Refine
Document Type
- Doctoral Thesis (2)
Language
- German (2) (remove)
Has Fulltext
- yes (2)
Is part of the Bibliography
- no (2)
Keywords
- Lipoproteine (2) (remove)
Untersuchungen zur Immunantwort gegen potenzielle Vakzinkandidaten von Streptococcus pneumoniae
(2022)
Das Gram-positive Bakterium Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) stellt vor allem bei der sehr jungen und älteren sowie immungeschwächten Bevölkerung einen immer mehr an Bedeutung gewinnenden Krankheitserreger dar. Krankheitsbilder wie die Pneumokokken-Meningitis, -Pneumonie und -Sepsis, um nur einige zu nennen, können z.T. schwere Verläufe nehmen. Neue Serotyp-unabhängige Impfstoffe sollen flächendeckenden Schutz vor Infektionen mit S. pneumoniae bieten. Das Hauptaugenmerk der Impfstoffforschung liegt unter anderem auf der Untersuchung von Pneumokokken Protein-basierten Impfstoffen als Bestandteil eines Konjugat- bzw. Multikomponenten Impfstoffes. In diesem Zusammenhang wurde in dieser Arbeit die Immunantwort humaner Immunzellen gegenüber den vier Pneumokokken Oberflächen-Lipoproteinen MetQ, DacB, PnrA und PsaA untersucht. Diese Lipoproteine wurden sowohl in lipidierter als auch in nicht-lipidierter Form als heterologe Proteine generiert, um den Einfluss der Lipidierung auf die Immunreaktion beurteilen zu können. Zur Untersuchung der Reaktion des menschlichen Immunsystems wurden humane Blut-Monozyten (hPBMCs) isoliert und zu pro-inflammatorischen Makrophagen (M1) einerseits und anti-inflammatorischen Makrophagen (M2a) andererseits differenziert. Die Zellen wurden mit den lipidierten bzw. nicht-lipidierten Proteinen stimuliert. In den Überständen wurden zur Beurteilung der abgelaufenen Immunreaktion die Konzentrationen von IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8 und TNF bestimmt. Eine Produktion von IL-1β und IL-2 durch die Makrophagen konnte hierbei nicht nachgewiesen werden. M1 Makrophagen zeichneten sich durch eine kaum messbare Cytokin-Produktion auf beide Proteinstimuli aus. Anti-inflammatorische Makrophagen zeigten eine signifikant verstärkte IL-6, IL-8 und TNF Produktion (p< 0,05) nach Stimulation mit allen vier lipidierten Proteinen im Gegensatz zur Stimulation mit nicht-lipidierten Proteinen. Das stärkere Stimulationspotenzial der lipidierten Proteine konnte auf deren Agonismus am TLR2 zurückgeführt werden. Weiterhin konnte die starke Reaktion der M2a Makrophagen mit deren Plastizität sowie mit dem Potenzial von Lipoproteinen zur Umpolarisation von Makrophagen aufgrund des TLR2 Agonismus erklärt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die eingesetzten lipidierten Proteine einen suffizienten und signifikant potenteren Immunstimulus im menschlichen Organismus darstellen, als die gleichen Proteine in nicht-lipidierter Form. Somit könnten diese lipidierten Proteine geeignete Vakzinkandidaten gegen S. pneumoniae darstellen.
Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind Gram-positive und Katalase-negative humanspezifische Kommensalen der oberen und unteren Atemwege. Diese Bakterien sind andererseits auch als schwere Krankheitserreger bekannt und verursachen bei verschiedenen Bevölkerungsgruppen, wie beispielsweise Kindern, Älteren und immungeschwächten Personen sowohl Atemwegs- als auch lebensbedrohliche invasive Erkrankungen wie eine ambulant erworbene Pneumonie, Meningitis und Sepsis. Pneumokokken haben aufgrund ihrer Besiedelung des Respirationstraktes effiziente Mechanismen entwickelt, um in einer sauerstoffreichen Nische überleben zu können. Dabei richten sich die Mechanismen vor allem gegen reaktive Sauerstoffspezies (Reactive Oxygen Spezies, ROS), die einerseits als Abwehrfunktion des Wirts (oxidative burst) vom angeborenen Immunsystem und andererseits von den Pneumokokken selbst produziert werden, um als chemische Waffe zur Bekämpfung bakterieller Konkurrenten in ihrem Habitat eingesetzt zu werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein hochkonserviertes Zwei-Operon-System, das für die extrazelluläre oxidative Stress-Resistenz in S. pneumoniae verantwortlich ist, identifiziert und auf pathophysiologischer sowie struktureller Ebene charakterisiert. Dieses komplexe System besteht aus zwei integralen Cytochrom C-ähnlichen Membranproteinen (CcdA1 und CcdA2), zwei Thioredoxin-ähnlichen Lipoproteinen (Etrx1 und Etrx2) und einer Methioninsulfoxid-Reduktase AB2 (MsrAB2). Die Etrx-Proteine werden zwar in zwei räumlich voneinander getrennten Operonen kodiert, sind aber funktionell miteinander verbunden. Der Einfluss des Systems auf die Pathogenese der Pneumokokken wurde in Maus-Virulenz-Studien und Untersuchungen der Phagozytose unter Verwendung von isogenen Mutanten gezeigt. Sowohl in den in vivo als auch den in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass der Verlust der Funktion beider Etrx-Proteine beziehungsweise der Methioninsulfoxid-Reduktase MsrAB2 die Virulenz der Pneumokokken stark reduziert. Hieraus resultierte eine erheblich verringerte Letalität des Wirts, eine beschleunigte bakterielle Aufnahme durch die Makrophagen sowie ein schnelleres Abtöten der Pneumokokken durch eine oxidative Schädigung von Oberflächen-lokalisierten Proteinen mittels Wasserstoffperoxid. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Etrx2 die Abwesenheit von Etrx1 und umgekehrt Etrx1 das Defizit von Etrx2 kompensieren kann. Durch Strukturaufklärung der beiden Thioredoxin-ähnlichen Proteine Etrx1 und Etrx2 sowie der Modellierung der beteiligten Komponenten CcdA und MsrAB2 konnte die Rolle jedes einzelnen Proteins dieses Systems (CcdA-Etrx-MsrAB2-System) bei der Reparatur beschädigter Oberflächen-lokalisierter Proteine in einem Modell dargestellt werden. Das postulierte Modell konnte über in vivo und in vitro Untersuchungen des Elektronentransfers innerhalb dieses Systems bestätigt werden. Mit der Bestimmung der Standardredoxpotentiale der rekombinanten Proteine Etrx1, Etrx2 und der Einzeldomänen MsrA2 und MsrB2 konnte in vitro gezeigt werden, dass der Elektronenfluss in Richtung von Etrx1 und Etrx2 zu MsrAB2 erfolgen muss. Die direkte Elektronenübertragung zwischen diesen Proteinen konnte in kinetischen Experimenten gezeigt werden. Die Messungen ergaben, dass Etrx1 bevorzugt mit der MsrA2-Untereinheit interagiert beziehungsweise Etrx2 sowohl mit der MsrA2-Untereinheit als auch mit der MsrB2-Untereinheit in Wechselwirkung treten kann. Der in vivo Redoxzustand von MsrAB2 wurde unter Verwendung der nicht-reduzierenden/reduzierenden „2D-Diagonal“-SDS-PAGE in den isogenen ccdA- und etrx-Mutanten bestimmt. Hierbei konnte ein Unterschied im Redoxzustand von MsrAB2 in den isogenen Einzelmutanten und Doppelmutanten von ccdA und etrx beobachtet werden. Während in den Einzelmutanten der Elektronenfluss innerhalb des CcdA-Etrx-MsrAB2-Systems unverändert war, zeigte sich in den Doppelmutanten ccdA1/ccdA2 und etrx1/etrx2 eine deutliche Beeinträchtigung der Elektronenübertragung auf MsrAB2, welche sich in der Zunahme der oxidierten Form von MsrAB2 deutlich machte. Somit konnte der Elektronenfluss von sowohl von CcdA1 über Etrx1 zu MsrAB2 als auch von CcdA2 über Etrx2 zu MsrAB2 in vivo betätigt werden. In Anbetracht der Ergebnisse dieser Arbeit könnte das hochkonservierte CcdA-Etrx-MsrAB2-System der extrazellulären oxidativen Stress-Resistenz von S. pneumoniae zur Entwicklung proteinbasierter Pneumokokken-Impfstoffe und zum Angriffspunkt für Behandlungen gegen diese wichtigen humanpathogenen Erreger beitragen.