂe von Herzen transgener Exon(2 9)Renin-ĂŒberexprimierten Ratten im Vergleich zu den Kontrolltieren. Die zentrale Hypothese der vorliegenden Arbeit war, dass die Hochregulation des alternativen Exon(1A 9)Renin-Transkriptes mit einer protektiven Funktion des entstehenden Renins assoziiert ist. So konnte zunĂ€chst molekularbiologisch eine 5 fach zur Basalbedingung erhöhte Expression des Exon(1A 9)Renin-Transkriptes unter IschĂ€mie-relevanten Faktoren wie der 24-stĂŒndigen Hypoxie und Glukosedepletion nachgewiesen werden. Des Weiteren erwiesen die H9c2-Zellen durch Ăberexpression des zytosolischen Renins eine verbesserte Toleranz gegenĂŒber IschĂ€mie-relevanten Bedingungen, denn es zeigte sich eine Aufrechterhaltung des ATP-Gehaltes sowie eine Reduktion des Zellunterganges unter den Stressbedingungen. Dabei konnte vor allem der nekrotische Zelltod verhindert werden, der bekanntlich mit einer EntzĂŒndungsreaktion einhergeht und erhebliche Konsequenzen fĂŒr das folgende Remodelling des Gewebes aufweist. Ferner konnte eine schĂŒtzende Funktion des zytosolischen Renins im Rahmen des oxidativen Bursts detektiert werden, da ein Anstieg der zytosolisch lokalisierten ROS, der unter Glukosedepletion und Anoxie nachweisbar war, durch die Ăberexpression des Renins verhindert werden konnte. Die Arbeit weist nach, dass das zytosolische Renin im Gegensatz zum sekretorischen Renin bei Glukosemangel, Hypoxie und oxidativen Stress weiterreichende protektive Wirkungen hat, die möglicherweise zukĂŒnftig in der Therapie des Herzinfarktes und Herzinsuffienz ausgenutzt werden könnten.
Bei dem gramnegativen Pathogen Burkholderia pseudomallei, auch bekannt als Erreger der âMelioidoseâ, handelt es sich um einen saprophytischen Bodenbewohner, der in den tropischen und subtropischen Regionen SĂŒdostasiens und Nordaustraliens endemisch verbreitet ist. Als fakultativ intrazellulĂ€rer Erreger ist B. pseudomallei neben einer Vielzahl nicht phagozytierender Zellen auch in professionellen Phagozyten zur Replikation fĂ€hig. In Makrophagen sind cytosolische NOD-like Rezeptoren (NLR) als Bestandteil der angeborenen Immunabwehr maĂgeblich an der Erkennung intrazellulĂ€rer Gefahrensignale beteiligt. Bei entsprechender Signalgebung wird durch Assemblierung eines als âInflammasomâ bezeichneten Multiproteinkomplexes die Rekrutierung und nachfolgende Autoaktivierung von Caspase-1 bewirkt. Nach Infektion mit B. pseudomallei geht die Aktivierung von Caspase-1 in Verbindung mit dem NOD-like Rezeptor Nlrp3 mit der Prozessierung und Sekretion der Cytokine IL-1ÎČ und IL-18 einher, wohingegen der Sensor Nlrc4 in erster Linie fĂŒr die Induktion einer inflammatorischen Form des Zelltodes namens âPyroptoseâ verantwortlich ist. Da der Knockout von Caspase-1 bei muriner Melioidose einen signifikanten Anstieg der MortalitĂ€tsrate nach sich zieht, sollten in der vorliegenden Arbeit Caspase-1-vermittelte Effektormechanismen gegenĂŒber B. pseudomallei nĂ€her untersucht werden. Infolge der Infektion muriner C57BL/6 Makrophagen mit B. pseudomallei wurde bereits 60 Minuten post infectionem eine Caspase-1 und -9-abhĂ€ngige Prozessierung von Caspase-7 sowie des DNA-Reparaturenzyms PARP deutlich. Als verantwortlicher Sensor ist hierbei der NOD-like Rezeptor Nlrc4 identifiziert worden. Obwohl in Caspase-1/11 knockout Makrophagen wĂ€hrend der FrĂŒhphase der Infektion keine Spaltprodukte der drei genannten Caspasen vertreten waren, konnte zu spĂ€teren Zeitpunkten eine massive Aktivierung der apoptotischen Caspasen-8, -9, -3 und -7 sowie der Stress-induzierten MAP-Kinasen JNK und p38 beobachtet werden. Vergleichende Proteomanalysen B. pseudomallei-infizierter C57BL/6 Makrophagen lieĂen ebenfalls eine verstĂ€rkte Expression proapoptotischer und proinflammatorischer SignalmolekĂŒle in Caspasen-1/11-defizienten Makrophagen erkennen. Im Gegensatz dazu wies der Knockout von Caspase-7 nach Infektion mit B. pseudomallei weder in vitro noch in vivo einen charakteristischen PhĂ€notyp auf. Im Vergleich zu B. pseudomallei konnte durch die Infektion mit der avirulenten Spezies Burkholderia thailandensis erst bei verhĂ€ltnismĂ€Ăig hohen Infektionsdosen eine sichtbare Prozessierung der Caspasen-1, -9 und -7 in C57BL/6 Makrophagen erreicht werden. DarĂŒber hinaus wurde trotz einem mit B. pseudomallei vergleichbaren Replikationsvermögen, ein geringeres MaĂ an Pyroptose in B. thailandensis - infizierten Makrophagen nachgewiesen. Zur Identifizierung, welche bakteriellen Komponenten von B. pseudomallei fĂŒr die Aktivierung von Caspase-1 verantwortlich sind, wurden zwei Deletionsmutanten der Bsa T3SS-Proteine BopE und BsaK hergestellt. Dem Bsa T3SS konnte in vorausgehenden Studien eine wesentliche Funktion fĂŒr die Virulenz von B. pseudomallei im Tiermodell zugeschrieben werden und dessen Bestandteile weisen Homologien zu den Inv/Mxi-Spa-Sekretionssystemen von S. typhimurium und S. flexneri auf. Die Aktivierung der Caspasen-1, -9 und -7 sowie die Spaltung von PARP wurde durch die Infektion muriner Makrophagen mit der Mutante des âinner rod proteinsâ BsaK vollstĂ€ndig aufgehoben, wohingegen die Mutagenese des Effektors BopE keinen Einfluss ausĂŒbte. Neben einer verminderten Freisetzung von LDH und IL-1ÎČ konnte dabei auch ein Anstieg der intrazellulĂ€ren Keimzahl in ÎBsaK-infizierten Makrophagen verzeichnet werden. DemgegenĂŒber fĂŒhrte die Verwendung einer Flagellin-Transposonmutante lediglich zu einer Reduktion der B. pseudomallei-induzierten Prozessierung der Caspase-1, -9 und -7 sowie der Spaltung von PARP. Mittels Ăberexpressionsstudien in HEK-293 Zellen konnte ferner die potentielle FĂ€higkeit des Bsa T3SS-Effektors BopE zur Aktivierung von Caspase-1 in AbhĂ€ngigkeit von der FunktionalitĂ€t der BopE-eigenen GEF-DomĂ€ne demonstriert werden. In verschiedenen in vivo Experimenten wurde gezeigt, dass ÎBsaK-infizierte BALB/c MĂ€use im Vergleich zum Wildtyp und in Verbindung mit geringen Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz durch eine signifikant verminderte MortalitĂ€tsrate sowie eine Reduktion proinflammatorischer Mediatoren gekennzeichnet sind. Insgesamt betrachtet zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass BsaK, als strukturelle Komponente des Bsa Typ-III-Sekretionsapparates, in murinen Makrophagen sowohl fĂŒr die B. pseudomallei-induzierte Aktivierung der Caspasen-1, -9 und -7 durch das Nlrc4-Inflammasom als auch den nachfolgenden pyroptotischen Zelltod verantwortlich ist. Durch die Attenuierung der BsaK-Mutante im Mausmodell wird gleichzeitig die Bedeutung von Typ-III-Sekretionssystemen fĂŒr die Virulenz pathogener Bakterien unterstrichen.
Histondeacetylase-Inhibitoren (HDIs) bilden eine Gruppe relativ neuer vielversprechender anti-neoplastischer Wirkstoffe. Sie hemmen die Funktion der Histondeacetylasen und greifen somit in die Regulation der genomweiten Transkription ein. HDIs besitzen direkte tumortoxische Wirkung, lassen nicht transformierte Zellen jedoch weitgehend unbeeinfluĂt. DarĂŒber hinaus verstĂ€rken sie die zytotoxischen AktivitĂ€ten einer Vielzahl anderer Tumortherapeutika und sensibilisieren Tumorzellen fĂŒr die zytolytischen Effekte aktivierter NK-Zellen. Die Einbindung des Immunsystems in die Tumortherapie wirft jedoch die Frage nach einer direkten, möglicherweise hemmenden Wirkung der HDIs auf Immunzellen auf. In dieser Arbeit wurde untersucht, welcher Mechanismus dem Synergismus von HDIs und aktivierten NK-Zellen zugrunde liegt, ob HDIs Tumorzellen auch fĂŒr die zytolytischen Effekte tumorspezifischer T-Zellen sensibilisieren und welche direkte Wirkung HDIs auf Immunzellen ausĂŒben. Alle Arbeiten wurden in vitro mit humanen Zellen/Zellinien durchgefĂŒhrt. Als HDIs kamen Suberoylanilid-HydroxamsĂ€ure (SAHA) und Natriumbutyrat (NaB) zum Einsatz. Aufbauend auf ein bereits etabliertes in-vitro-Testsystem, wurde gezeigt, daĂ nach IL-2-Aktivierung von PBMCs im wesentlichen NK-Zellen Tumorzelltod induzierten. Dabei war die FunktionsfĂ€higkeit der aktivierenden NK-Rezeptoren NKG2D, DNAM-1 und der NCRs kritisch fĂŒr Erkennung und Lyse der Tumorzellen, wie der Einsatz blockierender Antikörper deutlich machte. Sowohl bei unbehandelten als auch bei HDI-behandelten Tumorzellen fĂŒhrte die Maskierung all dieser Rezeptoren zu einer vollstĂ€ndigen Inhibition der Tumorzellyse, d.h. die Induktion alternativer aktivierender NK-Liganden durch HDIs wurde ausgeschlossen. Wurden nur ein oder zwei aktivierende Rezeptoren maskiert, ergab sich hingegen ein Unterschied zwischen unbehandelten und HDI-behandelten Tumorzellen: Der protektive Effekt der Maskierung fiel bei HDI-behandelten Tumorzellen deutlich geringer aus. HDIs erhöhen also die Redundanz der schon zuvor involvierten aktivierenden NK-Rezeptoren. OberflĂ€chenfĂ€rbungen legten nahe, daĂ diese Redundanzerhöhung â und somit die Sensibilisierung der Tumorzellen â auf die HDI-induzierte Heraufregulation aktivierender NK-Liganden auf Tumorzellen zurĂŒckzufĂŒhren ist. Ein EinfluĂ der HDIs auf die Expression der Todesrezeptoren Fas, DR4 und DR5 wurde ausgeschlossen. Um die Untersuchungen auf das Zusammenwirken von HDIs und zytotoxischen T-Zellen auszuweiten, wurde ein Primingsystem zur Generation tumorspezifischer T-Effektorzellen etabliert. Allogene Spender-T-Zellen wurden mit Hilfe CD86-transfizierter Zellen der Melanomzellinie SkMel63 geprimt, d.h. in diesem System dienten Alloantigene als Ersatz fĂŒr Tumorantigene. Starke T-Zellproliferation und die Sekretion T-Zell-spezifischer Zytokine zeigten ein erfolgreiches Primen der T-Zellen an. Geprimte tumorspezifische T Zellen lysierten Wildtyp-SkMel63-Zellen effektiv ohne die Notwendigkeit eines Ko-Stimulus. Die Vorbehandlung mit SAHA sensibilisierte die SkMel63-Zellen fĂŒr die Zelltodinduktion durch T-Zellen. Eine mögliche Ursache fĂŒr den Synergismus könnte auch hier die verstĂ€rkte Expression der NKG2D-Liganden sein, da NKG2D auf T-Zellen als ko-stimulierender Rezeptor fungiert. Da funktionsfĂ€hige Immunzellen eine Voraussetzung fĂŒr die beschriebenen sensibilisierenden HDI-Effekte sind, wurde auch die direkte Wirkung der HDIs auf NK- und T-Zellen untersucht. Tumortoxische Konzentrationen von SAHA verhinderten ihre aktivierungsinduzierte Proliferation und Zytokinsekretion, beeintrĂ€chtigten die CD107a-Mobilisierung und hemmten die zytolytische AktivitĂ€t der Immunzellen. Diese Beobachtungen spiegeln zwei PhĂ€nomene wider: Erstens ĂŒbt SAHA eine zytotoxische Wirkung auf die Immunzellen aus, und zweitens inhibiert SAHA die IL-2-Aktivierung von NK-Zellen sowie das Primen tumorspezifischer T-Zellen. In starkem Gegensatz dazu wurden NK- und T-Zellen, die in Abwesenheit von HDIs aktiviert wurden, resistent gegen deren zytotoxische und immunsuppressive Wirkung und zeigten spĂ€ter â auch in Anwesenheit hoher HDI-Konzentrationen â normale zytolytische AktivitĂ€t. Die SensibilitĂ€t von NK- und T-Zellen fĂŒr suppressive HDI-Effekte hĂ€ngt also von ihrem Aktivierungszustand ab, und nur vollstĂ€ndig aktivierte Immunzellen sind resistent gegen HDIs. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen ein groĂes therapeutisches Potential der Kombination von HDIs und immunstimulierender Behandlung auf. Als eine vielversprechende therapeutische Strategie erscheint daher ein sequentieller Ansatz, bestehend aus der Immunstimulation der Tumorpatienten gefolgt von der HDI-vermittelten Sensibilisierung der Tumorzellen fĂŒr die Angriffe des patienteneigenen Immunsystems.
Soja gehört aufgrund seines hohen Proteingehaltes seit Jahrtausenden zu den Grundnahrungsmitteln des Menschen. Daneben wird Soja sowohl in Europa als auch in Asien als ErgĂ€nzungsfutter in der TierernĂ€hrung verwendet. Die enthaltenen Isoflavone verursachen in vivo möglicherweise positive, systemische Effekte, was aus erhöhten Geburtsgewichten sowie dem verbesserten postnatalen Wachstum von Ferkeln abgeleitet wurde. In weiteren Studien, in denen nach FĂŒtterung im Blut der Tiere eine Daidzeinmenge von ca. 1 ”mol/l zirkulierte, wurde das Wachstum der Ferkel nicht beeinflusst. Ferner zeigten die Isoflavone Genistein und Daidzein in vitro hĂ€ufig ambivalente Effekte auf das Wachstum von Maus oder Ratte abgeleiteten Muskelzellkulturen in AbhĂ€ngigkeit von der Dosis und Einwirkzeit. Die direkte Wirkung der Isoflavone auf das Wachstum und die Differenzierung von Skelettmuskelzellen wurde bisher fĂŒr das Hausschwein nicht untersucht, obgleich es ĂŒber sojahaltiges Futter einer kontinuierlichen Zufuhr von Isoflavonen ausgesetzt und eine Beeinflussung des Wachstums aufgrund der zuvor genannten Studien denkbar ist. Zudem wurde bisher die Expression der Ăstrogenrezeptoren, als mögliche Bindungsorte fĂŒr Isoflavone, weder auf Protein- noch auf mRNA-Ebene im Skelettmuskel des Schweins beschrieben. Die vorliegende Arbeit verfolgte daher das Ziel, ein in vitro-Modell in Form einer Satellitenzellkultur aus dem M. semimembranosus fĂŒr die Untersuchung des Muskelwachstums beim Hausschwein zu etablieren. Erstmals sollte daran die direkte Wirkung der Isoflavone Genistein und Daidzein in physiologischen sowie nicht-physiologischen Konzentrationen auf Basisprozesse des exponentiellen Wachstums und der Differenzierung unter BerĂŒcksichtigung möglicher wachstumsfaktorvermittelter RegulationsÂŹmechanismen beschrieben werden. Die Isoflavonwirkung auf die DNA-Synthese der Muskelzellen wurde im Vergleich mit den Ăstrogenen 17beta-Ăstradiol und Ăstron sowie in weiteren Versuchen in Kombination mit den Wachstumsfaktoren IGF-I und EGF betrachtet. FĂŒr die Bestimmung der EinflĂŒsse von Genistein und Daidzein auf die Proliferation porciner Skelettmuskelzellen wurden die DNA-Syntheserate, der Zellzyklus, Zelltod sowie DNA-SchĂ€den und deren Reparatur nach Entzug der Isoflavone gemessen. Um den Einfluss der genutzten Isoflavone und 17beta-Ăstradiol auf die Differenzierung der Skelettmuskelzellen zu untersuchen, erfolgte die Bestimmung des Fusionsgrades sowie die Messung der Creatinkinase-AktivitĂ€t. ZusĂ€tzlich wurde der Proteinmetabolismus als Einbau bzw. Freisetzung von [3H]-Phenylalanin betrachtet. Ferner erfolgte die Untersuchung der Expression der Ăstrogen- und Tyrosinkinaserezeptoren, EGF-R und IGF-1R, mithilfe der RT-PCR, des Immunoblots und der Immunhistochemie wĂ€hrend der Proliferations- und/oder der Differenzierungsphase. Aus dem porcinen M. semimembranosus wurde erfolgreich ein Satellitenzellpool etabliert und erstmals die Expression der Ăstrogenrezeptoren alpha und beta im porcinen Skelettmuskel und dem davon abgeleiteten Zellpool gezeigt. Die Ergebnisse lassen weiterhin negative Wirkungen der getesteten Isoflavone auf das Muskelzellwachstum in Ferkeln vor allem ab zirkulierenden Serumkonzentrationen von > 1 ”mol/l, jedoch keine Effekte der Ăstrogene auf die Zellproliferation erwarten. IGF-I und EGF erwiesen sich als wirkungsvolle Stimulatoren des porcinen Muskelzellwachstums, was fĂŒr EGF in der Zellkultur mit serum- und wachstumsfaktorfreiem Medium erstmals gezeigt wurde. DarĂŒber hinaus wirken IGF-I und EGF scheinbar den toxischen Effekten hoher Isoflavondosen entgegen. Dennoch erniedrigte Genistein (100 ”mol/l) deutlich die wachstumsfaktorvermittelte DNA-Synthese in porcinen Satellitenzellkulturen. Interessanterweise war unter dem Einfluss nahrungstypischer Daidzeinkonzentrationen (1 und 10 ”mol/l) in Kombination mit IGF-I eine signifikante Erhöhung der Zellzahl zu beobachten. In der differenzierenden porcinen Muskelzellkultur verringerten sowohl Ăstrogene als auch Isoflavone dosisabhĂ€ngig die Proteinabbaurate. Obgleich Ăstrogene allgemein beim Schwein nicht als Förderer des Muskelwachstums gelten, haben Ăstrogene und nahrungstypische Isoflavonkonzentrationen das Potential, den ProteinÂŹmetabolismus des porcinen Skelettmuskels zu beeinflussen. Auf der anderen Seite fĂŒhrten hohe Isoflavonkonzentrationen (20; 100 ”mol/l) zu einer Abnahme der Proteinmenge und wirkten als Toxine auf die differenzierenden Skelettmuskelzellen. Da das Schwein eine dem Menschen Ă€hnliche Physiologie und einen fĂŒr die Isoflavone vergleichbaren Metabolismus besitzt, sind die Ergebnisse dieser Arbeit nicht nur fĂŒr die TierernĂ€hrung bedeutsam, sondern ebenso fĂŒr die Beurteilung der Auswirkungen sojabasierter Babynahrung auf Entwicklungsprozesse beim menschlichen Neugeborenen, was in zukĂŒnftigen Untersuchungen zu den Wirkungen der Sojaisoflavone berĂŒcksichtigt werden sollte.
