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Die chronische Herzinsuffizienz (HI) bezeichnet das Unvermögen des Herzens, die vom Körper benötigte Blutmenge bedarfsgerecht zu befördern und stellt in der Allgemeinbevölkerung das Endstadium vieler Herzerkrankungen dar. Trotz großer Fortschritte in der medikamentösen Therapie ist die Prognose der HI auch heute noch schlecht. Der progrediente Verlauf erstreckt sich von einer kompensierten Herzhypertrophie mit aufrechterhaltener Pumpfunktion bis hin zu einer massiven Ventrikeldilatation mit stark eingeschränkter Herzfunktion und weist dementsprechend eine schlechte Prognose auf. Die zellulären Veränderungen auf Protein- und Genexpressionsebene während der Progression einer HI sind sehr komplex und trotz ausgiebiger wissenschaftlicher Arbeiten nicht ausreichend geklärt. Dabei ist es von entscheidender Bedeutung, in welcher Phase der Erkrankung spezifische Änderungen in der Genregulation entstehen und inwiefern sich diese auf den Phänotyp auswirken. Auf Grund dessen beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit den zeitabhängigen Veränderungen auf mRNA-und Proteinebene während der Progression der HI. Um alle Stadien beginnend von einer subklinischen Organschädigung bis hin zur Ausbildung einer HI experimentell untersuchen zu können, wurde zunächst ein Mausmodell etabliert, welches durch eine chronische Nachlasterhöhung mittels Einengung des Aortenlumens eine Myokardschädigung durch eine arterielle Hypertonie simuliert (transverse aortic constriction, TAC). Die Herzfunktion der Mäuse wurde an den postoperativen Tagen 4, 14, 21, 28, 42, und 56 durch Messungen im Kleintier-MRT (Magnetresonanztomografie) evaluiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) TAC-operierter Mäuse vom postoperativen Tag 4 zu 14 verschlechtert, bis Tag 42 auf einem konstanten Niveau hält und bis Tag 56 nochmals stark absinkt. Im Gegensatz dazu zeigten Sham-operierte Mäuse über den gesamten Zeitraum eine stabile LVEF. Ein vergleichbarer stufenartiger Verlauf konnte bei den Parametern der linksventrikulären Masse und den endsystolischen bzw. enddiastolischen Volumina beobachtet werden. Zusätzlich konnte durch histologische Untersuchungen zu den verschiedenen postoperativen Zeitpunkten eine verstärkte Fibrosierung des Herzgewebes nach der TAC-OP aufgezeigt werden. Für die longitudinalen Transkriptom- und Proteomuntersuchungen wurden die Herzen (jeweils linke und rechte Ventrikel) nach den MRT-Messungen entnommen, gruppen- und zeitpunktspezifisch gepoolt und einer Microarray- bzw. massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Auf Transkriptomebene zeigten sich vor allem an den Tagen 4 und 56 starke TAC-induzierte Veränderungen im Expressionsmuster, wohingegen der Zeitraum zwischen 14 und 42 Tagen weniger differenziell exprimierte Gene aufwies. Der Verlauf der Erkrankung konnte anhand bereits bekannter Hypertrophie- und HI-marker sehr gut charakterisiert werden. So zeigten Nppa (ANP) und Nppb (BNP) im linken Ventrikel bereits kurz nach Aortenstenose stark erhöhte Expressionslevel, die über die gesamte Versuchsdauer erhalten blieben. Weiterhin wurde die Expression von Genen reguliert, die an kardialen Remodelingprozessen maßgeblich beteiligt sind, wie beispielsweise Acta1 (a-Aktin), Myh7 (b-Myosin Heavy Chain) und Postn (Periostin). Im Vergleich beider Ventrikel zeigte der rechte Ventrikel bezüglich der Anzahl der regulierten Gene als auch bei der Expression HI-assoziierter Gene eine verzögerte und weniger stark ausgeprägte Reaktion. In den linken Ventrikeln wurden vor allem die Gene reguliert, deren Genprodukte der extrazelluären Matrix angehören. Eine Validierung der Microarray-Ergebnisse mittels realtime-PCR konnte die Richtigkeit der Analysemethode sehr präzise bestätigen. Da diese anhand ausgewählter Gene auf Einzeltierebene durchgeführt wurde, konnte zusätzlich auf Korrelation zwischen mRNA-Expression und den kardialen Funktionsparametern getestet werden. Wie erwartet spiegelten die Epressionslevel der HI-assozierten Markergene Nppa (ANP), Nppb (BNP) und Myh7 (b-Myosin Heavy Chain) die progressive Verschlechterung der Herzfunktion wider. Zusätzlich konnten durch die Validierung und Korrelationsanalysen weitere interessante Kandidatengene, wie beispielsweise Sfrp2 (Secreted frizzled-related protein 2) und Wisp2 (WNT1-inducible signaling pathway protein 2) für weiterführende Studien identifiziert werden. Auch auf Proteomebene konnten vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Auch hier zeigte der linke Ventrikel eine deutlich ausgeprägtere Reaktion auf die Drucküberlastung, der rechte Ventrikel antwortete deutlich schwächer und verzögert. Änderungen im Proteinmuster nach TAC waren in den linken Ventrikeln vor allem an den Tagen 14, 21 und 28 stark ausgeprägt. Ingenuity Pathway Analysen der veränderten Proteine weisen auf Veränderungen im Kalzium-, Rho A- und PKA-Signaling vor allem zu den frühen Zeitpunkten hin, wohingegen zu späteren Zeitpunkten hauptsächlich metabolische Prozesse betroffen waren.
Die Hefe Saccharomyces cerevisiae reagiert auf die sich ständig ändernden Umweltbedingungen durch eine präzise Regulation der Genexpression. Möglich wird dies durch ein komplexes Netzwerk aus spezifischen Regulatoren und pleiotropen Faktoren. Aktivatorproteine binden an Aktivierungssequenzen (UAS-Elemente) in ihren Zielpromotoren und rekrutieren basale Transkriptionsfaktoren sowie Coaktiva¬toren. Dadurch erhöhen sich Wahrscheinlichkeit und Häufigkeit der Transkriptions¬initiation und die DNA im Promotorbereich wird durch die Aktivität von Komplexen der Chromatinremodellierung und -modifizierung für die Transkriptionsmaschinerie zugänglich gemacht. Dagegen binden spezifische Repressor¬proteine an ihre Regula¬tionssequenzen (URS-Elemente) oder an Aktivatorproteine, inhibieren deren Wirkung oder rekrutieren Histondeacetylase-Komplexe wie den Sin3-Corepressor, die eine Verdichtung des Chromatins bewirken. Der Sin3-Corepressorkomplex ist an einer Vielzahl von Regulationsprozessen beteiligt. In Hefe existieren zwei Sin3-Varianten, die als Rpd3L bzw. Rpd3S bezeichnet werden und sich in ihrer Zusammensetzung unterscheiden. Neben Sin3 als zentralem Gerüst¬protein in beiden Komplexen sind im Rpd3L strukturelle Untereinheiten wie Sds3, Sap30 und Pho23 sowie die Histondeacetylase (HDAC) Rpd3 als enzymatische Komponenten enthal¬ten. Durch Funktionsanalysen von Mutanten einzelner Unterein¬heiten wurde festge¬stellt, dass zusätzlich zu Rpd3 weitere HDACs an der Repression ICRE-abhängiger Gene der Phospholipid-biosynthese Gene beteiligt sind. Interaktionsstudien zeigten, dass auch die HDACs Hda1 und Hos1 an Sin3 binden. Die Bindung erfolgt über drei sogenannte HDAC-Interaktionsdomänen (HID1-3), wobei Hda1 und Hos1 an HID2 und HID3 binden, Rpd3 dagegen an HID1 und HID3. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die HDACs direkt an ihre jeweiligen HIDs binden. Außerdem inter¬agieren Hda1 und Hos1 auch in vivo mit Sin3. Die HID1 wurde auf die Aminosäuren 801-950 verkürzt und es wurde nachge¬wiesen, dass eine funktionsfähige katalyti¬sche Domäne von Rpd3 nicht für die Wechselwirkung mit Sin3 notwendig ist. Außerdem wurden die Interaktionsdomänen von Sds3 und Sin3 kartiert. Die erhaltenen Befunde ergänzen die Daten zu Protein-Protein-Inter¬aktionen im Sin3-Corepressorkomplex und komplettieren funktionelle Aspekte der HDAC-Rekrutierung. Eine weitere Zielstellung dieser Arbeit war die Erstellung eines Interaktionsnetzwerks zwischen spezifischen Aktivatoren und allgemeinen Faktoren der Transkription. Eukaryotische Aktivatorproteine sind modular aufgebaut und besitzen voneinander separierbare Funktionsdomänen. Die Erkennung und Bindung von UAS-Elementen in den Zielpromotoren erfolgt über die DNA-Bindedomäne (DBD), während Tran¬skriptions¬¬aktivierungs¬domänen (TADs) basale Transkriptionsfaktoren und Co¬aktiva¬toren rekrutieren und somit die aktivierende Wirkung vermitteln. Im Gegensatz zu den DBDs folgen TADs meist keinen durch Sequenzanalysen vorhersagbaren Strukturmotiven und müssen manuell eingegrenzt werden. Für die Kartierung funktioneller TADs wurden Längenvarianten von über 30 Aktiva-toren aus verschiedenen Familien DNA-bindender Proteine an die Gal4DBD fusioniert und auf ihre Fähigkeit überprüft, ein UASGAL-abhängiges Reportergen zu aktivieren. Dabei konnten 15 neue TADs eingegrenzt werden. Weiterhin wurden die bisher nicht charakterisierten Zinkcluster¬proteine Yjl206c, Yer184c, Yll054c und Ylr278c als Aktivatoren bestätigt. Dadurch stand eine Samm¬lung aus 20 bekannten und neukartierten TADs zur Verfügung, die nach Konstruktion von GST-Fusionen für in vitro-Interaktionsexperimente mit Unter¬einheiten des Mediators, des TFIID- und des SWI/SNF-Komplexes eingesetzt wurden. Es konnten direkte Wechselwirkungen von Aktivatoren (u. a. Aft2, Aro80, Mac1 und Zap1) mit den TFIID-Komponenten TBP, Taf1, Taf4 und Taf5 detektiert werden. Die Bindung an Taf1 erfolgte im Bereich von aa 1-250, der zwei Aktivator¬interaktions-domänen (AID) enthält und in vorangegangenen Experimenten auch mit Ino2 und Adr1 interagierte. Die Rap1-Bindedomäne (RBD) von Taf4 (aa 253-344) interagierte auch mit Mac1, Aft2 und Ino2. Daher wurde dieser Bereich als allgemeine AID klassifiziert. Für die Aktivatorinteraktion essentielle Aminosäuren konnten allerdings nicht identi¬fiziert werden. 17 von 20 TADs interagierten direkt mit der Mediator-Untereinheit Med15, während für Med17 10 Kontakte zu Aktivatoren detektiert wurden, was die Relevanz des Mediators für die Aktivatorfunktion unterstreicht. Die katalytische Untereinheit des SWI/SNF-Komplexes Swi2 zeigte ähnlich viele TAD-Interaktionen wie Med15. Der N-terminale Bereich von Swi2 (aa 1-450) stellte sich als ausreichend für die Bindung der Aktivatoren heraus und enthält demnach eine oder mehrere AIDs. Damit konnte das Interaktionsnetzwerk zwischen Aktivatoren und allgemeinen transkriptionalen Cofaktoren substantiell erweitert werden.
Die Transkription von Genen der Phospholipidbiosynthese in S. cerevisiae wird durch ein ICRE (inositol/choline responsive element) genanntes UAS-Element aktiviert, welches durch die Phospholipid-Vorstufen Inositol und Cholin (IC) gesteuert wird. ICRE-Motive werden durch ein Heterodimer der bHLH-Proteine Ino2 und Ino4 erkannt, wobei Ino2 über zwei Transkriptionsaktivierungsdomänen (TAD) die Expression vermittelt, während Ino4 dem Kernimport des Komplexes dient. Negativer Regulator ist Opi1, der mit Ino2 interagiert. SUA7 (TFIIB) wird durch die Interaktion mit Ino2 an den Promotor rekrutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen durchgeführt, um ein Heterodimer aus heterolog exprimiertem Ino2 und Ino4 über chromatographische Methoden zu reinigen. Es wurde eine affinitätschromatographische Strategie entwickelt, die es gestattet, epitopmarkiertes Ino2 und Ino4 von einem Großteil der Fremdproteine abzutrennen. Mit größeren Zellmengen könnte es künftig gelingen, ein Ino2/Ino4-Heterodimer zu reinigen und es nach Kristallisierung zusammen mit einem ICRE-Motiv einer Röntgenstrukturanalyse zugänglich zu machen. Unter Verwendung genomischer Sequenzdaten von S. cerevisiae wurden in dieser Arbeit weitere Gene identifiziert, die ICRE-Motive in ihrer Promotorregion tragen, aber keine offensichtliche Rolle bei der Phospholipidbiosynthese spielen. Untersuchungen zeigten, dass die ICRE-tragenden Gene FAR8, RSF1, YEL073C und URA8 relativ stark, die Gene ARG4, ERG20, GPD2 und VHT1 nur moderat durch IC beeinflusst werden. Für das in S. cerevisiae stark IC-abhängige INO1 Gen (50-fache Derepression bei IC-Mangel) wurde gezeigt, dass drei distinkte ICRE-Motive für diese Regulation verantwortlich sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden mit Transkriptomanalysen anderer Gruppen verglichen und die Aussagekraft von in silico-Recherchen bewertet. Candida albicans ist eine opportunistisch pathogene Hefe. Auch C. albicans ist in der Lage, Inositol, Cholin und Fettsäuren de novo zu synthetisieren. Ein Funktionshomolog zu INO1, das CaINO1, vermag eine entsprechende Nullmutation in S. cerevisiae zu komplementieren. Ebenso wurden in C. albicans die Gene CaCHO1, CaFAS1 und CaFAS2 für die Synthese von Cholin bzw. Fettsäuren identifiziert. Ferner besitzt C. albicans das dem Opi1-Protein strukturell und funktionell ähnelnde CaOpi1, welches ebenfalls in der Lage ist, eine IC-abhängige Genregulation in S. cerevisiae zu vermitteln. Die in silico Identifikation potentieller C. albicans Orthologer zu INO2 sowie zu INO4 gab Anlass zu der Annahme, dass die Regulation der Phospholipidbiosynthese in S. cerevisiae und C. albicans konserviert vorliegt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein unkonventionelles Intron im mutmaßlichen CaINO4 Gen identifiziert und durch RT-PCR eine intronfreie cDNA des CaINO4 Gens erhalten. Mit den Produkten der mu tmaßlichen Gene CaINO2 und CaINO4 wurden Protein/DNA- und Protein/Protein-Interaktionen untersucht und mit der Situation in S. cerevisiae verglichen. CaIno2 und CaIno4 sind in der Lage zu heterodimerisieren und an ICRE-Motive aus S. cerevisiae zu binden, jedoch konnte keine Bindung an den CaINO1 Promotor gezeigt werden. Weiterhin ist das Heterodimer der C. albicans-Proteine in der Lage, einer S. cerevisiae ino2 ino4 Doppelmutante ein Wachstum auf IC-freiem Medium zu ermöglichen. Keines der Gene kann jedoch allein die jeweils entsprechende ino2 oder ino4 Einfachmutation komplementieren. Weder CaIno2 noch CaIno4 interagieren mit CaOpi1, hingegen interagiert CaIno2 mit Opi1, ebenso CaOpi1 mit Ino2. Ferner interagiert CaIno2 wie auch CaIno4 mit CaSua7, nicht jedoch mit Sua7. Es konnte keine Interaktion zwischen Ino2 bzw. Ino4 mit CaIno4 bzw. CaIno2 festgestellt werden, ebensowenig eine Homodimerisierung der Proteine. Ähnlich wie Ino2 enthält auch CaIno2 zwei Transkriptionsaktivi erungsdomänen an entsprechenden Positionen und vergleichbarer Aktivierungsleistung. Es gelang im Rahmen dieser Arbeit nicht, homozygote Mutationen der Gene CaINO2 und CaINO4 durch Gendisruption in die diploide Hefe C. albicans einzuführen, es konnten lediglich heteroallele Mutanten hergestellt werden. Dieser Befund ist ein Hinweis auf eine Rolle von CaIno2 und CaIno4 bei der Aktivierung essentieller Gene in C. albicans. Daher wurde mit Genaktivierungstests nach der CaIno2/CaIno4-Konsensusbindesequenz gesucht und diese dann verwendet, um potentielle Zielgene in silico zu identifizieren. Als Konsensussequenz wurde das Motiv BWTCASRTG erhalten. Dieses Motiv wurde weder vor CaINO1, CaFAS1 oder CaCHO1 gefunden, jedoch zeigte sich eine deutliche Häufung des UAS-Elements vor mitochondrialen Genen, vor Genen der Ergosterolbiosynthese und besonders vor einer Vielzahl von Genen ribosomaler Proteine. Es kann aus diesen Daten gefolgert werden, dass CaIno2 und CaIno4 für die Aktivierung anderer, vermutlich essentieller Zielgene erforderlich sind als ihre Orthologen aus S. cerevisiae, während CaINO1 durch bisher unbekannte Faktoren reguliert wird.
Urm1: A Non-Canonical UBL
(2021)
Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a harmless resident of the human nasopharyngeal cavity, and, in general, every individual is likely to be colonized asymptomatically at least once during life. However, under certain conditions, the bacterium can spread to other tissues and organs causing local, non-invasive infections but also lifethreatening, invasive diseases. Pneumococcal carriage and infection is a highly regulated interplay between pathogen- and host-specific factors and the intimate contact of S. pneumoniae with the surface of the nasopharynx is the crucial step in pneumococcal pathogenesis. Pneumococcal adherence to the respiratory epithelium is mediated by surface-exposed adhesins. These adhesins engage host cell receptors either directly or indirectly by recognizing glycoproteins of the extracellular matrix (ECM) including structural components, such as collagens, laminins, and fibronectins, as well as plasma-derived ECM modulators, like vitronectin and Factor H. Pneumococcal surface protein C (PspC) is a surface-exposed protein and important virulence factor of S. pneumoniae. The multifunctional PspC protein promotes pneumococcal adherence to host cells by interacting with the secretory component of the human polymeric Immunoglobulin receptor of respiratory cells. In addition, PspC facilitates pneumococcal immune evasion by recruiting the complement inhibitor proteins C4b-binding protein (C4BP) and Factor H. Moreover, Factor H bound to the pneumococcal surface promotes bacterial adhesion to human epithelial and endothelial cells. S. pneumoniae also interacts with the human glycoprotein vitronectin. In plasma, monomeric vitronectin regulates thrombosis, fibrinolysis and the terminal complement cascade, while it additionally mediates cell-matrix interactions, cell adhesion and migration in the ECM. It was shown that multimeric, ECM-associated vitronectin facilitates pneumococcal adherence to respiratory epithelial cells. In addition, the interaction of pneumococci with vitronectin promotes their uptake by mucosal epithelial cells via the engagement of the integrin αvβ3 receptor and activation of intracellular signaling pathways culminating in cytoskeletal rearrangements. This study aims to identify and characterize the surface-exposed protein(s) that mediate binding of pneumococci to vitronectin and to elucidate the impact of vitronectin on pneumococcal pathogenesis beyond its function as molecular bridge between pneumococcus and host. Flow cytometric, immunosorbent and surface plasmon resonance experiments revealed that PspC is a vitronectin-binding protein of S. pneumoniae. The specificity of the interaction with vitronectin was confirmed using recombinant PspC proteins and Lactococcus lactis heterologously expressing PspC on their surface. Factor H did not hinder vitronectinbinding to PspC indicating that vitronectin recognizes the central part of PspC. Secretory IgA inhibited but not completely prevented vitronectin-binding to PspC, strongly suggesting that vitronectin binds near, but not directly to, the SC-binding region within the R domain(s) of PspC. In addition, PspC proteins comprising two R domains bound with higher affinity to vitronectin than PspC containing only one R domain, indicating that two interconnected R domains are required for efficient vitronectin-binding. Despite the sequential and structural differences to classical PspC, the PspC-like protein Hic specifically interacted with vitronectin with similar affinity than PspC containing two linked R domains. Binding studies confirmed that Factor H interacts with the very N-terminal region of Hic showing high sequence homology to classical PspC proteins, while vitronectin recognizes an adjacent region in the N-terminal region of Hic. The studied PspC proteins bound to both soluble and immobilized vitronectin, and the C-terminal heparin-binding domain (HBD3) was identified as PspC-binding motif in soluble vitronectin. However, in its immobilized form, vitronectin likely exposes additional binding sites for PspC since a region N-terminally to the identified HBD3 conferred binding of PspC. Vitronectin inhibits the terminal complement pathway, thereby preventing proinflammatory immune reactions and tissue damage. In general, pneumococci are protected from opsonization and MAC-dependent lysis by their capsule. However, pneumococci in close contact to human cells can become susceptible to complement attack due to reduced amounts of capsule. In addition, they can be severely affected by TCC-induced inflammatory responses. Vitronectin bound to PspC significantly inhibited the formation of terminal complement complexes. Thus, the interaction of PspC with vitronectin might aid in immune evasion of S. pneumoniae by inhibiting complement-mediated lysis and/or suppressing proinflammatory events. In conclusion, the results revealed the multifunctional PspC and Hic as vitronectin-binding proteins and proposed a novel role for the specific interaction of S. pneumoniae with vitronectin in regulating the complement cascade, beside its function as molecular bridge to the respiratory epithelium.
Bacteria are exposed to oxidative stress as an unavoidable consequence of their aerobic lifestyle. Reactive oxygen species (ROS) are generated in the stepwise one-electron reduction of molecular oxygen during the respiration. Pathogens encounter ROS during the oxidative burst of macrophages as part of the host immune defense. Besides ROS, bacteria also have to cope with reactive chlorine, electrophilic and nitrogen species (RCS, RES, RNS). To cope with these reactive species, bacteria have evolved different defense and repair mechanisms. To maintain the reduced state of the cytoplasm, they utilize low molecular weight (LMW) thiols. LMW thiols are small thiol-containing compounds that can undergo post-translational thiolmodifications with protein thiols, termed as S-thiolations. S-thiolations function as major redox regulatory and thiol-protection mechanism under oxidative stress conditions. In eukaryotes and Gram-negative bacteria, the tripeptide glutathione (GSH) functions as major LMW thiol, which is present in millimolar concentrations. The Actinomycetes, such as Mycobacterium and Corynebacterium species do not produce GSH and utilize instead mycothiol (MSH) as their alternative LMW thiol. In Firmicutes, including Bacillus and Staphylococcus species, bacillithiol (BSH) functions as the major LMW thiol. LMW thiols protect protein thiols against the irreversible overoxidation of cystein residues to sulfinic and sulfonic acids. In addition, LMW thiols contribute to the virulence and survival of pathogens, function in metal homeostasis and serve as enzyme cofactors for detoxification of xenobiotics and antibiotics. In this doctoral thesis, we aimed to investigate the roles of MSH and BSH in redox regulation of main metabolic enzymes under oxidative stress in the pathogens Corynebacterium diphtheriae and Staphylococcus aureus. Previous redox proteomics studies identified the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GapDH and the aldehyde dehydrogenase AldA as S-thiolated in S. aureus and C. diphtheriae. Thus, we aimed to study the redox regulation of the metabolic enzyme GapDH in C. diphtheriae in response to NaOCl and H2O2 stress by S-mycothiolation, which is described in chapter 1. Moreover, we studied the involvement of the mycoredoxin-1 (Mrx1) and thioredoxin (Trx) pathways in reactivation of S-mycothiolated GapDH in vitro. Using shotgun proteomics, 26 S-mycothiolated proteins were identified under NaOCl stress in C. diphtheriae. These are involved in energy metabolism (Ndh, GlpD) and in the biosynthesis of amino acids (ThrA, LeuB), purines (PurA) and cell wall metabolites (GlmS). The glycolytic GapDH was identified as conserved target for S-thiolation across Gram-positive bacteria. GapDH was the most abundant protein, contributing with 0.75 % to the total cystein proteome. Moreover, GapDH is a conserved target for redox regulation and S-glutathionylation in response to oxidative stress in several prokaryotic and eukaryotic organisms. Treatment of GapDH with NaOCl and H2O2 in the absence of MSH resulted in irreversible enzyme inactivation due to overoxidation. Pretreatment of GapDH with MSH prior to H2O2 or NaOCl exposure resulted in reversible inactivation due to S-mycothiolation of the active site Cys153. Since S-mycothiolation is faster compared to overoxidation, S-mycothiolation efficiently protects the GapDH active site against overoxidation. The activity of S-mycothiolated GapDH could be restored by both, the Mrx1 and Trx pathway in vitro. Interestingly, the recovery of Smycothiolated GapDH by Mrx1 was faster compared to its reduction by the Trx pathway. In previous studies, the reactivation of S-mycothiolated Mpx and MrsA by the mycoredoxin pathway occurred also faster compared to the Trx pathway, which is consistent with our results. We were further interested to analyze the redox regulation of the glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase Gap of S. aureus under NaOCl and H2O2 stress, which is described in chapter 2. Using the quantitative redox proteomic approach OxICAT, 58 NaOCl-sensitive cystein residues with >10% thiol oxidation under NaOCl stress were identified. Gap and AldA showed the highest oxidation increase of 29% under NaOCl stress at their active site cystein residues. Using shotgun proteomics, five S-bacillithiolated proteins were identified, including Gap, AldA, GuaB, RpmJ and PpaC. Gap contributed with 4 % as most abundant cystein protein to the total cystein proteome. Our activity assays demonstrated that Gap of S. aureus is highly sensitive to overoxidation by H2O2 and NaOCl in vitro in the absence of BSH. The active site Cys151 of Gap was oxidized to the BSH mixed disulfide under H2O2 and NaOCl stress in the presence of BSH in vitro, which resulted in the reversible Gap inactivation. Moreover, inactivation of Gap by NaOCl and H2O2 due to S-bacillithiolation was faster compared to overoxidation, indicating that S-bacillithiolation protects the Gap active site against overoxidation in vitro. We further showed that the bacilliredoxin Brx catalyzes the reduction of S-bacillithiolated Gap in vitro. Molecular docking of BSH into the Gap active site revealed that S-bacillithiolation does not require major structural changes. Apart from Gap, the aldehyde dehydrogenase AldA was identified as S-bacillithiolated at its active site Cys279 under NaOCl stress in S. aureus previously. Thus, the expression, function, redox regulation and structural changes of AldA were analysed under NaOCl and aldehyde stress in S. aureus as summarized in chapter 3. AldA was S-bacillithiolated in the presence of H2O2 and BSH as demonstrated in BSH-specific Western blots in vitro. The expression of aldA was previously shown to be regulated by the alternative sigma factor SigmaB in S. aureus. Transcription of aldA was strongly increased in a SigmaB-independent manner under formaldehyde, NaOCl and diamide stress in S. aureus. Using an aldA deletion mutant, we demonstrated that aldA is required for growth and survival under NaOCl stress in S. aureus. The purified AldA enzyme was shown to catalyze the oxidation of various aldehyde substrates, including formaldehyde, methylglyoxal, glycolaldehyde and acetaldehyde in vitro. In addition, the function of the conserved Cys279 for AldA activity was investigated in vivo and in vitro. The purified AldAC279S mutant was shown to be inactive for aldehyde oxidation in vitro. Moreover, the aldAC279S mutant was very sensitive under NaOCl stress in vivo, and this phenotype could be reversed using the aldA complemented strain. These experiments demonstrate the function of Cys279 for AldA activity both in vitro and in vivo. AldA activity assays showed that AldA is sensitive to overoxidation and irreversible inactivation by H2O2 alone in vitro. In the presence of BSH, AldA is protected against overoxidation by reversible Sbacillithiolation in vitro. Molecular docking and molecular dynamics simulations revealed that BSH occupies two different positions in the Cys279 active site, which depend on the NAD+ cofactor. In the apoenzyme, BSH forms the disulfide with Cys279 in the “resting” state position, while Cys279 is S-bacillithiolated in the “attacking” state position in the holoenzyme in the presence of the NAD+ cofactor.
The leading hypothesis of why organisms age is the “Free Radical Theory of Aging”, which states that the accumulation of reactive oxygen species (ROS), such as superoxide (O2•-) and hydrogen peroxide (H2O2), causes protein, lipid and DNA damage and leads to the observed age-related decline of cells and tissues. A major obstacle in analyzing the role of oxidative stress in aging organisms is the inability to precisely localize and quantify the oxidants, to identify proteins and pathways that might be affected, and ultimately, to correlate changes in oxidant levels with the lifespan of the organism. To directly monitor the onset and extent of oxidative stress during the lifespan of Caenorhabditis elegans, we utilized the fluorescent H2O2 sensor protein HyPer, which enabled us to quantify endogenous peroxide levels in different tissues of living animals in real time. We made the surprising observation that wildtype C. elegans is exposed to very high peroxide levels during development. Peroxide levels drop rapidly as the animals mature, and low peroxide levels then prevail throughout the reproductive age, after which an age-accompanying increase of peroxide level is observed. These results were in excellent agreement with findings obtained by using the highly quantitative redox proteomic technique OxICAT, which monitors the oxidation status of redox-sensitive proteins as read-out for onset, localization, and protein targets of oxidative stress. By using OxICAT, we detected increased protein thiol oxidation during the development of C. elegans and in aging animals. Many processes in C. elegans might potentially contribute to the elevated peroxide levels observed during development, including cuticle formation, apoptosis, proliferation, gametogenesis, or ROS signaling. The finding that all investigated C. elegans mutants regardless of their lifespan are exposed to high developmental peroxide levels argues for ROS accumulation to be a universal and necessary event. Yet, recovery from the early oxidative boost might determine the subsequent adult lifespan, as we found that long-lived daf-2 mutants transition faster to reducing conditions than short-lived daf-16 mutants, which retain higher peroxide levels throughout their mature life. These results suggest that changes in the cellular oxidant homeostasis, encountered at a very early stage in life, might determine subsequent redox levels and potentially the lifespan of organisms. Manipulation of developmental oxidant levels using glucose restriction or a short bolus of superoxide caused a disruption in developmental growth, a delay in reproduction, and a shortened lifespan. These results suggest that developmental oxidant levels are fine-tuned and optimized. Future experiments are aimed to investigate the sources of developmental hydrogen peroxide, and to elucidate whether active down-regulation of antioxidant enzymes during the larval period might foster peroxide accumulation. Preliminary results indicate that this might indeed be the case for peroxiredoxin 2, whose expression was significantly lower during development than at later stages in life. Finally, we investigated whether the observed variances in the developmental peroxide levels of individual worms within a synchronized wildtype population might be responsible for the observed significant variances in lifespan, and hence could serve as a predictor for adult lifespan. Preliminary results revealed that neither too low nor too high peroxide levels during development are beneficial for the lifespan of wildtype worms, suggesting that ROS level during development might be optimized for maximized lifespan. Future experiments aim to reveal the processes that are affected by ROS and which might influence the individual’s lifespan early in life.
Proteasomes comprise a family of proteasomal complexes essential for maintaining protein homeostasis. Accordingly, proteasomes represent promising therapeutic targets in multiple human diseases. Several proteasome inhibitors are approved for treating hematological cancers. However, their side effects impede their efficacy and broader therapeutic applications. Therefore, understanding the biology of the different proteasome complexes present in the cell is crucial for developing tailor-made inhibitors against specific proteasome complexes. Here, we will discuss the structure, biology, and function of the alternative Proteasome Activator 200 (PA200), also known as PSME4, and summarize the current evidence for its dysregulation in different human diseases. We hereby aim to stimulate research on this enigmatic proteasome regulator that has the potential to serve as a therapeutic target in cancer.
Invasion of the bacterial pathogen Listeria monocytogenes into human host cells requires specialized surface molecules for attachment and induction of phagocytosis. However, efficient invasion is also dependent on factors with house-keeping functions, such as SecA2-dependent secretion of autolysins for post-divisional segregation of daughter cells. Mutations in this pathway prevent degradation of peptidoglycan cross-walls, so that long cell chains are formed that cannot be phagocytosed. The extreme chaining of such mutants manifests as rough colony phenotype. One rough clone was isolated from a transposon library with a transposon insertion in the uncharacterized lmo0720 gene (lftS) together with a spontaneous point mutation in the secA2 gene. We separated both mutations and demonstrated that this point mutation in the intramolecular regulator 2 domain of SecA2 was sufficient to inactivate the protein. In contrast, lftS deletion did not cause a ΔsecA2-like phenotype. lftS is located in an operon with lftR (lmo0719), encoding a PadR-like transcriptional regulator, and lftR deletion affected growth, invasion and day-light dependent coordination of swarming. Inactivation of lftS partially suppressed these phenotypes, suggesting a functional relationship between LftR and LftS. However, the invasion defect of the ΔlftR mutant was only marginally suppressed by lftS removal. LftR regulates expression of the lmo0979–0980 (lieAB) operon, encoding a putative multidrug resistance transporter and lieAB transcription was strongly upregulated in the absence of LftR. Deletion of lieAB in the ΔlftR background restores wild type-like invasion levels. Hence, we conclude that tight transcriptional repression of the lieAB operon is essential for efficient listerial host cell invasion.