This thesis is about the establishment and the application of novel methods and tools that are re-lated to the most widely used enzyme class: hydrolases. It covers all fields from the identification to the application of these valuable enzymes with particular focus on lactonases, acylases and proteases. The activity assay introduced in Article I substantially extends the method toolbox for studies on lactonases and acylases that interfere with the bacterial cell-cell communication system. Article II describes a fully automatized robotic platform that represents the next-level tool for the high-throughput enzyme screening in the microtiter plate format. It was used, for instance, for the screening for improved porcine aminoacylase I variants. Diverse aspects of the protease-mediated hydrolysis of non-resistant proteins for the purification of resistant target proteins are highlighted in Article III.
Das Robert Koch-Institut (RKI) empfiehlt die Durchführung einer ärztlichen Risikoanalyse für das Vorliegen einer bestehenden MRSA-Kolonisation und -Infektion, um zu entscheiden, welche Patienten in ein MRSA-Aufnahmescreening einzuschließen sind. Nach einem MRSA-Ausbruch im Mai/Juni 2006 in der Klinik für Hautkrankheiten der Universitätsmedizin Greifswald wurde in Anlehnung an die „Search and destroy“-Strategie der Niederlande ein PCR-basiertes generelles MRSA-Screening eingeführt. Alle stationär aufzunehmenden Patienten erhielten sowohl 14 Tage vor der Aufnahme als auch am Aufnahmetag einen MRSA-Abstrich, wobei die Proben aus beiden Nasenvorhöfen und von sichtbaren Erkrankungen der Haut sowie Wunden entnommen wurden. Nach Einleitung der Maßnahmen konnte ein Rückgang der Prävalenz von 14.7 % (Mai/Juni 2006) auf 1.6 % (Juli 2006-Dezember 2010) sowie der Inzidenzdichte von 19.4 (Mai/Juni 2006) auf 1.8 (Juli 2006-Dezember 2010) nachgewiesen werden. MRSA-Transmissionen traten nicht auf. Die vorliegenden Daten der Klinik für Hautkrankheiten der Universitätsmedizin Greifswald zeigen, dass dermatologische Einrichtungen ohne intensivmedizinische Betreuung, jedoch mit hohem Anteil von Patienten mit chronischen Erkrankungen (z. B. chronische Wunden, Diabetes mellitus) ähnlich hohe MRSA-Raten wie anerkannte Hochrisikostationen (u.a. Intensivstationen) erreichen können. Dementsprechend muss auch in dermatologischen Einrichtungen mit relevanten Transmissionsraten gerechnet werden, sodass dermatologische Abteilungen als MRSA-Risikostationen anerkannt werden sollten. Im Rahmen des MRSA-Screenings sollten nach Empfehlungen des Robert Koch-Institutes definierte Prädilektionsstellen (mindestens beide vorderen Nasenvorhöfe, Rachen, Wunden; ggf. Perineum und Leiste) für eine MRSA-Kolonisation untersucht werden. Unter Berücksichtigung der analysierten Daten wird für dermatologische Einrichtungen eine Dreifachkombination von Nase, vorhandenen Wunden und Hautläsionen (u.a. Ekzem, Psoriasis) für die MRSA-Surveillance empfohlen. Die zusätzliche Entnahme von Proben aus dem Rachen kann gemäß der RKI-Empfehlungen zu einer höheren Sensitivität des MRSA-Nachweises führen. Aus den erhobenen Daten kann kein eindeutiger Vorteil durch die zusätzliche Entnahme von Proben aus dem Rachen abgeleitet werden, wobei die Zahlen für eine Verallgemeinerung zu gering sind. Basis des MRSA-Nachweises ist laut RKI-Vorgaben ein kultureller Nachweis, bei dem zusätzliche Charakteristika (Identifizierung, Empfindlichkeitstestung, Testung Virulenzfaktoren) erhoben werden können. Neben dem kulturellen Nachweis (24-48 Stunden) ist es möglich eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu einem schnelleren MRSA-Nachweis einzusetzen (nicht zum Nachweis von MRSA-Infektionen, nicht zur Kontrolle eines Sanierungserfolges). Wie die vorliegenden Daten zeigen, kann ein PCR-gestütztes generelles Aufnahmescreening in Kombination mit einem prästationären Screening eine MRSA-Transmission in einer Dermatologie zuverlässig verhindern. Neben dieser Strategie mit Modellcharakter ist zusätzlich eine funktionierende Basishygiene in allen beteiligten Bereichen wichtige Voraussetzung für die Vermeidung von MRSA-Transmissionen. Goldstandard in der MRSA-Diagnostik war auch in der Greifswalder Dermatologie der kulturelle MRSA-Nachweis, wobei im Gegensatz zu den RKI-Vorgaben eine 72-stündige Bebrütungszeit empfohlen wird. 12 % nicht detektierte MRSA-Träger sollten bei der MRSA-Surveillance insbesondere für die Transmission und für eine potentielle Infektionsquelle in dermatologischen Einrichtungen nicht toleriert werden. Derzeit werden weiterhin alle stationären Patienten in der Klinik und Poliklinik für Hautkrankheiten der Universitätsmedizin Greifswald auf MRSA gescreent. Dabei wurde das prästationäre Zeitfenster auf 8 Wochen erweitert. Patienten, die innerhalb der letzten 8 Wochen vor Aufnahme einen negativen MRSA-Befund nachweisen können, werden am Aufnahmetag nicht erneut gescreent. In der Klinik und Poliklinik für Hautkrankheiten der Universitätsmedizin Greifswald traten weiterhin keine Transmissionen auf. Die MRSA-Prävalenz betrug im Durchschnitt 1 % (2011 0.76 %, 2012 0.69 %, 2013 1.58 %, 2014 1.06 %). Das Beibehalten eines modifizierten generellen Aufnahmescreenings erfolgt, da MRSA auch bei Patienten ohne klassische Risikofaktoren (n = 21, 35 % der MRSA-Patienten) nachgewiesen werden konnte.
Im Rahmen der Karlsburger Typ-1-Diabetes-Risikostudie wurden 11.986 Schulkinder in einem kombinierten Screening auf die diabetes-assoziierten Autoantikörper (AAk) GADA, IAA und IA-2A mittels Radioliganden-Bindungsassays untersucht, AAk-positive Probanden HLA-DQB1 genotypisiert und hinsichtlich der Entwicklung eines Typ-1-Diabetes mellitus (T1DM) über fast 20 Jahre beobachtet. Die vorliegende Untersuchung zeigt, dass ein Screening auf diese biochemisch definierten AAk das T1DM-Risiko in der Allgemeinbevölkerung ebenso gut differenzieren kann, wie dies bereits in anderen Studien bei Probanden mit einer genetischen Prädisposition beschrieben wurde. Die starke positive Assoziation der AAk mit immungenetischen diabetes-assoziierten Risikomarkern (HLA-DQB1*0302 und/oder *02) konnte in der vorliegenden Studie auch für die Allgemeinbevölkerung bestätigt werden. Positivität für multiple diabetes-assoziierte AAk hatte das größte kumulative T1DM-Risiko und ist vergleichbar mit Ergebnissen von Studien bei erstgradigen Verwandten. Die Ergebnisse konnten außerdem zeigen, dass Studien, welche Probanden aufgrund genetischer Vorselektion rekrutierten, eine substantielle Anzahl der im Rahmen der Karlsburger Typ-1-Diabetes-Risikostudie manifestierten Kinder übersehen hätten. Diabetes-assoziierte HLA-DQB1-Allele hatten zwar eine hohe Sensitivität, aber nur eine geringe Spezifität zur Identifizierung von späteren Diabetikern in dieser Kohorte. Das AAk-Screening mit Nachweis von multipler AAk-Positivität war somit mit hoher Sensitivität und Spezifität zur Identifizierung von Diabetikern der Analyse der HLA-DQB1-Risikoallele bei AAk-positiven Probanden überlegen. Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass ein kombiniertes Populationsscreening auf die diabetes-assoziierten Autoantikörper geeignet ist, um Probanden aus der Allgemeinbevölkerung mit höchstem T1DM-Risiko für Präventionsprogramme zu identifizieren. Dies könnte, sobald sichere und effektive Strategien zur Prävention des T1DM zur Verfügung stehen, zum Beispiel im Rahmen der gesetzlichen Vorsorgeuntersuchungen im Kleinkindalter flächendeckend realisiert werden.
