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Bei der Prüfung mikrobiozider Wirkstoffe im quantitativen Suspensionsversuch muss die sog. Nachwirkung von in die Subkultur verschleppten Wirkstoffspuren ausgeschaltet werden, weil andernfalls eine zu hohe Wirksamkeit vorgetäuscht wird. Deshalb wurde die Neutralisierung der oberflächenaktiven kationischen Antiseptika Chlorhexidindigluconat, Octenidindihydrochlorid und Polyhexamethylenbiguanidinhydrochlorid durch Lipofundin MCT 20 % bei Einsatz von E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, E. hirae und C. albicans gemäß DIN EN 13727 untersucht. Zu 8 Volumenanteilen Inaktivator (Lipofundin) wurden zunächst 1 Volumenanteil Wirkstofflösung hinzugefügt. Nach 5 min Kontakt bei Raumtemperatur wurde dann die Mischung mit 1 Volumenanteil Prüfmikroorganismen mit einer Dichte von 104 KbE/ml versetzt, gründlich gemischt und anschließend die vorhandenen KbE quantifiziert. Um die Neutralisierungskapazität von Lipofundin genauer zu bestimmen, wurde abweichend von der Empfehlung der Norm, wonach die KbE-Anzahl nach Neutralisierung unter der Hälfte der KbE-Anzahl in der Kontrolle betragen muss, als Maßstab ein fehlender signifikanter Unterschied zwischen beiden Ansätzen zugrunde gelegt. Die Ergebnisse zeigen, dass CHX, OCT und PHMB durch die Bindung an die Phospholipidschicht des Lipofundins konzentrationsabhängig neutralisiert wurden, was zu einem Weiterwachstum von E. coli, S. aureus, E. hirae, P. aeruginosa und C. albicans geführt hat. Damit erwies sich Lipofundin als effektiver Neutralisator. Im Vergleich zu CHX und OCT war der Konzentrationsbereich für die Neutralisierung bei PHMB allerdings kleiner. Daraus lässt sich umgekehrt ableiten, dass PHMB in Gegenwart von Phosphatidylcholin weniger an mikrobiozider Wirkung einbüßt als OCT und CHX, was für die antiseptische Anwendung vorteilhaft sein könnte.
Durch in vitro-Studien konnte gezeigt werden, dass Polihexanid im Vergleich zu anderen bekannten antimikrobiellen Wirkstoffen sowie in Anwesenheit anwendungsnah simulierter organischer Belastungen ein für die Wundantisepsis geeigneter Wirkstoff ist. Im Kontext mit den bekannten Daten zur Verträglichkeit zumindest im Bereich der medizinischen Anwendungskonzentrationen (0,02 % und 0,04 % Polihexanid) und zum Einfluss auf die Wundheilung stützen die hier erhobenen Daten die bestehende Konsensusempfehlung zur Wundantiseptik, nach der Polihexanid zwar auch zur akuten Wundantiseptik, insbesondere aber zur Behandlung chronischer Wunden als geeignet angesehen wird. Auf Basis der biochemischen und biopysikalischen Grundlagen der Wirksamkeit von Polihexanid wurde die Möglichkeit der weiteren Verminderung der Zytotoxizität des Polihexanids bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der bakteriziden Wirksamkeit durch die Bindung an Phosphatidylcholin-haltige o/w-Emulsionen gezeigt; im Testsystem bei gleichzeitiger Anwesenheit von Bakterien und eukaryotischen Zellen unter simulierten Wundbedingungen war bereits die Kombination 0,05 % PHMB / 0,4 % EPC vollständig bakterizid und dabei ohne zytotoxischen Effekt wirksam. Diese Darreichungsform fungiert weiterhin als PHMB-Depot, das auch nach wiederholter Passage durch eine Bakteriensuspension noch die gleiche wundantiseptische Wirksamkeit aufweist wie in der ersten Passage. Erste in vitro- und in vivo-Erfahrungen mit den hier beschriebenen PHMB-haltigen o/w-Emulsionen wurden bereits durch andere Arbeitsgruppen publiziert. Demnach führt diese neue Darreichungsform zu einer größeren Eindringtiefe des Wirkstoffs in die Haarfollikel, die in Bezug auf die Hautfläche das mit Abstand größte Reservoir für die mikrobielle Hautflora und nicht zuletzt auch für eine Repopulation oberflächlich desinfizierter Haut darstellen. Die in vivo–Daten deuten darauf hin, dass mit partikel-gebundenem PHMB eine bessere und nachhaltigere Antisepsis erreicht werden kann als mit freiem PHMB. Zusätzlich zum Beitrag an der Konsensusempfehlung des Polihexanids zur Behandlung chronischer Wunden wird damit als wesentliches Ergebnis der Dissertation die Erschließung von bisher für wässrige PHMB-Lösungen nicht möglicher medizinischer Einsatzorte wie in sensiblen Geweben oder Anwendung bei Neugeborenen, am Auge, in Gegenwart von Knorpel, am Peritoneum und in anderen Körperhöhlen (Blase, Harnröhre, vereiterte Gelenkhöhlen), zur Mukositis-Prophylaxe, bei der Krebschemotherapie, bei Verbrennungen 3. Grades, aber auch in der antimikrobiellen Behandlung von Zellkulturen vorstellbar. Bis zu einer solchen therapeutischen Nutzung sind jedoch noch weitere Studien notwendig. Als günstig dürfte sich erweisen, dass es sich sowohl beim Polihexanid, als auch bei dem hier verwendeten Lipofundin ® um bereits etablierte und gut verstandene Medizinprodukte handelt. Im Kontext der weltweit zunehmenden Antibiotikaresistenzen und Verbreitungswege nosokomialer Erreger bei entsprechend geringer werdenden chemotherapeutischen Interventionsmöglichkeiten durch Antibiotika gewinnt die Möglichkeit des Einsatzes von Antiseptika mit breitem Wirkungsspektrum und guter Verträglichkeit immer mehr an Bedeutung, und dabei auch umso mehr die Erweiterung bestehender Einsatz-Indikationen. Neben der auf den ersten Blick vordringlich erscheinenden Identifikation neuer Wirkstoffe kann nicht zuletzt auf Basis der hier vorgelegten Ergebnisse die auf das gewünschte Wirkumfeld zugeschnittene Modifikation der Darreichungsform bekannter antiseptischer Wirkstoffe als möglicher Weg zur verbesserten antimikrobiellen Therapie herausgestellt werden. Diesem Gedanken folgen beispielsweise bereits Versuche, die die besonderen Eigenschaften von Nanopartikeln oder Peptid-basierten Nanostrukturen für die Bekämpfung von Infektionen und Kolonisationen zu nutzen, wobei deren Einsatz wegen der zum Teil hohen ökologischen Fremdartigkeit für biologische Systeme kritisch evaluiert werden muss. Im Gegensatz dazu ähnelt die Wirkung des Polihexanids auf die zwangsläufig und physiologisch kaum modifizierbar negativ geladenen bakteriellen Zellwandstrukturen dem Wirkmechanismen natürlich vorkommender antibakterieller Peptide wie dem β-Defensin, die einen wesentlichen Bestandteil des evolutionär sehr alten, angeborenen Immunsystems der Vertebraten darstellen – mikrobielle Zellumhüllungen sind anfällig gegenüber polykationischen Verbindungen mit hydrophoben Domänen. Auch das stellt einen Vorteil des Polihexanids gegenüber anderen Antiseptika dar.
Unlike the native surface of the implant material (Ti6Al4V), oxidation with H2O2 leads to increased binding of the effective antimicrobial agent poly(hexamethylene) biguanide [PHMB]. However, treating with NaOH instead results in an even higher PHMB mass coverage. After oxidation with H2O2, strong differences in the PHMB adsorption capability between polished and corundum-blasted surfaces appear, indicating a roughness dependence. After NaOH treatment, no such effect was observed. The wetting properties of specimens treated with either H2O2 or NaOH prior to PHMB exposure clearly varied. To unravel the nature of this interaction, widespread in silico and in vitro experiments were performed. Methods: By X-ray photoelectron spectroscopy, scanning electron microscopy, water contact angle measurements and MD simulations, we characterized the interplay between the polycationic antimicrobial agent and the implant surface. A theoretical model for PHMB micelles is tested for its wetting properties and compared to carbon contaminated TiO2. In addition, quantitation of anionic functional group equivalents, the binding properties of PHMB with blocked amino end-group, and the ability to bind chlorhexidine digluconate (CHG) were investigated. Ultimately, the capability of osteoblasts to build calcium apatite, and the activity of alkaline phosphatase on PHMB coated specimens, were determined. Results: Simulated water contact angles on carbon contaminated TiO2 surfaces and PHMB micelle models reveal little influence of PHMB on the wetting properties and point out the major influence of remaining and recovering contamination from ambient air. Testing PHMB adsorption beyond the critical micelle concentration and subsequent staining reveals an island-like pattern with H2O2 as compared to an evenly modified surface with NaOH. Both CHG and PHMB, with blocked amino end groups, were adsorbed on the treated surfaces, thus negating the significant influence of PHMB’s terminal groups. The ability of osteoblasts to produce calcium apatite and alkaline phosphatase is not negatively impaired for PHMB mass coverages up to 8 μg/specimen. Conclusion: Differences in PHMB adsorption are triggered by the number of anionic groups and carbon contaminants, both of which depend on the specimen pre-treatment. With more PHMB covering, the implant surface is protected against the capture of new contamination from the ambient air, thus building a robust antimicrobial and biocompatible surface coating.
Ziel dieser Arbeit war der Nachweis der antimikrobielle Wirksamkeit von oberflächlich, durch einfache chemische Verfahren immobilisiertem PHMB auf Ti6Al4V-Oberflächen gegenüber Gram-positiven und Gram-negativen Erregern mit Standardmethoden und methodischen Varianten.
Die Immobilisierung von PHMB auf Ti6Al4V-Oberflächen erfolgte entweder oxidativ durch die Behandlung der Prüfkörper mit 5 % H2O2 oder über eine alkalische Hydrolyse in 5 M NaOH-Lösung. Als Prüfmikroorganismen dienten die Gram-positiven Schleimbildner S. aureus (ATCC 29213/DSM 2569) und S. epidermidis (ATCC 35984/DSM 28319), als Gram-negativer Vertreter P. aeruginosa (ATCC 27853/DSM 1117). Die Biofilmbildungsintensitäten der eingesetzten Erreger wurden nach Anwendung der Kristallviolett-Färbemethode (Fletcher 1977) quantifiziert. Die Ermittlung der antimikrobiellen Wirksamkeit von PHMB-beschichteten Prüfkörpern erfolgte durch quantitative bzw. qualitative Methoden. Dafür wurden zwei Strategien verfolgt: (1) Herstellung des unmittelbaren Kontakts zwischen Mikroorganismen und antimikrobieller Oberfläche durch Verringerung des Flüssigkeitsvolumens des Kulturmediums mittels Vakuum- oder Wärmebehandlung; und (2) Untersuchung des Adhärenzverhaltens der Mikroorganismen nach 15 min und/oder 6 h Kontakt mit der PHMB-Beschichtung der Ti6Al4V-Prüfkörper. Die Etablierung eines ATP-Tests zur quantitativen Bestimmung der Bakterien war ebenfalls Bestandteil der Untersuchungen zur antimikrobiellen Wirksamkeit. Qualitativ erfolgte die Auswertung mit Hilfe von LIVE/DEAD-Färbungen und des CASO-Agar-Overlay-Tests. Die Validierung der effektiven mikrobioziden Wirksamkeit gegenüber S. epidermidis erfolgte in Co-Kultur-Versuchen mit den Osteoblasten-ähnlichen SaOs-2-Zellen.
Während die Kultivierung von S. aureus und P. aeruginosa im verwendeten Zellkulturmedium DMEM/F12 möglich war, tolerierte S. epidermidis das Medium nicht. Die Entwicklung eines Co-Kulturmediums, bestehend aus 10 % CASO-Bouillon und 90 % Zellkulturmedium, ermöglichte sowohl das Wachstum der Bakterienspecies als auch das der SaOs-2 Zellen, was eine wichtige Voraussetzung für weiterführende Co-Kulturen war. Die Produktion eines Biofilms konnte bei allen Erregern mittels Kristallviolett-Färbung nachgewiesen werden. Nach Herstellung des direkten Kontaktes zwischen den Prüfmikroorganismen und der antimikrobiellen Oberfläche durch Reduzierung des Flüssigkeitsvolumens der applizierten Bakteriensuspensionen, resultierten Reduktionsraten von 3 – 5 log10 für S. aureus und S. epidermidis. Der Gram-negative Erreger P. aeruginosa ist hingegen mit nur 0,5 – 1,5 log10-Stufen Reduktion für diese Methoden als ungeeignet einzustufen ist, da ein Absterben des Erregers aufgrund von Austrocknung nicht auszuschließen war. Die Adhärenz der eingesetzten Mikroorganismen nach 15 min Kontaktzeit und anschließender Inkubation bei 37 °C für 6 h, resultierte in Reduktionsraten von 4 – 5 log10 für S. aureus, 1 – 5 log10 für P. aeruginosa und 3 – 4 log10 für S. epidermidis. Mit PHMB beschichtete Ti6Al4V-Prüfkörper, die in einer Bakteriensuspension für 6 h unter dynamischen Bedingungen inkubiert wurden, zeigten nur Reduktionsraten von ca. 1 – 3 log10-Stufen gegenüber den Testbakterien. Nach 15 min Kontaktzeit auf einer kontaminierte Agar-Oberfläche und weiteren 6 h Inkubation bei 37 °C, konnten auf antimikrobiellen PHMB-Oberflächen Reduktionen von 1 – 2 log10-Stufen ermittelt werden. In angewandten Co-Kulturtests mit S. epidermidis und SaOs-2 Zellen konnte die antimikrobielle Wirksamkeit der PHMB-beschichteten Oberfläche bestätigt werden.
Die antimikrobiell wirksame PHMB-Schicht auf den eingesetzten Ti6Al4V-Prüfkörpern benötigt zur Abtötung von Erregern den direkten Kontakt zwischen der Oberfläche und den Prüfmikroorganismen, um wirksam zu sein. Zudem konnte ermittelt werden, dass PHMB ausschließlich auf der Oberseite der Prüfkörper immobilisiert werden konnte, was die Mikrobiozidie-Testung mit herkömmlichen Methoden erschwert.
Es konnte bestätigt werden, dass oberflächlich immobilisiertes PHMB auf Ti6Al4V-Prüfkörpern sowohl Gram-positive als auch Gram-negative Bakterien bei direktem Kontakt abtötet. Als am besten geeignet für die Testung dieser Oberfläche erwies sich die 6 h-Adhärenz-Methode, bei der nach 6 h oberflächlichem Kontakt quantitativ und qualitativ keine überlebenden Mikroorganismen nachgewiesen werden konnten.
Akute traumatische Wunden sind mit Bakterien kontaminiert und haben ein Infektionsrisiko von etwa 6 %. Daher wird die antiseptische Wundspülung vor chirurgischer Versorgung kontaminierter Wunden empfohlen. Hierfür werden unterschiedliche Antiseptika eingesetzt. Das Ziel dieser retrospektiven, nicht randomisierten Längskohorten-Studie bestand darin, den präventiven Effekt von vier verschiedenen Spüllösungen vor chirurgischer Behandlung auf die SSI-Rate bei traumatischen Weichteilwunden zu ermitteln.
Über einen Zeitraum von drei Jahrzehnten wurde die prophylaktische Wundspülung bei Patienten mit kontaminierten traumatischen Wunden untersucht, die eine chirurgische Behandlung mit oder ohne primären Wundverschluss benötigten. Von 1974-1983 wurde entweder PHMB, PVP-I, 4 % Wasserstoffperoxid, oder unverdünnte Ringerlösung verwendet. Von 1984-1996 wurden nur PHMB oder PVP-I angewendet. Von 1997 bis Ende der Studie 2005 wurde nur noch PHMB angewendet.
Die kombinierte Rate von oberflächlichen und tiefen Wundinfekten betrug 1,7% in der PHMB-Gruppe, 4,8% in der PVP-I-Gruppe, 5,9% in der Ringer-Gruppe, und 11,7% in der Wasserstoffperoxid-Gruppe. Verglichen mit allen anderen Behandlungsgruppen zeigte PHMB die höchste Effizienz, um Infektionen in traumatischen Weichteilwunden vorzubeugen. Bei Riss-Quetsch-Wunden war der Unterschied verglichen mit PVP-I nur für die tiefen Wundinfektionen signifikant. Bei Schnittwunden wurden sowohl A1- als auch A2-SSI signifikant in der Häufigkeit reduziert.
Auf Grund des Stichprobenumfangs ist trotz des retrospektiven Studiendesigns kein Zweifel an der infektionspräventiven Überlegenheit von PHMB zur Spülung bei traumatischen Weichteilwunden gegeben. Die Infektionsraten der retrospektiven Studie können als Basis für die Fallzahlkalkulation für eine dringend benötigte prospektive klinische Studie zugrunde gelegt werden.